全 文 ：超声波辅助提取金橘柠檬苦素工艺研究
黎继烈 张 慧 曾超珍 李忠海
（中南林业科技大学 湖南 长沙 410004）
摘要 目的：研究金橘柠檬苦素提取工艺条件。 方法：以金橘为原料，采用二次回归通用旋转组合试验设计，探
讨超声波辅助提取金橘柠檬苦素的最佳工艺参数。 结果：确定最优超声波处理时间 20 min，处理功率 440 W，浸
提温度 60 ℃，液料比 30∶1，浸提 60 min，柠檬苦素超声波辅助萃取得率达（3.26±0.03）‰，RSD = 0.86%（n=5）。 结
论：试验中所选参试因子对超声波辅助萃取金橘柠檬苦素效率影响显著，其影响次序为超声波处理时间>超声
波处理功率>浸提温度>液料比。
关键词 金橘 柠檬苦素 超声波 二次通用旋转组合实验设计
文章编号 1009-7848（2009）04-0096-07
柠檬苦素类化合物是一类具有特殊结构和功
能的植物次生物质，是三萜的降四碳产物，主要存
在于芸香料和楝科植物中， 其代表物是柠檬苦素
和诺米林。 由于柠檬苦素具有明显的昆虫拒食活
性与昆虫不育[1]、抗菌[2]、抗病毒[3]和抗癌[4～5]等作用，
其提取工艺和药用功能开发已成为当今植物药物
研究的热点。目前，对于柠檬苦素类化合物的提取
分离研究主要集中在楝科及芸香科枳属或柑橘属
植物[6～7]。 由于柠檬苦素类物质在植物中的含量不
高， 要将其工业化应用需要大量的植物资源来满
足原料的供应，因此存在资源不足的问题，需要不
断开发新的原料。 金橘系芸香科（Rutacea）柑橘属
（Citrus）常绿小乔木，果实富含柠檬苦素等生物活
性成分，具有多种药用保健功效[8]。 金橘果实除鲜
食外还广泛应用于果脯、饮料、中草药的生产[9]，但
总体上对于金橘的研究与开发仍集中在单纯的粗
加工利用方面。近年来，从深度开发金橘资源的角
度出发， 对其活性物质的提取与保健功能进行了
研究[10～12]。本文在此基础上深入研究优化超声波提
取金橘柠檬苦素的工艺， 为该类物质的提取与利
用提供参考数据。
1 材料与方法
1.1 材料
金橘：采于湖南浏阳。
试剂 ： 柠檬苦素标样 （Limonin， Lot No.
5313H）法国 MP Biomedicals 公司；丙酮、石油醚、
二氯甲烷、甲醇、香草醛和硫酸等均为国产分析纯
试剂。
1.2 仪器
DLSB-5/10 低温冷却液循环泵， 郑州长城科
工贸有限公司；VCX500 超声波细胞粉碎仪，美国
SONICE & MATERIALS 公司；R201D-Ⅱ旋转蒸
发器，郑州长城科工贸有限公司；UV-1700 紫外分
光光度计，日本岛津公司；WFJ7200 可见光分光光
度计，尤尼卡（上海）仪器有限公司
1.3 试验方法
1.3.1 金橘柠檬苦素的测定
1.3.1.1 测定波长的选择 称取柠檬苦素标样溶
于二氯甲烷溶液，取 1.4 mL于试管中，加入 0.4 mL
0.02 g/mL香草醛乙醇溶液，振荡混匀，静置 2 min，
加入浓硫酸 0.6 mL，迅速振荡 10 s[13]，加入 2.5 mL
甲醇溶液，混匀显色，静置 10 min，在 300～700 nm
处进行吸收光谱扫描，观察最大吸收峰的波长。同
时将金橘提取液稀释，用上述显色方法显色，在同
样波长范围内扫描。 柠檬苦素标样及金橘提取液
显色后产生的物质的最大吸收波长均为 547 nm，
故选 547 nm为测定波长。
收稿日期： 2008-08-26
基金项目： 国家“十五”科技攻关专题（No. 2001BA535C）
作者简介： 黎继烈，女，1959 年出生，博士，教授
Vol． 9 No． 4
Aug． 2 0 0 9Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 9 卷 第 4 期
2 0 0 9 年 8 月
DOI:10.16429/j.1009-7848.2009.04.005
第 9 卷 第 4 期
1.3.1.2 标准曲线制作 精确称取柠檬苦素标准
品 10 mg（精确到 0.00001 g），用二氯甲烷溶解并
定容 50 mL， 得质量浓度为 0.2 mg/mL 的标准溶
液。 分别取柠檬苦素标准溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、
5.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用二氯甲烷定容，得到
质量浓度分别为 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/
mL。 按上述方法显色，在 547 nm波长处测定吸光
度。 通过 Excel软件建立标准曲线，用最小二乘法
作线性回归， 得柠檬苦素浓度 y 与吸光度值 x 的
标准曲线回归方程为：y = 5.71x-0.054， 相关系数
R2 = 0.9975。
1.3.1.3 柠檬苦素提取得率的计算 将金橘柠檬
苦素提取液定容到 50 mL，按照上述显色方法，在
选定的测定波长下测吸光度， 并通过标准曲线计
算提取液中柠檬苦素浓度。 计算金橘柠檬苦素得
率公式为：
金橘柠檬苦素得率（‰）＝ c×50m×1 000 ×10 000‰
式中：c——提取液中柠檬苦素质量浓度（mg/
mL）；m——金橘粉质量（g）。
1.3.2 金橘提取操作 称取 25 g 金橘粉于滤纸
筒中，加入 200 mL 石油醚，索氏抽提 7 h，自然风
干溶剂，粉碎，过 40 目筛，得脱脂金橘粉。 称取脱
脂金橘粉 15 g 于大烧杯中， 设定超声波处理条
件，冰浴中处理。处理后，用保鲜膜将烧杯密封，浸
提 60 min。 浸提后抽滤，用少量丙酮清洗烧杯，清
洗液一并过滤，滤液浓缩至干，用约 40 mL 二氯甲
烷溶解烧瓶中的残余物，过滤后定容 50 mL，得待
测提取液。
1.3.3 四元二次通用旋转组合试验设计 金橘中
柠檬苦素的超声提取受到多种因素的影响。 通过
对丙酮浓度、超声波处理时间、超声波处理功率、
提取温度、浸提时间、液料比、pH 值的单因素试验
及其它试验条件的综合考察， 本试验中选择超声
波处理时间（X1）、超声波处理功率（X2）、浸提时间
（X3）、液料比（X4）为参试因子，各因子与水平列于
表 1。
编码
（Xi）
超声波处理时间/min
（X1）
处理功率/W
（X2）
浸提温度/℃
（X3）
液料比（V·m-1）
（X4）
+2 30 500 70 30
+1 25 400 60 25
0 20 300 50 20
-1 15 200 40 15
-2 10 100 30 10
表 1 各因素水平编码表
Table 1 Coding table of each factor and level
1.4 数据处理方法
对试验所得数据， 采用 SPSS 11.5 统计分析
软件进行回归分析， 并对回归模型及其各项的显
著性进行检验，去除非显著项，确定简化回归模型
方程。同时对试验中各参试因子进行方差分析，利
用 Statistica 6.0 软件绘出 3D 曲面图，分析各参试
因子对金橘柠檬苦素提取效果的影响。
2 结果与分析
2.1 四元二次通用旋转组合试验结果
各处理组金橘柠檬苦素得率试验结果如表 2
所示。
对表 2 中的数据进行回归分析， 检验回归模
型拟合度及其显著性， 同时对回归模型方程中各
项进行方差分析，所得结果列于表 3。
超声波辅助提取金橘柠檬苦素工艺研究 97
中 国 食 品 学 报 2009 年第 4 期
处理号
超声波处理时间/min
（X1）
处理功率/W
（X2）
浸提温度/℃
（X3）
液料比（V·m-1）
（X4）
柠檬苦素得率±SD/‰
（Y）
1 1 1 1 1 3.152 ± 0.139
2 1 1 1 -1 3.001 ± 0.005
3 1 1 -1 1 3.036 ± 0.007
4 1 1 -1 -1 2.499 ± 0.043
5 1 -1 1 1 2.487 ± 0.019
6 1 -1 1 -1 2.242 ± 0.064
7 1 -1 -1 1 2.504 ± 0.013
8 1 -1 -1 -1 2.405 ± 0.001
9 -1 1 1 1 3.182 ± 0.033
10 -1 1 1 -1 2.814 ± 0.030
11 -1 1 -1 1 2.358 ± 0.004
12 -1 1 -1 -1 2.195 ± 0.010
13 -1 -1 1 1 2.574 ± 0.235
14 -1 -1 1 -1 2.504 ± 0.004
15 -1 -1 -1 1 1.862 ± 0.026
16 -1 -1 -1 -1 1.757 ± 0.052
17 2 0 0 0 2.393 ± 0.003
18 -2 0 0 0 1.547 ± 0.004
19 0 2 0 0 2.820 ± 0.009
20 0 -2 0 0 1.915 ± 0.036
21 0 0 2 0 2.574 ± 0.122
22 0 0 -2 0 2.072 ± 0.003
23 0 0 0 2 2.790 ± 0.016
24 0 0 0 -2 2.639 ± 0.030
25 0 0 0 0 2.849 ± 0.008
26 0 0 0 0 2.843 ± 0.012
27 0 0 0 0 2.855 ± 0.003
28 0 0 0 0 2.802 ± 0.010
29 0 0 0 0 2.843 ± 0.008
30 0 0 0 0 2.820 ± 0.007
31 0 0 0 0 2.814 ± 0.021
表 2 四元二次回归通用旋转组合试验结果
Table 2 The results of rotational combination design experiment
检验项 复相关系数 R 显著性 Pr＞F
数值 0.9215 <0.001
表 3 回归模型回归分析结果
Table 3 The result of regression analysis for regressive model
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第 9 卷 第 4 期
本试验所得回归模型拟合度较好， 回归模型
R2=92.15%，说明回归模型较好地拟合了各参试因
子与柠檬苦素超声波提取得率之间的关系， 模型
所得结果较可靠。 回归模型方程的显著性 Pr＞F=
0.000<0.001，达到极显著水平。
变量
非标准化系数
T 检验 显著性 Pr＞F
系数 B 标准偏差
常数 2.83229 0.059 47.730 < 0.001**
X1 0.15717 0.032 4.904 < 0.001**
X2 0.23800 0.032 7.427 < 0.001**
X3 0.18100 0.032 5.648 < 0.001**
X4 0.08500 0.032 2.652 0.017*
X1X2 0.01238 0.039 0.315 0.757ns
X1X3 -0.15400 0.039 -3.924 0.001**
X1X4 0.02038 0.039 0.519 0.611ns
X2X3 0.04887 0.039 1.245 0.231ns
X2X4 0.04375 0.039 1.115 0.281ns
X3X4 -0.00438 0.039 -0.111 0.913ns
X12 -0.18357 0.029 -6.253 < 0.001**
X22 -0.08420 0.029 -2.868 0.011*
X32 -0.09532 0.029 -3.247 0.005**
X42 0.00255 0.029 0.087 0.932ns
表 4 回归模型各多项式方差分析
Table 4 The variance analysis of each polynomial for regressive model
注：** 表示极显著，* 表示显著，ns 表示不显著。
将表 4 中数据经 SPSS 统计软件线性回归分
析，剔除不显著项，得到以柠檬苦素得率为目标函
数的二次回归数学模型：
Y = 2.83229 + 0.25717X1 - 0.23800X2 + 0.181
00X3 + 0.08500X4 - 0.15400X1X3 - 0.18357X12 -
0.08420X22 - 0.09532X32
2.2 超声波提取各因子及其交互作用的影响
2.2.1 超声波提取各因子影响显著性 对试验所
得数据进行方差分析， 检验各参试因子的影响显
著性及其之间是否存在交互作用， 分析结果列于
表 5。
来源 自由度 df 平方和 F 显著性 Pr＞F
校正模型 24 0.209 517.247 < 0.0001
X1 3 0.595 1 470.585 < 0.0001
X2 3 0.566 1 398.313 < 0.0001
X3 3 0.409 1 010.695 < 0.0001
X4 3 0.074 182.722 < 0.0001
表 5 各因子方差分析
Table 5 The variance analysis of each factor
表 5 表明，试验中各参试因子对得率的影响
均达到极显著水平， 影响显著性次序为超声波处
理时间>超声波处理功率>浸提温度>液料比。模型
总效应的 F ＝ 517.247， 显著性 Pr＞F ＝ 0.0000<
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中 国 食 品 学 报 2009 年第 4 期
0.0001，说明各参试因子之间存在交互作用。
2.2.2 超声波提取各因子交互作用曲面响应模型
经方差分析可知各因子间有交互作用，所以固
定超声波处理时间、处理功率、浸提温度、液料比
4 个因子中的 2 个因子于零水平编码， 代入简化
回归模型方程， 考察其它 2 个因子对金橘柠檬苦
素超声波提取效率的影响，绘出 3D 曲面图，如图
1~图 6所示。
100
第 9 卷 第 4 期
由图 1~6可知，在超声波处理时间－0.50～1.75
（17.50～27.50 min）， 超声波处理功率 0.80～2.00
（380.00～500.00 W），浸提温度 0.50～1.50（55.00～
65.00 ℃），液料比 1.00～2.00〔（25∶1～30∶1）〕水平范
围内，有利于柠檬苦超声波提取，得率可在 3.00‰
以上。各参试因子对提取效率均有影响，其中超声
波处理时间与处理功率的影响最为显著。
2.3 响应因子的水平优化[14]
从图 1~图 6 可知， 响应值有最大值，X1、X2、
X3、X4存在极值点，所以对模型进行响应因子的水
平优化分析，得到 4 个因素的最优试验点（X1，X2，
X3，X4）的代码值 （0.045，-1.413，-0.913，-2.000），
即（20.23，441.33，59.12，30∶1），此时最大响应值是
3.257‰。 鉴于试验中所用仪器参数设定的局限
性， 选择超声波处理时间 20 min， 处理功率 440
W，浸提温度 60℃，液料比 30∶1，浸提 60 min 为最
优提取条件。
为检验模型预测的准确性， 以超声波处理时
间 20 min，处理功率 440 W，浸提温度 60 ℃，液料
比 30∶1，浸提 60 min 为萃取条件，做超声波提取
最优工艺的验证试验。 重复 5 次， 验证试验值为
（3.262 ± 0.03）‰，RSD = 0.86%（n = 5）。 与提取理
论得率基本一致， 由此表明试验中所设模型与实
际情况相符，回归模型可靠。
3 结论
通过四元二次回归通用旋转组合设计， 系统
地研究了金橘柠檬苦素超声波提取工艺， 得出以
下结论：
（1）对回归模型进行回归分析及方差分析，除
去非显著项，得到简化回归模型方程为：
Y = 2.83229 + 0.25717X1 - 0.23800X2 +
0.181 00X3 + 0.08500X4 - 0.15400X1X3 -0.18357X12
- 0.08420X22 - 0.09532X32
（2）在试验范围内，4 个参试因子对柠檬苦素
超声波提取效率影响均达到极显著水平， 其显著
性次序为超声波处理时间>超声波处理功率>浸提
温度>液料比。
（3）确定超声波处理时间 20 min，超声波处理
功率 440 W，浸提温度 60℃，液料比 30∶1，浸提 60
min为最优提取条件。 验证试验表明，在此条件下
提取， 金橘柠檬苦素得率达到 （3.26 ± 0.03）‰，
RSD = 0.86%（n=5）。 该工艺精确性好。
（4）由于超声波可在瞬间升高溶剂的温度，而
高温导致提取溶剂的损失，对于一些热敏性材料，
可能会破坏其活性成分的结构或生理活性。 在提
取时，应注意提取容器的密闭性及控制提取温度。
本试验中采用保鲜膜密封，保证了密闭性，并且在
冰浴中进行超声波处理， 确保活性成分不受高温
超声波辅助提取金橘柠檬苦素工艺研究 101
中 国 食 品 学 报 2009 年第 4 期
破坏，可有效改善超声波提取方法的不足。超声波
提取法作为一种高效、快速的提取方法，可应用于
金橘柠檬苦素类化合物的提取。
参 考 文 献
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Study on Ultrasonic Extraction Technology of Limonin from the Kumquat
Li Jilie Zhang Hui Zeng Chaozhen Li Zhonghai
（Central South University Forestry & Technology， Changsha 410004）
Abstract In order to study the extraction technology condition of limonin which come from kumquat by ultrasonic
wave extraction， the reduced regression equation of extraction process was determined through the quadratic regression
general rotation combination design with four factors. All the tested factors affected the yield significantly， with the order
as ultrasonic treatment time>ultrasonic treatment power > soaking temperature > ratio of solvents and material. Predicting the
model through the Aprogram solution of Excel， and according to practical situation， the optimal process conditions for
Ultrasonic Extraction were as follows： ultrasonic treatment time 20 min， ultrasonic treatment power 440 W， soaking tem-
perature 60 ℃， ratio of material and solvents 30∶1， and soaking time 60 min. The yield of kumquat limonin was （3.26±
0.03）‰， RSD = 0.86%（n = 5）.
Key words Kumquat Limonin Ultrasonic The quadratic general rotation combination design
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