全 文 ：花榈木胚轴愈伤组织的诱导及植株再生
高 丽 ,李洪林 ,杨波＊　(中国科学院武汉植物园 ,湖北武汉 430074)
摘要　[目的 ]通过愈伤组织诱导途径 ,建立快速高效的花榈木再生体系。 [方法]花榈木成熟种子在 MS培养基中萌发获得无菌苗 ,以
幼苗的胚轴为外植体诱导愈伤组织 ,经继代后进一步诱导不定芽和生根。 [结果 ]诱导花榈木愈伤组织的最适培养基为MS+ 1.0mg/L
2, 4-D+0.5mg/LKT,诱导率达 96.7%;诱导愈伤组织分化不定芽的培养基为 MS+0.5mg/LNAA+0.1mg/LTDZ,其不定芽诱导率为
85.0%;平均每块愈伤产生不定芽 6.2个;生根的最适培养基为 1/2WPM+0.5mg/LNAA+0.5mg/LIBA,生根率为 88.9%。炼苗移栽
后 ,成活率可达 85.0%。 [结论]花榈木胚轴愈伤组织诱导途径的植株再生是一套快速高效的离体再生体系 ,可为花榈木种质资源保存、
转基因、遗传育种等研究提供重要参考。
关键词　愈伤组织;胚轴;花榈木;植株再生
中图分类号　S722.3+1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)33-16271-03
CalusInductionandPlantRegenerationfromtheHypocotylofOrmosiahenryiPrain
GAOLietal　(WuhanBotanicGarden, ChineseAcademyofSciences, Wuhan, Hubei430074)
Abstract　[ Objective] ArapidandeficientregenerationsystemofOrmosiahenryiPrainwasestablishedbytheapproachofcalusinduction.
[ Method] MatureseedsofO.henryisproutedonMSmedium, calluswasinducedwiththehypocotylasexplants.Aftertwosubcultures, shoots
androotswereinduced.[ Result] Thebestresultswereachievedonthefolowingmedia:96.7%calusinductiononMSmediumsupplemented
with1.0 mg/L2, 4-Dand0.5mg/LKT;85.0%shootinductiononMSmediumsupplementedwith0.5mg/LNAAand0.1mg/LTDZ, and
themeannumberofbudsperpieceofcalluswas6.2;88.9%rootingon1/2WPMmediumsupplementedwith0.5mg/LNAAand0.5mg/L
IBA.Thesurvivalrateoftheplantletswas85.0%afterbeingtransplantedintosoil.[ Conclusion] CalusInductionandPlantRegeneration
fromthehypocotylofO.henryiwasafastandefficientinvitroregenerationsystem, itwilhasimportanttheoreticalvalueandrealisticsignifi-
canceforreserveofgermplasmresource, studiesontransgenicengineeringandgeneticsbreeding.
Keywords　Calus;Hypocotyl;OrmosiahenryiPrain;Plantregeneration
　　花榈木(OrmosiahenryiPrain)为豆科红豆树属植物 ,又
名花梨木 、臭桶柴 、亨氏红豆 、红豆树 ,属国家二级重点保护
树种。花榈木集材用 、药用 、观赏 、生态价值于一身 。其木材
质地致密 ,纹理均匀 ,是制作高档家具(红木家具)、工艺品及
高级地板等的重要原材料;其根 、枝 、叶入药 ,能祛风散结 、解
毒去瘀 ,也是一种重要的药用植物;其树姿态优美 ,枝繁叶
茂 ,四季翠绿 ,树干光洁 ,亦是优良的园林绿化树种;其根部
具有能固氮的根瘤菌 ,可以改良土壤 ,促进与之混交的其他
树种的生长 ,具有很好的生态价值。
由于花榈木用途广泛 ,其原生境已遭受严重破坏 ,野生
资源日益减少 ,处于濒危状态。目前花榈木生产上大都采用
种子繁殖 ,但其自然繁殖率低 ,而采用离体快速繁殖技术进
行种苗的大量生产无疑是一项实用和富有成效的方法 。该
研究以花榈木无菌苗胚轴为外植体进行愈伤组织 、不定芽诱
导以及植株再生培养 ,建立了快速 、高效的花榈木离体快繁
再生体系 ,以保护野生资源 ,实现工厂化育苗 ,发挥花榈木材
用 、药用和园林绿化等优良特性 ,为满足市场需求奠定技术
基础 ,另外也为花榈木种质资源保存 、转基因 、遗传育种等研
究提供重要参考 。
1　材料与方法
1.1　材料　花榈木(OrmosiahenryiPrain)成熟种子 ,采自中
国科学院武汉植物园内。
1.2　培养基与培养条件　以 MS[ 1] 、1/2MS(大量元素用量减
半)、1/2WPM[ 2]培养基为基本培养基 ,以不同的激素浓度组
合设计了 4种愈伤组织诱导培养基 M1、M2、M3和 M4, 1种
愈伤组织增殖继代培养基 M5, 3种不定芽诱导培养基 M6、
M7和 M8, 3种生根培养基 M9、M10和 M11(表 1)。所有培
养基均添加 6 g/L琼脂 、30 g/L蔗糖 ,在灭菌前将 pH值调为
5.8,培养温度为(24±2)℃,连续光照 12h/d,光照强度为 40
μmol/(m2·s)。
表 1　各培养基组成
Table1　Thecompositionofdifferentmedia
培养基
Media
组成
Composition
培养基
Media
组成
Composition
M1 MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L M7 MS+NAA0.5mg/L+KT1.5mg/L
M2 MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L M8 MS+NAA0.5mg/L+TDZ0.1mg/L
M3 MS+2, 4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L M9 1/2WPM+NAA0.5mg/L
M4 MS+2, 4-D1.0mg/L+KT0.5mg/L M10 1/2WPM+IBA0.5mg/L
M5 1/2MS+2, 4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L M11 1/2WPM+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L
M6 MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L
基金项目　中国科学院知识创新工程重要方向性项目(KSCX2-YW-N-
032)。
作者简介　高丽(1979-), 女 ,河南南阳人 ,硕士 ,助理研究员 , 从事植
物生物技术研究。 ＊通讯作者 , E-mail:yangbo@wbgcas.cn。
收稿日期　 2009-07-27
1.3　方法
1.3.1　愈伤组织的诱导 。将花榈木种子用自来水冲洗干
净 ,剥去种皮后置超净工作台上用浓度 70%乙醇处理 30 s,
再以浓度 0.1%HgCl2溶液中浸泡 6 min,最后用无菌水冲洗
4次 ,接种于 MS培养基上。接种后于(24±2)℃暗培养 5 d
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(33):16271-16273 责任编辑　张彩丽　责任校对　况玲玲
左右 ,取萌发无菌苗的胚轴切成 5 mm左右的小段接种于愈
伤组织诱导培养基中。每种处理接种 30个外植体 , 3次重
复 , 20 d后统计愈伤组织的诱导率。将获得的愈伤组织转入
增殖继代培养基 M5中进行 2次继代培养后进行不定芽和根
的诱导。
1.3.2　不定芽的诱导及植株再生。选取颜色浅绿 、生长旺
盛的愈伤组织转入不定芽诱导培养基中 。每种处理接种 20
块愈伤组织 ,设置 3次重复 ,培养 35 d时分别统计不定芽的
诱导率和平均芽数。当不定芽长至 2 ～ 3 cm时 ,选取生长健
壮的不定芽接种于生根培养基中诱导生根 。每种处理接种
12个不定芽 ,设置 3次重复 ,培养 30 d时分别统计生根率 、
平均根数和平均根长。
1.3.3　炼苗移栽。当试管苗形成健壮根系后 ,通过先闭瓶 3
～4 d再开瓶 2 ～3 d的方式在自然光下进行炼苗。然后将组
培苗从瓶中取出洗净根部附着的培养基后移栽入河沙∶田园
土∶泥炭 =1∶2∶1的基质中 , 35 d后统计移栽成活率。
2　结果与分析
2.1　愈伤组织诱导　外植体接种在 4种愈伤组织诱导培养
基中 3d左右在切口处都会膨大 , 7 d后即有质地疏松 、白色
的愈伤组织形成 , 20 d后 4种培养基中外植体的出愈率 、愈
伤组织的生长情况和颜色已有明显差异(表 2)。其中以培
养基 M4诱导愈伤组织的效果最好 ,诱导率为 96.7%,愈伤
组织的生长情况也最好 ,呈淡绿色 ,有光泽 ,且在 M4培养基
中外植体的出愈时间也比在其他处理中早 1 ～ 2 d(图 1a)。
其次为 M3,其愈伤组织诱导率为 87.8%。M1培养基中 ,愈
伤组织诱导率为 78.9%,愈伤组织呈黄绿色 ,无光泽 ,生长较
好。而在 M2培养基中 ,愈伤组织的诱导率仅为 61.1%,且
愈伤组织在培养一段时间后就逐渐褐化 。
2.2　不定芽的诱导及植株再生　将获得的愈伤组织转入
M5增殖培养基上进行继代培养 ,每 20d继代 1次 ,继代 2次
表 2　不同培养基对花榈木愈伤组织诱导的影响
Table2　EffectsofdiferentmediaoncalusinductionofO.henryi
培养基
Medium
接种外植体数
No.ofinoculatedexplants
形成愈伤组织数
Numberofformedcalus
诱导率∥%
Inductionfrequencyofcalus
颜色
Color
生长情况
Growthstatus
M1 90 71 78.9 黄绿色,无光泽 ++
M2 90 55 61.1 黄褐色,无光泽 +
M3 90 79 87.8 浅绿色,有光泽 +++
M4 90 87 96.7 浅绿色,有光泽 ++++
　注:+,生长一般;++,生长较好;+++,生长好;++++,生长最好。
　Note:+,generalygrowth;++, goodgrowth;+++,betergrowth;++++, thebestgrowth.
注:a,胚轴诱导愈伤组织形成;b,愈伤组织分化不定芽;c,不定芽生根;d,试管苗移栽成活
Note:a.Calusinducedbyhypocotyls;b.Adventitiousbudsdiferentiationfromcallus;c.Rootingofshoot;d.Transplantationoftest-tubeseedlings.
图 1　花榈木的植株再生
Fig.1　PlantletregenerationofOrmosiahenryiPrain
后挑选生长旺盛的愈伤组织转入不定芽诱导培养基 M6、M7、
M8中进行培养 ,诱导愈伤组织的分化。接种 2周后愈伤组
织颜色加深 ,表面变粗糙 , 20d后长出许多小突起 ,最初为一
小绿点 ,进而长成小芽点 ,再生长成不定芽 ,有单生 ,多为丛
生 。35d后统计不定芽的诱导情况 ,结果表明 , 3种培养基对
不定芽的诱导有明显差异(表 3)。其中以培养基 M8对不定
芽的诱导效果最佳 , 35 d时诱导率可达 85.0%,每块愈伤诱
导出的平均芽数为 6.2(图 1b)。其次为 M6,诱导率为
71.7%。M7诱导不定芽的效果最差 ,诱导率仅为 58.3%,且
不定芽生长缓慢 ,有少许黄化。
表 3　不同培养基对花榈木不定芽诱导的影响
Table3　EffectsofdifferentmediaonadventitiousbudinductionofO.henryi
培养基
Medium
接种愈伤组织数
Numberofinoculatedcalus
出芽愈伤组织数
Numberofcalusproducingshoot
不定芽诱导率∥%
Inductionfrequencyofshoots
平均每个愈伤组织芽数
Numberofshootspercalus
M6 60 43 71.7 5.4M7 60 35 58.3 4.7
M8 60 51 85.0 6.2
　　将培养基 M8中诱导的不定芽从基部切下转入生根培养
基 M9、M10、M11中进行不定根的诱导。在接种初期不同培
养基中生根率无明显差异 ,随着时间的推移 ,生根情况呈现
明显差异。表 4表明 ,培养基 M10诱导不定根的效果最好 ,
生根率达 88.9%,平均根数 2.4,平均根长 1.8 cm,且根系粗
壮(图 1c)。而在培养基 M9中生根率只有 75.0%,且根系
细弱。
2.3　炼苗移栽　生根培养 30 d后 ,将培养瓶移至室温 、自然
16272 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
光下先闭瓶炼苗 3 ～ 4d,然后在相同条件下再开瓶炼苗 2 ～ 3
d。移栽时将组培苗从瓶中小心取出 ,清洗干净根部附着的
培养基后栽入河沙∶田园土∶泥炭 =1∶2∶1的营养钵中 ,注意
保持相对湿度在 90%左右 ,温度以 20 ～ 25℃为宜 ,以 50% ～
70%遮阴为好 ,置于阴凉通风处 , 35 d后移栽成活率可达
85.0%(图 1d)。
表 4　不同培养基对花榈木生根培养的影响
Table4　EfectsofdiferentmediaonrootingcultureofO.henryi
培养基
Medium
接种不定芽数
Numberofinoculatedadventitiousbud
生根不定芽数
Numberofrootedadventitiousbuds
生根率∥%
Rootingrate
每个外植体的平均根数
Averagerootnumberperexplant
平均根长∥cm
Averagelengthofroots
M9 36 27 75.0 1.9 1.4
M10 36 28 77.8 2.1 1.5
M11 36 32 88.9 2.4 1.8
3　结论与讨论
植物愈伤组织诱导是培养的细胞脱分化和再分化的过
程 ,也是细胞基因组 DNA甲基化和各种特定基因的重新激
活和表达的过程 ,它涉及到核酸合成和降解的平衡 、DNA的
复制和转录 、特定基因控制下特定蛋白的形成等 ,这个过程
中起主要作用的就是生长素和细胞分裂素的配比 [ 3] 。由于
植物组织或细胞在离体培养条件下往往缺乏合成生长素和
细胞分裂素的能力 ,为了细胞生长 、分化和分裂 ,在多数情况
下需要生长素和细胞分裂素 2种生长调节剂的共同作用 [ 4] 。
该研究结果表明 ,生长素 NAA、2, 4-D和细胞分裂素 6-BA、
KT组合均可诱导愈伤组织的形成 ,但各组合对愈伤组织的
诱导效果有差异 。总的来说 , 2, 4-D的诱导效果好于 NAA,
KT的诱导效果好于 6-BA,经过反复试验筛选 ,最终确定 MS
+2, 4-D1.0mg/L+KT0.5 mg/L为花榈木胚轴愈伤组织诱
导的最佳培养基。
植物生长调节剂对植物离体培养具有非常重要的调控
作用 ,选择合适的生长调节剂种类和浓度是愈伤组织诱导和
生长的关键因素 [ 5] 。 2, 4-D对于愈伤组织的诱导和生长非常
有效 ,但 2, 4-D对器官发生有强烈的抑制作用 ,不利于根和
芽的启动和分化 [ 6] 。因此在继代愈伤组织时要降低 2, 4-D
的浓度 ,避免过量 2, 4-D积累产生毒害效应 ,抑制愈伤组织
的器官发生。
在植物形态建成过程中 ,起主要作用的是培养基中植物
生长调节剂组合的配比 ,细胞分裂素和生长素在外植体离体
培养中的作用是影响植物特定基因的激活与表达 ,从而调节
特定蛋白质的合成 ,使整个细胞的分裂及分化过程受到影
响 [ 7] 。培养基中加入生长调节物质可以改变和影响外植体
的内源激素水平 ,从而导致外植体在附加不同植物生长调节
剂的培养基中进行离体培养时 ,不定芽的诱导率差异很大 。
该研究结果表明 , 3种细胞分裂素 6-BA、KT、TDZ分别和
NAA组合使用均可诱导愈伤组织分化不定芽 ,其中以 TDZ
的诱导效果最好 ,说明适量的 TDZ有利于愈伤组织的再分
化 。TDZ是一种苯基脲衍生物 ,具腺嘌呤类细胞分裂素的生
物活性 ,已广泛应用于木本植物的离体再生研究中 ,尤其能
显著促进再生难度较大的植物器官再生 [ 8] 。 Mackay等在研
究 Mexicanredbud时也发现使用 TDZ利于出芽 [ 9] 。据统计
已有近 100种再生困难的木本植物使用 TDZ后都获得了成
功 。但是目前对 TDZ高活性细胞激动素作用的分子机制仍
不完全清楚 ,其如何调控基因表达等问题均需深入研究。
　　木本植物生根比较困难 [ 10] 。在组织培养过程中 ,不定
根形成的好坏直接影响到组培苗移栽的成活率 ,而组培苗的
生根是一个复杂的生理生化过程 ,受多种因素的影响。诱导
根源基的难易既与苗木本身的基因型和内源激素有关 ,也与
培养条件和外源激素有关。在众多影响因素中 ,植物激素起
着决定作用。许多研究证明生长素是试管苗诱导生根最重
要的影响因子 ,它对不定根的分化是必需的。生长素影响酶
的活性 ,增加了原生质透性 ,降低了原生质黏性 ,使代谢活动
加快 ,核糖核酸合成加强 ,这一系列重要生理生化变化有利
于不定根的发生和生长。试验表明 , IBA和 NAA均可诱导
花榈木不定根的形成 ,相同浓度的 IBA比 NAA的诱导效果
好 , IBA和 NAA配合使用的效果优于单独使用;适合花榈木
不定根生成的最佳培养基为 1/2WPM+NAA0.5 mg/L+IBA
0.5mg/L。
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16273　37卷 33期　　　　　　　　　　　　　　　　　　高丽等　花榈木胚轴愈伤组织的诱导及植株再生