全 文 ：HPLC同时测定鹰嘴豆中染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A的含量
邢江浩 ,孙晓莉＊ ,周军
(第四军医大学药学系化学教研室 ,西安 710032)
摘要　目的:建立同时测定鹰嘴豆中染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A含量的高效液相色谱方法。方法:采用 Kromasil
C18色谱柱(250mm×4.6 mm, 5 μm), 流动相:乙腈 -0.1%磷酸(40∶60), 流速:1.0 mL· min-1 , 检测波长:254 nm, 柱温:25
℃。结果:染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A的线性范围分别为 0.42 ～ 2.11 μg(r=0.9990), 0.42 ～ 2.09 μg(r=
0.9992), 0.41 ～ 2.06μg(r=0.9992);回收率(n=3)分别为 99.6%(RSD=1.5%), 99.7%(RSD=1.0%), 99.7%(RSD=
1.1%)。结论:本法简便快速 , 回收率及重复性良好 ,适用于鹰嘴豆中染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A的定量分析。
关键词:鹰嘴豆;染料木素;刺芒柄花素;鹰嘴豆芽素 A;高效液相色谱法
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)01-0073-03
HPLCdeterminationofgenistein, formononetinand
biochaninAinCicerarietinumL.
XINGJiang-hao, SUNXiao-li＊ , ZHOUJun
(DepartmentofPharmacy, theFourthMilitaryMedicalUniversity, Xia an710032, China)
Abstract Objective:ToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofgenistein, formononetinandbiochanin
AinCicerarietinumL.Method:AKromasilC18column(250 mm×4.6 mm, 5 μm)wasadoptedwiththemobile
phaseofacetonitrile-0.1% phosphoricacid(40∶60), theflowratewas1.0mL· min-1.Thewavelengthofdetec-
tionwassetat254nmandthecolumntemperaturewasat25℃.Results:Thecalibrationcurvewaslinearoverthe
rangeof0.42-2.11 μgforgenistein(r=0.9990), 0.42-2.09 μgforformononetin(r=0.9992)and0.41 -
2.06μgforbiochaninA(r=0.9992).Theaveragerecovery(n=3)ofgenisteinwas99.6%(RSD=1.5%), that
offormononetinwas99.7% (RSD =1.0%)andthatofbiochaninA was99.7% (RSD =1.1%),
respectively.Conclusion:Themethodissimple, economicalandaccuratewithgoodreproducibility.
Keywords:CicerarietinumL.;genistein;formononetin;biochaninA;HPLC
鹰嘴豆(CicerarietinumL.),豆科鹰嘴豆属 。因
其面形奇特 ,尖如鹰嘴 ,故称此名 。别名桃豆 、鸡碗
豆 ,新疆俗称诺胡提 , 又称桃尔豆 。在新疆已有
2500年的栽培历史 。研究表明鹰嘴豆具有广泛的
生理活性 ,如防癌 、降血脂 、保护心血管功能等 ,鹰嘴
豆作为新疆天然植物资源 ,维药 [ 1]中被广泛应用于
治疗糖尿病 、高脂血症等疾病 ,因而备受关注。根据
文献 [ 2]可知其有效成分主要为染料木素 、刺芒柄
花素 、鹰嘴豆芽素 A等异黄酮类物质 ,为此本实验
就鹰嘴豆中染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A
的提取方法和含量测定方法进行了研究 ,建立了同
时测定以上 3种异黄酮含量的高效液相色谱方法。
1 仪器与试剂
美国 Dionex高效液相色谱仪 ,包括 P680系列
四元 梯 度 泵 、 PDA100 二 极 管 阵 列 检 测 器 、
CHROMELON工作站。 SK250LH型超声波清洗器
(上海科导超声仪器有限公司)。
对照品染料木素 (纯度 >98%)、刺芒柄花素
(纯度 >98%)由西安慧科植物提取公司提供 ,鹰嘴
豆芽素 A(纯度 >98%)购自 Sigma公司。鹰嘴豆购
自新疆 ,由孙晓莉教授鉴定 。色谱纯乙腈购自 Fish-
erChemicals公司。色谱纯甲醇购自汉邦科技公司 ,
其他试剂为分析纯 。
—73—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(1)
＊ 通讯作者　Tel:(029)84774470;E-mail:Lisydcn@yahoo.com.cn
2 方法与结果
2.1　色谱条件　KromasilC18色谱柱(250 mm×4.6
mm, 5μm),流动相:乙腈 -0.1%磷酸(40∶60),流
速:1.0 mL· min-1 ,检测波长:254 nm,柱温:25 ℃。
2.2 溶液制备
2.2.1 混合对照品溶液 精密称取 60 ℃干燥至
恒重的染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A适
量 ,加甲醇制成每 1mL含染料木素 1.503 mg、刺芒
柄花素 1.040mg、鹰嘴豆芽素 A1.030mg的混合溶
液 ,即得。
2.2.2 供试品溶液 鹰嘴豆经干燥 、粉碎 ,取粗粉
1 g,精密称定 ,置 50mL具塞瓶中 ,精密加入 80%乙
醇 20mL,称定重量 ,超声处理(250 W, 59 kHz)30
min,放至室温后 ,称定重量 ,加 80%乙醇补足减失
的重量 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液作为供试品溶液 。
2.3 线性关系考察 分别精密吸取上述混合对照
品溶液 4 , 8, 12, 16, 20 μL,注入液相色谱仪 ,测定各
组分的峰面积 ,以进样量 X(μg)为横坐标 ,测得峰
面积 Y为纵坐标 ,进行线性回归 ,得染料木素 、刺芒
柄花素和鹰嘴豆芽素 A回归方程分别为:
Y=40.4X+4.16 r=0.9990
Y=29.4X+2.72 r=0.9992
Y=37.2X+3.35 r=0.9992
结果表明染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A进
样量分别在 0.42 ～ 2.11, 0.42 ～ 2.09, 0.41 ～ 2.06
μg范围内呈良好线性关系。
2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 20
μL,连续进样 6次 ,测得峰面积 ,计算染料木素 、刺
芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A峰面积的 RSD分别为
0.87%, 0.46%, 1.0%。结果表明精密度良好 。
2.5 重复性试验 取同一样品 (批号 061207)5
份 ,每份 1 g,精密称定 ,按 “ 2.2.2”项下方法操作 ,
进样 20 μL,测定峰面积。结果染料木素 、刺芒柄花
素和鹰嘴豆芽素 A含量的平均值 (n=5)分别为
1.41, 1.24, 0.75 mg· g-1;RSD分别为 1.2%,
1.1%, 0.9%。结果表明此法重复性良好。
2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液 20
μL,分别于第 0 , 1, 2, 4, 6, 8h进样 ,测得峰面积 ,染
料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A峰面积的 RSD
分别为 0.8%, 0.6%, 0.6%。证明供试品溶液在 8
h内稳定 。
2.7 回收率试验 取 3份已知含量的样品(批号
061207,染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A的
含量分别为 1.41, 1.24, 0.75 mg· g-1)粉末 0.5 g,
精密称定 ,依次精密加入以甲醇配制的染料木素对
照品溶液(1.00 mg· mL-1)0.7 mL,刺芒柄花素对
照品溶液(1.06 mg· mL-1)0.6 mL,鹰嘴豆芽素 A
对照品溶液 (1.03 mg· mL-1 )0.4 mL。依照
“2.2.2”项下方法操作制备溶液。按上述色谱条件
进行测定 ,计算回收率。结果染料木素 、刺芒柄花素
和鹰嘴豆芽素 A平均回收率(n=3)分别为 99.6%
(RSD为 1.5%), 99.7%(RSD为 1.0%), 99.7%
(RSD为 1.1%)。
2.8 样品测定 分别精密吸取按 “2.2.1”项下方法
制备的混合对照品溶液和依照 “2.2.2”项下方法制备
的供试品溶液各 20 μL,按本文色谱条件 ,注入液相
色谱仪 ,测定 3批样品中染料木素 、刺芒柄花素和鹰
嘴豆芽素 A的含量。结果见表 1,色谱图见图 1。
表 1 3批样品含量测定结果(mg· g-1 , n=3)
Tab1　Resultofcontentdeterminitionof3 samples
批号
(LotNo.)
染料木素
(genistein)
刺芒柄花素
(formononetin)
鹰嘴豆芽素A
(biochaninA)
061207 1.41 1.24 0.75
061210 1.43 1.27 0.77
061215 1.48 1.30 0.71
图 1 样品(A)与混合对照品(B)色谱图
Fig1 Chromatogramsoftestsample(A)andreferencesubstances(B)
1.染料木素(genistein) 2.刺芒柄花素(formononetin) 3.鹰嘴豆
芽素 A(biochaninA)
3 讨论
3.1 提取溶剂的选择 精密称取同一样品约 1 g,
分别精密加水 、30%乙醇 、50%乙醇 、70%乙醇 、80%
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乙醇 、90%乙醇 20 mL,超声(250 W, 59 kHz)提取
30 min,进样 20 μL, 比较峰面积 。试验结果表明
80%乙醇提取效果最好 。
3.2 超声提取时间的选择 精密称取同一样品约
1 g,分别精密加 80%乙醇 25 mL,超声(250 W, 59
kHz)提取 20, 30, 40 min,进样 20 μL,比较峰面积 。
实验结果表明超声 30 min为最佳提取时间。
3.3　流动相的选择 试验中参考文献 [ 3 ～ 5]分别
采用甲醇 -水(50∶50)、乙腈 -水 (45∶55)、乙腈 -
水(40∶60)、乙腈 -0.1%磷酸(40∶60)为流动相 ,结
果采用乙腈 -0.1%磷酸(40∶60)为流动相时 ,样品
分离良好 ,分离度大于 1.5。
3.4 检测波长的选择 分别对染料木素 、刺芒柄
花素和鹰嘴豆芽素 A的单一对照品溶液进行全波
长扫描 ,结果刺芒柄花素的最大吸收波长为 248
nm,染料木素和鹰嘴豆芽素 A的最大吸收波长为
260nm,由于三者最大吸收波长较为接近 ,且三者在
254nm处的吸收也非常强 ,综合考虑 ,选择 254 nm
作为检测波长。
3.5　小结 本文在同一色谱条件下测定了鹰嘴豆
中染料木素 、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素 A的含量 ,
方法简便 、快速 ,准确度高 ,重复性好 ,可用于鹰嘴豆
的含量测定和质量控制。
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(本文于 2008年 7月 4日修改回)
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