全 文 ：第 二 军 医 大 学 学 报
Acad J Sec Mil Med Univ
　2006 Jan;27(1) 81　
论　著
高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的含量
纪松岗1 ,李　翔2 ,娄子洋3 ,朱臻宇2 ,柴逸峰2*
(1.解放军第 401 医院药剂科 , 青岛 266071;2. 第二军医大学药学院药物分析学教研室 , 上海 200433;3. 药学院分析测试中心 ,
上海 200433)
[ 摘要] 　目的:采用高效液相色谱法测定膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(F isch. ) Bge. 中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的含
量。方法:依利特 Hype rsil ODS 2 色谱柱(4. 6 mm×250 mm , 5 μm);流动相:A 相为乙腈-甲醇(体积分数 9∶1), B 相为水 ,梯
度洗脱;流速:1. 0 ml /min;检测波长:260 nm;柱温:室温;进样量:20 μl。黄芪药材以甲醇超声提取 2 次 ,每次 20 min。结果:
毛蕊异黄酮苷和芒柄花素色谱峰的理论塔板数分别为 50 134 和 25 258。回归方程分别为Y =58 924 X - 12 352 , r=0. 999 9
和Y =9 237 X - 124 447 , r=0. 999 9 ,线性范围分别为 2. 022 ～ 101. 1 μg /ml和 38. 04～ 1 522μg /ml。方法学考察结果表明 ,毛
蕊异黄酮苷和芒柄花素的日内和日间 RSD 均<2. 0%,最低检测限分别为 0. 202 2 μg /ml和 1. 522 μg /m l , 加样回收率结果分
别为 98. 34%, RSD=1. 33%(n=3)和 98. 84%, RSD=0. 12%(n=3)。测定了 10 批次黄芪药材的毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的
含量。结论:该方法稳定简便 ,结果可靠 , 能够用于黄芪药材中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素含量测定的研究。
[ 关键词] 　色谱法 ,高效液相;黄芪;毛蕊异黄酮苷;芒柄花素
[ 中图分类号] 　R 284. 2　　　[ 文献标识码] 　A　　　[ 文章编号] 　0258-879X(2006)01-0081-04
High performance liquid chromatography in determination of calycosin-7-O-β-D-glucoside and formononetin in
Radix astragali
JI Song-gang1 , L I Xiang2 , LOU Zi-yang3 , ZHU Zhen-yu2 , CHAI Yi-feng2*(1. Department o f Pha rmacy , No. 401 H ospital of
PLA , Qingdao 266071 , China;2. Depa rtment of Drug Ana ly sis , School of Pharmacy , Second M ilitary Medical Univ ersity ,
Shanghai 200433;3. Pharmaceutical Analy sis Center , School of Pharmacy , Shanghai 200433)
[ ABSTRACT] 　Objective:To determine the contents of caly co sin-7-O-β-D-g lucoside and fo rmononetin in Astragalus membrana-
ceus (Fisch.) Bge. by high pe rfo rmance liquid chromato gr aphy (H PLC). Methods:The H PLC condition w as as fo llow s:col-
umn:H ypersil ODS 2 column (4. 6 mm×250 mm , 5 μm);mobile phase:A w as ACN-MeOH (9：1 , V / V), B was H 2O , w ith
gr adient elution;flow speed:1. 0 ml /min;detec tion:260 nm;tempe rature of column:ro om tempe rature;injec tion volume:20
μl. Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge. wa s ex tracted with me thanol so lution tw ice , each time 20 min. Results:The theo-
retical plate numbe rs of caly co sin-7-O-β-D-g lucoside and fo rmononetin we re 50 134 and 25 258 , r espectively. The calibration
cur ves were linear w ithin the range of(2. 022-101. 1)μg /ml fo r ca lyco sin-7-O-β-D-g lucoside and(38. 04-1522)μg /ml fo r fo rm-
onone tin , with their r egre ssion function being Y =58 924X - 12 352 , r=0. 999 9 and Y =9 237X - 124 447 , r=0. 999 9 , re-
spectively. The intr a-day and inter-day precisions(RSD) at low , middle and high injec tion volume w ere all less than 2. 0%. The
limits of de tection w ere 0. 202 2 mg /ml fo r calyco sin-7-O-β-D-g lucoside and 1. 522 mg /ml fo r formonone tin. The recove ry r ates
were 98. 34%(RSD=1. 33%, n=3) for caly cosin-7-O-β-D-g luco side and 98. 84%(RSD=0. 12%, n=3) for fo rmononetin.
The contents of calycosin-7-O-β-D-gluco side and fo rmononetin in 10 diffe rent batch o f Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.
were determined. Conclusion:HPLC is a simple and reliable method for de te rmining the contents o f calycosin-7-O-β-D-gluco side
and formononetin in Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.
[ KEY WORDS] 　chromatog raphy , high pressur e liguid;Astragalus membranaceus;caly co sin-7-O-β-D-g lucoside;fo rmononetin
[ Acad J Sec M il Med Univ , 2006 , 27(1):81-84]
[ 基金项目] 　上海市科委科技攻关项目(02419125);上海市科委重
大项目(2403DZ19548). S upported by Grants for Tack ling Key Pro-
g ram of Sh angh ai Science and Tech nology Commit tee(02419125) and
Key Program of Sh angh ai Science and Tech nology Commit tee
(2403DZ19548).
[ 作者简介] 　纪松岗 ,博士 ,副主任药师.
*Corresponding autho r. E-mail:yfchai@smm u. edu. cn
　　黄芪为豆科植物蒙古黄芪 Astragalus membra-
naceus (Fisch.) Bge. var. mongho licus (Bge. )
Hsiao 或 膜 荚 黄 芪 Astragalus membranaceus
(Fisch.) Bge. 的干燥根 ,具有补气固表 、利尿托毒 、
排脓 、敛疮生肌等功效[ 1] 。黄芪中的主要有效成分
为皂苷和黄酮类化合物 ,研究证实黄芪中的黄酮类
成分具有清除氧自由基 ,抑制脂质过氧化和维持血
82　 第二军医大学学报　2006年 1月 ,第 27卷
中 NO浓度 ,保护缺血再灌注损伤等多种药理活
性[ 2] 。黄芪中黄酮类化合物主要由异黄酮和异黄酮
苷成分组成 , 二者的药理作用相近 , 但极性差别较
大 ,尚未见同时测定这 2种成分的文献报道。
　　目前 ,黄芪中黄酮类成分的含量测定方法主要
有分光光度法[ 3] 、薄层扫描法[ 4 , 5] 和高效液相色谱
法[ 6 ～ 8] 等。其中 ,分光光度法和薄层扫描法因方法
重现性差和测定结果不准确等缺点 ,已经逐渐被高
效液相色谱法取代。高效液相色谱法测定紫外吸收
较好的黄酮类成分时 ,具有灵敏度好 、杂质干扰少和
检测限低等优点。因为含量和极性差异较大 ,采用
等度洗脱的方法不能同时测定黄芪中毛蕊异黄酮苷
和芒柄花素的含量。宋纯清等[ 6] 只测定了黄芪中毛
蕊异黄酮苷及其他黄酮类成分 ,杂质干扰较多 ,导致
含量测定的准确性较差。郑志仁等[ 8] 也分别以 2个
等度洗脱方法测定黄芪中芒柄花素和其他成分 ,色
谱图基线较高 ,且待测组分的色谱峰与其他色谱峰
无法有效分离 ,直接影响测定结果的准确性 。本实
验首次采用梯度洗脱的方法同时测定黄芪中极性差
异较大的异黄酮和异黄酮苷的含量 ,能更有效分离待
测组分与杂质 ,具有简便 、快速 、准确 、有效等优点。
1　仪器和试药
　　Waters 高效液相色谱仪:515 型 HPLC 双泵 ,
996型二极管阵列检测器 , Rheodyne 7725i进样器 ,
Waters Millennium
32工作站;MET TLER A E240电
子天平;CQF-I-6型超声仪;上海淀久 DJ-04药材粉
碎机;BüCHI R-200 型旋转蒸发仪。毛蕊异黄酮苷
和芒柄花素对照品购自上海中医药大学中药标准化
研究中心(经 HPLC 面积归一化法检测 , 纯度 >
99. 3%);黄芪药材由上海华宇药业有限公司提供 ,
并鉴定 为膜 荚黄芪 Astragalus membranaceus
(Fisch.) Bge. 的干燥根;甲醇和乙腈为色谱纯;水
为重蒸水 。
2　方法和结果
2. 1　对照品溶液的制备　精密称取毛蕊异黄酮苷
对照品 10. 11 mg 和芒柄花素对照品 9. 510 mg ,分
别置 100 m l和 5 m l量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至
刻度 ,摇匀 。精密量取上述毛蕊异黄酮对照品溶液
0. 8 、0. 6 、0. 4 、0. 2 、0. 02 ml及芒柄花素对照品溶液
0. 8 、0. 6 、0. 4 、0. 2 、0. 08 、0. 02 ml ,分别置 1 ml量瓶
中 ,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,即得浓度为 80. 88 、60. 66 、
40. 44 、20. 22 、2. 022 μg /ml的毛蕊异黄酮对照品溶
液和浓度为 1 522 、1 141 、760. 8 、380. 4 、152. 2 、
38. 04 μg /ml的芒柄花素对照品溶液 ,置于 4℃冰箱
保存。
2. 2　黄芪药材样品溶液的制备　精密称取黄芪药
材粗粉约 2. 0 g(过 40目筛 ,60℃干燥至恒重),置具
塞锥形瓶中 ,加甲醇 100 ml ,超声处理 20 min , 滤
过 ,再重复处理 1次 ,滤过 ,滤渣用甲醇洗涤 3次 ,每
次 20 ml ,合并滤液减压回收至干 ,残渣用适量甲醇
溶解 ,转移至 5 ml 量瓶中 ,加甲醇至刻度 , 摇匀 ,
0. 45 μm滤膜滤过 ,弃去初滤液 ,取续滤液 ,即得 ,置
于 4℃冰箱保存。
2. 3　色谱条件 　色谱柱:依利特 Hypersi l ODS 2
柱(4. 6 mm×250 mm , 5μm);流动相:A 相为乙腈-
甲醇(体积分数 9∶1), B 相为水 ,梯度洗脱。A 相
含量随时间的变化:5%(0 ～ 5 min),5%～ 20%(5 ～
8 min ,线性), 20%(8 ～ 15 min), 20%～ 30%(15 ～
18 min , 线性), 30%～ 45%(18 ～ 35 min , 线性),
45%～ 80%(35 ～ 38 min , 线性), 80%(38 ～ 45
m in);流速:1. 0 ml /min;检测波长:260 nm;柱温:
室温;进样量:20 μl。以对照品溶液进样 ,根据毛蕊
异黄酮苷和芒柄花素的色谱参数计算系统适应性 ,
其理论塔板数分别为 50 134和 25 258;分离度分别
为 11. 10 和 12. 46;拖尾因子分别为 0. 99和 1. 02。
对照品和样品的色谱图见图 1。
图 1　对照品(A)及黄芪药材(B ,批次为 H2003042903)
的 HPLC/DAD色谱图
Fig 1　HPLC/DAD chromatograms of reference substance(A)
and Radix astragali(B, batch H2003042903)
1:Calycosin-7-O-β-D-glucoside;2:Formononetin
2. 4　线性关系考察　分别将不同浓度的 2种对照
品溶液依次连续进样 ,分别重复 3 次 ,以对照品溶液
第 1期. 纪松岗 ,等. 高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的含量 83　
的浓度(X , μg /ml)对峰面积(Y)进行线性回归。毛
蕊异黄酮苷的回归方程为Y =58 924 X - 12 352 ,
r=0. 999 9 ,在 2. 022 ～ 101. 1 μg /ml之间的线性关
系良好;芒柄花素的回归方程为 Y =9 237 X -
124 447 , r=0. 999 9 ,在 38. 04 ～ 152 2 μg /m l之间
的线性关系良好 。
2. 5　方法学考察
2. 5. 1　精密度试验　以 20. 22 、40. 44 、101. 1 μg /
ml的毛蕊异黄酮苷对照品溶液和 38. 04 、760. 8 、
1 522 μg /m l的芒柄花素对照品溶液 ,在 1 d之内连
续进样 5次 ,以及连续 5 d分别进样 ,根据所得峰面
积分别考察日内精密度和日间精密度 。毛蕊异黄酮
苷对照品溶液低 、中 、高 3个浓度的日内精密度和日
间精密度的 RSD 分别为 1. 75%、1. 15%、0. 29%和
1. 89%、1. 38%、0. 35%;芒柄花素对照品溶液低 、
中 、高 3个浓度的日内精密度和日间精密度的 RSD
分别为 1. 88%、0. 75%、0. 71%和 1. 37%、0. 84%、
0. 44%,表明方法的精密度良好。
2. 5. 2　检测限考察　将毛蕊异黄酮苷和芒柄花素
对照品溶液进行稀释 ,以信噪比为 3∶1 时 ,确定其
最低检测限 。毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的最低检测
限分别为 0. 202 2 μg /m l和 1. 522 μg /ml。
2. 5. 3　稳定性试验　取制备的黄芪药材样品溶液 ,
分别在 0 、3 、6 、12 、18 、24 、36 和 48 h 测定毛蕊异黄
酮苷和芒柄花素的峰面积 ,考察稳定性 。毛蕊异黄
酮苷和芒柄花素峰面积 RSD 分别为 0. 47%和
0. 44%,表明供试品溶液在 48 h内稳定。
2. 5. 4　重复性试验　精密称取同一批次黄芪药材
样品 5 份 ,各约 2. 0 g ,分别制成样品溶液 ,进样分
析 。黄芪药材中毛蕊异黄酮苷平均含量为 0. 044 7
mg /g , RSD =1. 08%(n=5);芒柄花素平均含量为
0. 798 4 mg /g , RSD =0. 40%(n=5),表明方法的
重复性良好 。
2. 5. 5　加样回收率试验　精密称取毛蕊异黄酮苷
和芒柄花素含量分别为 0. 044 5 mg /g 和 0. 800 3
mg /g 的黄芪药材粗粉3份 ,各约 2. 0 g ,分别精密加
入 101. 1 μg /ml毛蕊异黄酮苷对照品溶液和 1 902
μg /m l芒柄花素对照品溶液 0. 70 和 0. 60 、0. 90 和
0. 80 、1. 0和 1. 0 ml ,制成样品溶液 ,每份测定 3次 ,
计算加样回收率 。黄芪药材中毛蕊异黄酮苷和芒柄
花素的加样回收率结果分别为 98. 34%, RSD =
1. 33%(n=3)和 98. 84%, RSD=0. 12%(n=3)。
2. 6　样品测定　对 10 批次黄芪药材样品溶液按
1. 3色谱条件进样分析 ,计算样品含量 ,结果见表 1 。
表 1　黄芪药材中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素含量的测定
Tab 1　Determination results of calycosin-7-O-β-D-glucoside and formononetin
(n=3 , x±s , mg /g)
Batch Source Harves t time Grade C alycosin-7-O-β-D-g lucoside Formononetin
H 2003042903 Gan su Lixian 2002-04 3 0. 044 5±0. 000 2 0. 800±0. 003
H 2003042904 Gan su Lixian 2002-04 2 0. 070 5±0. 000 4 2. 943±0. 021
H 2002080501 Gan su Longxi 2001-08 3 0. 091 2±0. 000 4 1. 226±0. 013
H 2003043008 Gan su Longxi 2002-04 3 0. 162 8±0. 001 8 1. 345±0. 008
H 2003070802 Gan su Longxi 2002-07 3 0. 128 9±0. 000 5 3. 368±0. 012
H 2003092201 Gan su Longxi 2002-09 3 0. 140 6±0. 001 1 1. 687±0. 010
H 2002070901 Gan su Jinchang 2001-07 3 0. 170 6±0. 001 8 0. 592±0. 004
H 2003112801 Gan su Lanzhou 2002-11 3 0. 231 0±0. 000 9 1. 258±0. 011
H 2003043001 Inner M ongolia Baotou 2002-04 2 0. 040 4±0. 000 6 1. 657±0. 009
H 2003052001 Inner M ongolia H ohhot 2002-05 2 0. 103 1±0. 001 1 2. 209±0. 006
3　讨　论
毛蕊异黄酮苷和芒柄花素在化学结构中的差异
为 3’ -OH 和 7-D-g luco side ,由于这些极性基团的存
在 ,使毛蕊异黄酮苷的极性明显增加 ,无法采用等度
洗脱方法同时进行二者的含量测定 。文献[ 6 , 8] 报道
的方法也只能通过不同的等度洗脱方法分别测定毛
蕊异黄酮苷和芒柄花素 ,无法有效分离待测组分与
杂质 ,直接影响测定结果的准确性。本实验首次建
立同时测定黄芪中极性差异较大的异黄酮和异黄酮
苷类成分含量的梯度洗脱方法 ,可以体现不同极性
成分在黄芪药材质量评价中的作用 、减少杂质的干
扰 ,有效保证测定方法的稳定 、重现及结果的准确 、
可靠。
　　10批次黄芪药材之间因为存在种植地 、采收季
节 、储存时间 、药材等级等诸多差异 ,使毛蕊异黄酮
84　 第二军医大学学报　2006年 1月 ,第 27卷
苷和芒柄花素的含量差别较大 ,但是其规律性和道
地性较差。分析其原因认为 ,随着黄芪药材 GAP 种
植的普及 ,影响药材生长的土壤 、水分 、光照等因素
趋于一致 ,使药材中有效成分的含量稳定于某一范
围。如果可以系统分析土壤 、水分 、光照等因素对有
效成分含量的影响 ,确定黄芪药材最佳生长条件 ,将
有利于GAP 药材的种植和管理 ,提高 GAP 药材的
整体质量 ,促进药材 GAP 技术的快速发展。
　　不同批次药材中同一化学成分的含量高低是服
从或近似服从正态分布的 ,所以尝试根据已知的
GAP 黄芪药材中毛蕊异黄酮苷和芒柄花素的含量
测定结果初步确定其 95%的参考值范围 ,期待可以
为确定药材的有效成分含量标准提供思路 。二者的
平均含量分别为(0. 118 4 ±0. 060 4) mg /g 和
(1. 708±0. 893) mg /g ,故含量下限分别为:
　　在此标准下 ,全部 10 批次 GAP 黄芪药材均达
到要求 ,但因确定 95%参考值范围采用的 GAP 黄
芪药材的样品量较少 ,无法涉及到影响药材含量变
化的诸多因素 ,只有在大样本量研究的基础上 ,才能
够保证其统计学意义 。
[参 考 文 献]
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[ 收稿日期] 　2005-08-07　　 [ 修回日期] 　2005-10-24
[ 本文编辑] 　孙　岩
我校 6项课题获第六届“上海市临床医疗成果奖”
　　为鼓励临床一线科研创新精神 ,努力营造良好的学术氛围 ,充分调动临床第一线医务人员的积极性和创造性 ,上海市卫生
局开展了第六届“上海市临床医疗成果奖”评审工作 ,共评选出获奖项目 25 项 , 我校共有 6 项课题获奖 ,名单如下:
一等奖
　　严重上颈椎不稳的手术治疗(长征医院骨科　倪　斌 ,贾连顺)
二等奖
　　喉返神经探查减压及神经修复治疗(长海医院耳鼻喉科　郑宏良 ,陈世彩)
肝静脉阻断技术在高难度肝肿瘤切除术中的应用(东方肝胆外科医院肝外三科　周伟平 ,李爱军)
三等奖
　　异基因外周血造血干细胞移植治疗白血病的临床研究(长海医院血液科　王健民 ,章卫平)
胸腹心包腔积液检验方法改进及细胞形态学诊断应用(长海医院实验诊断科　周道银 ,项耀钧)
下睑成形新理念与新技术的临床应用(长海医院整形外科　邢　新 ,李军辉)