全 文 ：第 27卷 ,第 4期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 7 , No . 4
2 0 1 0年 7月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory July , 2 0 1 0
高效液相色谱测定黄芪中
毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量
① 联系人 ,电话: ( 0570) 8026668; E-mail: lf l8huang@ yah oo. com. cn
作者简介:黄兰芳 ( 1963— ) ,男 ,湖南省常德市人 ,教授 ,主要从事中药现代化研究工作。
贺云彪 ( 1963— ) ,男 ,湖南省常德市人 ,高级工程师 ,主要从事药物分析研究工作。。
收稿日期: 2009-11-05;接受日期: 2009-12-12
贺云彪　黄兰芳① a　胡 伟a　谢建伟a
(常德市药品检验所　湖南省常德市紫桥二区竹园　 415000)
a (衢州学院化学与制药工程系　浙江省衢州市九华北大道 78号　 324000)
摘　要　利用化学计量学分辨方法和高效液相色谱法建立了黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的定量分
析方法。 色谱柱为 Hypersic ODS柱 ( 4. 4mm× 250mm, 5μm) ,流动相为 A: 水含 0. 2% (V /V )醋酸 ,B:乙腈
含 0. 2% (V /V )醋酸 ,线性梯度洗脱。借直观推导式演进特征投影 ( HELP)法分辨 HPLC-DAD产生的二维
数据得毛蕊异黄酮和芒柄花素的纯光谱和纯色谱 ,用总体积积分法定量分析其含量。毛蕊异黄酮和芒柄花
素的校准曲线和相关系数分别为 y= 166. 72x+ 127. 8( r= 0. 9997)和 y= 178. 39x+ 187. 2(r= 0. 9993) ,线
性范围分别为 1. 0— 116. 5μg· m L- 1和 1. 2— 112. 5μg· m L- 1 ,加标回收率分别在 96. 5%— 98. 7%和
96. 8%— 98. 5%之间。 方法灵敏、选择性和可靠性好 ,可用于测定黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量及质
量控制。
关键词　高效液相色谱 ;化学计量学 ;直观推导式演进特征投影 ( HELP) ;黄芪 ;黄酮
中图分类号: O657. 7+ 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 1004-8138( 2010) 04-1541-05
1　引言
黄芪是豆科黄芪属膜荚黄芪或蒙古黄芪的根 ,具有重要的生理和药理作用 [ 1]。黄酮类化合物为
黄芪的主要活性成分 ,其中毛蕊异黄酮和芒柄花素为 2个重要的组分 ,有抗菌和雌激素作用 [2 ]。 测
定黄芪中黄酮类化合物的方法主要有分光光度法 [ 3]和高效液相色谱法 [4, 5 ] ,但分光光度法测定的是
总黄酮 ,国外有用液相色谱 -质谱法测定异黄酮类化合物的报道 [6 ] ,但液相色谱 -质谱仪还未被广泛
使用 ,故建立简便且可靠的毛蕊异黄酮和芒柄花素的测定方法有一定的理论和实际意义。本文用高
效液相色谱-阵列式光电二极管检测器 ( HPLC-DAD)联用色谱检测 ,借直观推导式演进特征投影
( HELP)法 [7— 9 ]解析得到待测组分的纯色谱和光谱曲线 ,然后利用总体积积分法 [ 10]定量分析黄芪
中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量 ,结果令人满意。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
Agilient 1100型高效液相色谱仪 ,包括 G1311A型二极管阵列检测器 , 250mL索氏提取器 (金
坛市晶玻实验仪器厂 ) ; SB2200型超声波振荡仪 (上海必能信超声有限公司 ) ; AB104-S /A分析天
平 (瑞士梅特勒公司 ,精度为 0. 1mg)。
毛蕊异黄酮和芒柄花素 (中国药品生物制品检定所 ) ;毛蕊异黄酮和芒柄花素用甲醇配成
1mg· mL- 1储备液 ,工作液 ( 1. 0和 20. 0μg· mL- 1 )用甲醇稀释储备液配制 ;黄芪 (长沙老百姓大药
房 ) ;色谱纯乙腈 (江苏汉邦科技有限公司 ) ;甲醇、正丁醇、醋酸均为分析纯。 实验用水为超纯水。
2. 2　提取方法
将黄芪粉末于 60℃干燥 1h,过 40目筛后 ,准确称取 2g样品 ,加入乙醚 50mL超声脱脂 15min
后弃去乙醚液。将药材置索氏提取器中 ,加入 200mL甲醇 ,水浴中 ( 80℃ )提取 3. 0h,过滤并真空干
燥后溶解于 25mL热水中。分别用 10mL和 5mL正丁醇萃取 2次 ,合并正丁醇相 ,减压蒸发后 ,用
10mL甲醇溶解。
2. 3　色谱条件
色谱柱为 Hypersic ODS柱 ( 4. 4mm× 250mm, 5μm) ,流动相为 A:水 (含 0. 2%醋酸 , V /V ) ,B:
乙腈 (含 0. 2%醋酸 ,V /V ) ;流速为 1. 0mL /min;波长扫描范围: 200— 400nm;进样量为 10μL;线性
梯度洗脱 ( A,% ): 0— 5min, 75— 68; 5— 10min, 68— 65; 10— 20min, 65— 40; 20— 45min, 40— 40。
3　结果与讨论
3. 1　重叠峰的解析
将毛蕊异黄酮和芒柄花素混合对照品 (浓度均为 20μg· mL- 1 )或内蒙黄芪提取液在拟定色谱
条件下分析 ,毛蕊异黄酮和芒柄花素的保留时间分别为 25. 89和 30. 65min(见图 1) 。
图 1　对照品及黄芪样品在 260nm处的 HPLC-DAD色谱图
A—— 对照品 ; B—— 内蒙古产黄芪样品 ;1——毛蕊异黄酮 ; 2—— 芒柄花素。
从图 1知 , 虽然优化了色谱条件 ,组分仍未达完全分离 ,若直接定量分析可靠性差 ,然而采用
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HELP法对二维数据进行解析 ,可对待测组分准确定性定量。以内蒙黄芪 HPLC-DAD色谱图中
24. 80— 26. 20min段 (即峰簇 C )为例说明 HELP的解析过程。
首先 ,用主要成分分析法 ( PCA) [11 ]扣除背景和基线漂移 ,由秩图 [7 ]可判断在 24. 80— 26. 20min
内是一个 a、b和 1三组分体系 (图 2)。从秩图可知色谱流出曲线、峰簇中的组分数、各组分的选择性
区域和零组分区域。依据上述信息 ,用 HELP法解析能得到每一组分纯色谱曲线 (图 3A )和纯光谱
曲线 (图 3B )。图 2中将解析过的组分与标准物对照 ,可知组分 1即为待测组分毛蕊异黄酮。同样可
以解析得到待测组分芒柄花素的纯色谱和光谱曲线。
图 2　由 FSMW EFA获得峰簇 C的秩图
图 3　峰簇 C解析后的纯色谱曲线 (A)和纯光谱曲线 (B )
3. 2　校准曲线
在常规色谱定量分析时 ,色谱峰的高度或面积与相应成分的浓度成正比。与此类似 ,总体积积
分法是基于组分纯色谱和光谱矢量的乘积与组分的浓度成正比 ,从而实现对组分的定量检测。总体
积积分法充分利用了矩阵数据所包含组分纯色谱和光谱信息 ,其结果更准确。
每一组分配制 7个非零标准 ,毛蕊异黄酮为 1. 0、 2. 5、 20. 0、 40. 0、 80. 0、 100. 0、 116. 5
1543第 4期 贺云彪等:高效液相色谱测定黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量
μg· mL- 1 ,芒柄花素为 1. 2、 2. 5、 20. 0、 40. 0、 80. 0、 100. 0、 112. 5μg· mL- 1 ,按相同色谱条件分析 ,
经解析得到毛蕊异黄酮和芒柄花素的纯色谱和光谱 ,计算总体积 (y ) ,以总体积对样品溶液的浓度
(x ,μg· mL- 1 )作校准曲线 ,毛蕊异黄酮和芒柄花素的校准曲线和相关系数分别为 y= 166. 72x+
127. 8( r= 0. 9997)和 y= 178. 39x+ 187. 2(r= 0. 9993) ,其线性范围分别为 1. 0— 116. 5μg· mL- 1
和 1. 2— 112. 5μg· mL- 1。
3. 3　重复性试验
取同一产地黄芪 ,准确称取样品 5份 ,按样品制备方法平行操作 ,结果毛蕊异黄酮和芒柄花素
总体积的 RSD分别为 3. 2%和 3. 8% ,说明方法的重复性良好。
3. 4　选择性和检出限
由于总体积积分法是基于组分纯色谱和光谱矢量 ,故本法有很高的专属性。 当信噪比为 3∶ 1
时 ,毛蕊异黄酮和芒柄花素的检出限 ( LOD)分别为: 0. 3、 0. 4μg· mL- 1。
3. 5　回收率试验
选取含量已知的黄芪样品 ,按高、中、低浓度分别加入 80, 120, 240μg对照品 ,按“ 2. 2”节所述方
法制备样品溶液 ,制成高、中、低 3个浓度的供试品溶液 ,用上述方法测定内蒙黄芪中毛蕊异黄酮和
芒柄花素的含量 ,每个浓度重复试验 5次 ,计算平均回收率。 结果见表 1。
表 1　样品中毛蕊异黄酮和芒柄花素的回收率
组分 原含量
(μg /g)
加入量
(μg /g )
加标测定值
(μg /g)
回收率
(% )
RSD
(% ,n= 5)
40. 0 134. 8 96. 5 3. 4
毛蕊异黄酮 96. 2 60. 0 154. 9 97. 8 2. 9
120. 0 214. 6 98. 7 1. 7
40. 0 97. 3 97. 2 3. 7
芒柄花素 58. 4 60. 0 117. 5 98. 5 3. 2
120. 0 174. 6 96. 8 1. 9
3. 6　样品测定
取不同产地黄芪 ,按“ 2. 2”节所述方法制备样品溶液 ,用上述方法测定毛蕊异黄酮和芒柄花素
的含量 ,结果如表 2。不同产地黄芪中均含这 2种黄酮 ,且含量较高 ,但因收集样本较少 ,还不能比
较不同产地黄芪中这 2种黄酮成分的差异。
表 2　不同产地黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量 (n= 3)
产地 毛蕊异黄酮测定值 (μg /g) RSD(% )
芒柄花素
测定值 (μg /g) RSD(% )
山西应县 71. 4 3. 9 37. 2 4. 6
吉林四平 97. 2 2. 4 57. 1 3. 2
河北秦皇岛 104. 8 2. 2 67. 2 3. 1
内蒙古包头 86. 1 3. 7 48. 5 4. 2
4　结论
本文借直观推导式演进特征投影 ( HELP)法等相关化学计量学分辨方法 ,提出了用高效液相
色谱 ( HPLC)测定黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量的方法 ,通过对黄芪中主要黄酮类活性成
分的定性和定量分析 ,能为进一步研究和开发黄芪提供有利的科学依据。
1544 光谱实验室 第 27卷
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Determination of Calycosin and Formononetin in Radix Astragal
by High Performance Liquid Chromatography
HE Yun-Biao　 HUANG Lan-Fanga　 HU Weia　X IE Jian-Weia
(Changd e Inst itute for Drug Control ,Changde, Hunan 415000,P . R. China )
a( Department of Chemist ry and Pharmaceutical Engineering ,Quzhou College,Quzhou, Zhej iang 324000, P. R.China)
Abstract　 A method for the determination of calycosin and fo rmononetin in radix ast ragal w as
developed wi th relativ e chemometrics methods and high performance liquid chromatog raphy. The
analytical column was Hypersic ODS column ( 4. 4mm× 250mm, 5μm) . The mobile phase w as w ater
containing 0. 2% (V /V ) acetic acid ( A) and acetonit rile containing 0. 2% (V /V ) acetic acid( B ) wi th
a g radient system. The two-w ay da ta of HPLC-DAD hyphenated inst rument w as resolv ed wi th
heuristic evolving latent projections ( HELP) method and the pure chromatogram and spect ra of each
component w ere obtained. Then calycosin and formononetin w ere determined wi th overall volume
integ ra tion method. The reg ression equations and coefficients were y= 166. 72x+ 127. 8 and 0. 9997
for calycosin, y = 178. 39x + 187. 2 and 0. 9993 for formononetin. The liner ranges w ere
1. 0— 116. 5μg· mL- 1 and 1. 2— 112. 5μg· mL- 1 for calycosin and formononetin, respectiv ely. The
standard added recoveries w ere in the range of 96. 5%— 98. 7% and 96. 8%— 98. 5% for calycosin
and formononetin, respectively. This method is highly sensi tiv e, selective and reliable, and is used for
simultaneous determination of calycosin and formononetin in radix astrag al and the quality control of
radix astrag al.
Key words　 HPLC; Chemometrics; Heuristic Evolving Latent Pro jections ( HELP) ; Radix
Astragal; Flav onoids
1545第 4期 贺云彪等:高效液相色谱测定黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素的含量