全 文 ：　2001;27(1) 蚕　业　科　学　　　CANYE KEXUE
＊国家自然科学基金资助项目(39770575)。
收稿日期 2000-10-30
宿主域扩大的苜蓿尺蠖核多角体杂交型病毒＊
易咏竹　张志芳　肖庆利　何家禄
(农业部家蚕生物技术重点开放实验室 ,中国农业科学院蚕业研究所 ,镇江　212018)
摘　要　　将家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus , BmNPV)的解链酶基因 DNA和苜蓿尺蠖
核型多角体病毒(Autographa califonica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus , AcMNPV)的基因组 DNA共转染到秋粘虫细胞
系Sf-21 , 经过累代的筛选获得既能感染家蚕细胞 , 又能感染秋粘虫细胞的宿主域扩大的杂交型病毒 HyNPV。
关键词　　杆状病毒　宿主域　杂交型病毒
　　苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autographa califonica
Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus ,AcMNPV)和家蚕核
型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis
Virus ,BmNPV)分别是杆状病毒科多粒包埋型和单粒
包埋型的两个代表种 。两者基因组中大部分功能基
因的同源性在 90%以上[ 1] ,然而在自然状态下 ,两
者又具有各自独立的宿主域 ,不能交叉感染。但当
用高剂量的 AcMNPV 游离病毒接种早期蚕蛹时 ,
AcMNPV可以在家蚕蛹中进行复制 ,含有外源基因
的重组 AcMNPV亦能在家蚕蛹体中有微量的表达 ,
野生型 AcMNPV 感染复眼着色前的蛹还能使其呈
“人工滞育态” ,这表明 AcMNPV均能在家蚕蛹中有
少量复制[ 2] 。宿主域扩大的杂交型病毒 ,由于对宿
主家蚕的病原性较野生型 BmNPV差 ,可以极大地延
长表达时间 ,因此在表达一些不易降解及可能影响
蚕儿生理的外源蛋白时 ,表达量可能比 BmNPV高 ,
在日本已用于商业化疫苗生产的鸡新城疫病毒
(NDV)的F 和HN基因的表达载体病毒就是杂交型
病毒[ 3] 。此外 ,对家蚕病原性弱化的核多角体病毒 ,
作为转基因蚕载体时 ,可能有助于提高外源基因在
家蚕基因组中的整合效率[ 4] 。Maeda 等[ 5]发现只要
将BmNPV 中的一个 0.6kb片段与 AcMNPV 基因组
DNA在昆虫细胞中进行重组 ,就可获得对家蚕细胞
有感染性的宿主域扩大的杂交型 AcMNPV。该
0.6kb的片段正好位于推定的解链酶基因区 。因
此 ,我们利用已克隆的完整的 BmNPV的解链酶基因
与AcMNPV的基因组 DNA进行重组 ,获得了宿主域
扩大 ,对家蚕和秋粘虫细胞均有感染性的杂交型病
毒 HyNPV[ 6] 。
1　材料与方法
苜蓿尺蠖核多角体病毒 AcMNPV及家蚕细胞系
Bm-5和秋粘虫细胞系 Sf-21均为农业部家蚕生物技
术重点开放实验室保存。所用培养基为含 10%胎
牛血清(FBS ,GIBCO-BRL 公司产品)的 TC-100。
AcMNPV基因组 DNA 的纯化 、细胞日常培养 、
AcMNPV基因组 DNA 和 BmNPV 解链酶基因的共转
染 、病毒感染 、空斑纯化等按 Summers等[ 7]的操作手
册进行 。含 BmNPV 解链酶基因的质粒 pUC-SIC 的
DNA制备及片段纯化按文献[ 8]进行。
2　结果与讨论
AcMNPV基因组 DNA和 BmNPV的解链酶基因
在 Sf-21细胞中进行同源重组后 ,收获病毒上清液 ,
并以此为病毒母液感染家蚕细胞 ,从中初步筛选出
对家蚕细胞具有致病力的杂交型病毒 ,定为 F1 代。
以后每次均接种 4瓶 Bm-5细胞 ,从中选择对家蚕细
胞感染性良好的瓶中的病毒作为母种病毒 ,并检测
杂交型病毒对 Sf-21细胞的感染情况 。至 F8 代铺斑
纯化克隆 HyNPV ,得到了既可感染家蚕细胞 ,也可
感染秋粘虫细胞的宿主域扩大的杂交型病毒 HyN-
PV(图 1)。尽管每代均从中选择对 Bm-5细胞感染
性良好的杂交型病毒接种 ,然而随着选择世代的推
移 ,家蚕细胞中产生多角体的比例还是逐代下降 ,多
角体明显变小 、变少 ,且病毒复制变慢 ,在杂交病毒
感染后 72h细胞中多角体还很少见。而在 Sf-21细
胞中 ,则每个细胞产生的多角体数变少 ,且巨大多角
体显著增多 。有意思的是杂交型病毒感染家蚕细胞
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DOI :10.13441/j.cnki.cykx.2001.01.020
图 1　杂交型病毒 HyNPV感染后 72h的家蚕细胞 Bm-5 和秋粘虫细胞 Sf-21
Fig.1　The Bm-5 cell line and Sf-21 cell line infected by host-range expanded HyNPV for 72h
　
后 ,有相当数量的家蚕细胞的伪足浓缩成长的纤毛
状。关于多角体数目减少和纤毛状伪足形成的机理
有待进一步探讨 。
参 考 文 献
1　Gomi S ,Majima K ,Maeda S.Sequence analysis of the genome of Bombyx
mori nucleopolyhedrovirus(J).J Gen Viol , 1999 ,80:1323～ 1337
2　张志芳 ,何家禄 ,周乃明 ,等.苜蓿尺蠖夜蛾核多角体病毒在家蚕
蛹体内的复制及重组病毒外源基因的表达(J).蚕业科学 , 1993 ,
19(4):203～ 207
3　吴祥甫 ,张志芳.昆虫表达系统(M).沈倍奋主编.基因表达技
术.北京:科学出版社 , 2001
4　Tamura T.Transgenic silkworm:Present situation and future(J).J Seric
Sci Jpn , 2000 ,69:1～ 12
5　Maeda S , Kamita SG ,Kondo A.Host range expansion of Autographa cali-
fonica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus (NPV)following recombina-
tion of 0.6-kilobase-pai r DNA fragment originating from Bombyx mori
NPV(J).J Virol , 1993 ,67:6234～ 6238
6　张志芳 ,张颖 ,吕鸿声 ,等.家蚕核多角体病毒解链酶基因的克隆
及部分序列分析(J).病毒学报, 1994 , 10(4):381～ 383
7　Summers M D , Smith G E.A manual of methods for baculovirus vectors
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8　Sambrook J , Fritsch E ,Maniatis T.Molecular Cloning(M).2ndEdition ,U.
S.A:Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989
The Host range Expanded Hybrid Autographa californica
Nuclear Polyhedrosis Virus
Yi Yongzhu　Zhang Zhifang　Xiao Qingli　He Jialu
(Key Laboratory of Silkworm Biotechnology ,Ministry of Agriculture;Sericultural Research Institute ,
Chinese Academy of Agricultural Sciences , Zhenjiang 212018)
　　Abstract　The helicase gene of Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus were contransfected into Sf-21 cell with
the genomic DNA of Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus.The hostrange expanded hybrid virus(HyNPV),
which could infect both Bm cell line and Sf cell line ,was constructed via multiple generation selection.
Key words　　Baculovirus 　Host range　Hybrid baculovirus
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