全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
Bac2to2Bac系统在杆状病毒功能基因研究上的应用
习欠云 1 　张永亮 1 　江青艳 1 　王 ‘章 2
(1 华南农业大学动物科学学院 ,广州 510642; 2 中山大学生命科学学院 ,广州 510275)
　　摘 　要 : 　利用 Bac2to2Bac系统 ,在大肠细菌中复制增殖杆状病毒质粒 bacm id,并通过 RecA介导法、ET2recombination法
在 bacm id DNA上缺失或插入功能基因 ,构建功能基因缺陷型或补回型的杆状病毒质粒。该质粒转染到昆虫细胞中产生重组
病毒 ,进而在细胞甚至虫体水平上研究基因的功能 ,极大改善了传统上用空斑实验筛选重组病毒的不足。
关键词 : 　Bac2to2Bac　杆状病毒 　同源重组 　功能基因
Study of the Functiona l Baculovirus Genes Using Bac2to2Bac System
Xi Q ianyun1 　Zhang Yongliang1 　J iang Q ingyan1 　W ang Xunzhang2
(1 College of Anim al Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642;
2 School of L ife Sciences, Sun Yat2sen University , Guangzhou 510275 )
　　Abs trac t: 　The functional gene was deleted or inserted through homologous recombination from an baculovirus genome p ropagated
as a bacm id DNA in E1coli, generating a me53 gene knockout or repair bacm id1 The knockout or repair bacm id was transfected into in2
sect cells to generate a recombination baculovirus1 Itwas available to study viral gene function through transfected cell or infected insect
and imp rove the lim itation of the traditional p laques formation test p roducing recombination baculovirus1
Key wo rds: 　Bac2to2Bac　Baculovirus　Homologous recombination　Functional gene
收稿日期 : 2009202219
基金项目 :华南农业大学校长科学基金项目 (2007K005)
作者简介 :习欠云 (19732) ,男 ,理学博士 ,讲师 ,研究方向 :生物化学与分子生物学 ; E2mail: xqy0228@1631com
1　杆状病毒的特点
杆状病毒是一类病毒体呈杆状的具囊膜的双链
闭环 DNA病毒 ,具有高度的宿主特异性 ,仅见于鳞
翅目、膜翅目和双翅目昆虫 ,被视为有发展前景的无
害、安全生物杀虫剂。同时 ,杆状病毒由于其特殊的
两相复制特征使其具备作为外源基因表达载体的良
好条件 ,已作为广泛应用于外源基因的蛋白表达和
生物防治的工具 ,成为了世界各国的研究热点。其
中 ,苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 AcMNPV得到最
为广泛的研究 ,该病毒基因组 DNA大约为 134 kb,
在宿主细胞核中复制增殖 [ 1 ] ,病毒复制一般经历 3
个阶段 :早期、晚期和极晚期。杆状病毒的一个最显
著的特征是其具有双向复制周期 ,产生两种具有不
同形态、功能的表型病毒 ,分别为分泌型 (BV )和包
涵体型 (ODV)。前者离开细胞核 ,晚期通过出泡的
方式穿过细胞膜而分泌到细胞外面 ;后者保存在细
胞核中 ,有一层蛋白基质包裹 ,在极晚期形成多角
体。3个阶段受早期、晚期和极晚期基因序列的调
控 [ 2 ]。早期基因由宿主 RNA聚合酶 II作用下转录
并在病毒 DNA合成之前表达 [ 3 ]。然而 ,大部分晚期
和极晚期基因要通过早期基因的产物 ,并在抗 α2
amanitin RNA聚合酶的作用下转录 [ 4 ]。因此 ,对晚
期和极晚期基因表达来说 ,早期基因扮演了重要的
角色 [ 2 ]。
2　Bac2to2Bac表达系统
1993年 , Luckow等 [ 5 ]采用与 BAC质粒原理类
似的 F2复制子首次成功构建了可在大肠杆菌中复
制的杆状病毒 ,该重组杆状病毒以杆状病毒 (Bacu2
lovirus)前 3个字母和质粒 ( Plasm id)后 3个字母为
名 ,称为 AcMNPV Bacm id[ 5 ]。目前该系统已成为广
泛使用的蛋白表达系统之一。Bac2to2Bac表达系统
是转座子介导的杆状病毒重组系统 ,即大肠杆菌 E2
2009年第 6期 习欠云等 : Bac2to2Bac系统在杆状病毒功能基因研究上的应用1coli与昆虫细胞穿梭载体系统 (Bacm id系统 )。该
系统分为 3个部分包括 Bacm id穿梭载体、供体质粒
和辅助质粒。在此系统中 , AcNPV多角体蛋白基因
相位被克隆进卡那霉素抗性基因 , Tn7细菌转座子
靶位点 attTn7来源于 PUC质粒的 LacZ肽段编码基
因 ,及能够保证基因组自主复制和以稳定的低拷贝
数存在于细菌中的 m ini2F复制子。这种被修饰了
的 AcMNPV被称之为 Bacm id。Bacm id既可感染鳞
翅目昆虫 ,又可以在 E1coli中复制 ,改变了人们传统
上用真核培养病毒的观念。供体质粒为 pFastBac,
在其 Tn7左右序列之间是多角体蛋白启动子。供体
质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用
下 ,将外来基因插入到 Bacm id中 ,置于 polh启动子
之下 ,并携带一个庆大霉素抗性基因。从而干扰
LacZ的表达 ,这样就可以通过细菌菌落蓝白筛选直
接小量提取重组 Bacm id质粒 DNA ,再用脂质法转
染即可获得重组病毒。该系统重组率几乎为
100% ,且重组时间迅速。
3　杆状病毒的基因功能研究
311　BAC基因操作的发展
Bac2to2Bac系统的建立 ,不但促进了杆状病毒
表达载体系统的应用 ,也大大促进了基因功能及调
控的研究。由于杆状病毒基因组过大 ,很难通过简
单的酶切、连接等方法来构建重组杆状病毒 ,人们不
得不利用各种方法来达到这个目的 [ 6, 7 ]。其中利用
同源重组 ,在含 BAC的大肠杆菌中直接修饰 BAC
DNA的方法 ,使得 BAC DNA的修饰不再困难 ,因而
得到广泛的应用。这其中包括了大肠杆菌 BJ5183
系统 [ 8 ]、ET2recombination系统 [ 9, 10 ]和缺失型原噬
菌体介导的 Red2recombination系统。这 3个系统原
理类似 ,只是使用了不同来源的重组修复酶类。大
肠杆菌 BJ5183系统利用了两个大肠杆菌内源性重
组酶 recE和 recT,缺失型原噬菌体介导的 Red2re2
combination系统利用整合在大肠杆菌基因组上的缺
失型原λ噬菌体 ,提供与 recE和 recT两个重组酶同
源的λ噬菌体重组酶 redα和 redβ; ET2recombination
系统则是由质粒 pBAD2ETγ来提供 recE和 recT酶
或质粒 pBAD2αβγ来提供 redα和 redβ酶。
312　ET2recombination法操作
早期的 ET2recombination操作只能在 sbcA菌株
中有效进行 ,而通常 BAC的宿主菌 ,如 DH10B 是
recBC类型 ,不允许进行这种修饰。为此构建了质
粒 pBAD2ETγ和 pBAD2αβγ。pBAD2ETγ包括阿拉
伯糖诱导启动子 (pBAD )控制下截短的 recE基因 ;
组成型强启动子 EM7控制下的 recT基因 ,以及组成
型启动子 Tn5控制下的 redγ基因。 recE和 recT基
因表达产物介导 ET2recombination进行 ,而 redγ基
因产物抑制 recBC蛋白对线状 DNA片段的降解作
用。将 pBAD2ETγ质粒转化到 recBC +菌株中即可
使它们也能顺利进行 ET2recombination操作。
313　RecA介导的同源重组
另一种方法称为 RecA介导的同源重组。R ecA
基因是大肠杆菌中最主要的介导同源重组的基因 ,
它的突变可使大肠杆菌重组频率降低 106 倍 [ 11 ]。
人们为了增加克隆质粒的稳定性 ,通常所用的基因
工程菌株如 JM109, DH5α, DH10B等都是 R ecA基因
缺失型的。1997年 Yang等 [ 12 ]最早将 R ecA 基因克
隆在一个含 L acZ基因的穿梭载体上 ,通过其介导的
同源重组将 L acZ 基因插入了一个 131 kb的 BAC
中。其后 , Lalioti等 [ 13 ] 2001年进一步优化了该方
法 ,将原来与同源基因片段在同一个质粒上的 R ecA
基因分离出来 ,改由质粒 pDF25提供 ,以减少 RecA
蛋白在大肠杆菌中的表达时间 ,增加 BAC DNA的
稳定性。这种方法精确地修饰了一个 BAC的基因 ,
制造了一个点突变 ,而未在修饰后的基因中留下选
择标记 [ 13 ]。该方法原理主要是利用两个温度敏感
型的穿梭载体 , 30℃时它们可在宿主菌中顺利复制
自己 ,而在 43℃培养环境中会从宿主菌中丢失。其
中一个穿梭载体 pDF25中包含一个大肠杆菌的 R e2
cA基因 ,它的表达产物用于在宿主菌中介导同源重
组 ;另一个穿梭载体 pKOV2Kan中包含一段已突变
的与 BAC中待修饰片段同源的 DNA序列及正选择
标记 Kan基因和负选择标记 S acB 基因。将这两个
穿梭载体转化到含有待修饰的 BAC DNA的感受态
大肠杆菌中 ,用含两种抗生素 (氯霉素和卡那霉素
)的 LB平板于 30℃培养后筛选到成功转化的单克
隆菌落。选取数个单克隆再次涂布于双抗性 LB平
板上 , 43℃培养后 ,只有那些发生同源重组将 pKOV2
Kan共整合到 BAC DNA上的克隆才能在此环境中
生存 ,未发生重组的克隆会在复制中失去 pKOV2
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
Kan和 pDF25而不能抵抗选择压力。利用 PCR或
DNA印迹鉴定这些克隆以确证其发生同源重组。
将鉴定好的阳性克隆再转入 pDF25以便发生第二
次同源重组。将转化出的克隆在含氯霉素和 5%蔗
糖的 LB平板上于 43℃培养 ,发生二次同源重组后
pKOV2Kan质粒从共整合体中分离出 ,并在复制过
程中丢失 ,而未发生二次同源重组的大肠杆菌由于
含 pKOV2Kan质粒中的负选择标记 SacB 基因而不
能在蔗糖培养基中生长。因此 ,转化出的克隆都将
是发生了二次同源重组的大肠杆菌。如果第二次重
组利用的同源片段部位与第一次相同 ,则 BAC DNA
未被修饰 ,仍和原始 BAC DNA相同 ;而如果与第一
次重组不同 ,则原始 BAC DNA中欲突变的 DNA片
段会被替换 ,获得我们想要的突变体 BAC DNA。突
变体可用 PCR或 Southern杂交的方法检测出来。
4　结论
通常 , RecA介导的同源重组方法在进行基因敲
除 ( knockout)上要慢得多 ,由于它要先将待敲除基
因侧翼序列克隆到质粒中 ,比起直接用线状 PCR产
物进行基因敲除的 ET2recombination和 Red2recom2
bination系统要耗费更多的时间。因此 ,近两年来已
较少人再用该方法进行基因敲除。然而 ,仍然有应
用它进行点突变的报道 [ 13 ]。不过 ,在进行基因替换
时 , RecA介导的同源重组方法有它的优势。首先 ,
用 ET2recombination方法进行基因替换时需要做两
次 ET2recombination操作 ,在时间上并不比 RecA介
导的同源重组快 ;其次 ,由于缺乏有效的负选择标记
基因 , ET2recombination方法进行基因替换的成功率
不稳定 ,许多情况下低于 RecA 介导的同源重组。
目前利用上述两种方法 ,结合 Bac2to2Bac系统对杆
状病毒功能基因已经进行了许多研究 [ 14～16 ]。
参 考 文 献
1 　Ayres MD, Howard SC, Kuzio J et al1V irology, 1994, 202: 586
～6051
2 　Friesen PD, Regulation of Baculovirus Early Gene Exp ression1 In:
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1997, 141～1691
3 　Huh NE, W eaver RF1 J Gen V irol, 1990, 71: 195～2011
4 　Yang CL, StetlerDA, W eaver RF1 V irus Res, 1991, 20: 251～2641
5 　Luckow VA, Lee SC, Barry GF, O lins PO1 J V irol, 1993, 67: 4566
～45791
6 　W u AZ, W ang P, Mao CQ, Q ian YJ, Sun YK1 Chin J B iotechnol,
1990, 6: 237～2421
7 　王 ‘章 , 谢伟东 , 龙綮新 1病毒学报 , 1991, 73: 253～2611
8 　Yu D, Ellis HM, Lee EC, Jenkins NA, Copeland NG, Court DL1
Proc Natl Acad Sci USA, 2000, ( 97) : 5978～59831
9 　Muyrers JP, Zhang Y, Benes V, et al1 EMBO, 2000, 1: 239
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10　Zhang Y, Buchholz F, Muyrers JP, Stewart AF1 Nat Genet, 1998,
20: 123～1281
11　Griffith JD, Harris LD1CRC Crit Rev B iochem, 1988, 23 ( 1) : S43
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12　Yang XW , Model P, Heintz N1Nat B iotechnol, 1997, 15: 859～8651
13　LaliotiM, Heath J1 Nucleic Acids Res, 2001, 29 (3) : E141
14　W u W , W ang J, Deng R, W ang X, He X, Long Q1 Journal of V ir2
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15　L i Y, W ang J, Deng R, ZhangQ, Yang K, W ang X1 V irus Genes,
2005, 31 (3) : 275～2841
16　Xi QY, W ang JW , Deng RQ, W ang XZ1V irus Genes, 2007, 34
(2) : 223～321
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