全 文 ：第 4 1 卷第 5 期 江 苏 林 业 科 技 Vol ． 4 1 No ． 5
2 0 1 4 年 1 0 月 Journal of Jiangsu Forestry Science ＆ Technology Oct ． 2 0 1 4
文章编号:1001 － 7380(2014)05 － 0027 － 03
灌木柳无性系茎段组织培养快速繁殖试验
陈智敏1，张 敏2* ，王保松2，黄利斌2，施士争2，张 珏2
(1．河南省水利勘测设计研究有限公司，河南 郑州 450000;2． 江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153)
收稿日期:2014-07-07
基金项目:国家自然科学基金“NaCl胁迫下一氧化氮调控灌木柳液泡膜 H + － ATPase的分子机制”(31300515) ;江苏省自然科学基金“柳
树 H + － ATPase响应 NaCl胁迫的分子机制”(BK2011872)
作者简介:陈智敏(1987 －) ，女，河南商丘人，硕士，主要从事水环境植物配置研究与设计。
* 通信作者:张 敏(1980 －) ，女，内蒙古人，副研究员，博士，主要从事植物逆境生物学及林木花卉良种繁育研究。
摘要:以灌木柳无性系 2345、2367 的嫩枝为外植体，进行组织培养快速繁殖技术的研究。结果表明:2 种灌木柳芽
苗诱导最适培养基为 WPM + 6-BA 0． 4 mg /L + GA3 0． 1 mg /L + CH 500 mg /L + 活性炭 1 g /L + 蔗糖 30 g /L +
卡拉胶 6． 3 g /L;最适增殖及生根培养基为 WPM + 6-BA 0． 6 mg /L + NAA 0． 05 mg /L + CH 500 mg /L + 活性炭
1 g /L + 蔗糖 30 g /L + 卡拉胶 6． 3 g /L。将健壮生根苗移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中泥炭与黄心土的
体积比为 1∶ 1，成活率大于 98%。
关键词:灌木柳;组织培养;茎段
中图分类号:S792. 12;Q943． 1 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 7380． 2014． 05． 007
柳树是杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)植物的
通称，全世界共有 526 种，主要分布在北半球温带地
区。中国有 257 种，120 个变种和 33 个变型，其中
绝大多数为灌木柳。灌木柳分布广、生长快、产量
高、热值高、抗逆性强、易于更新以及木材用途广泛，
是防护林、水土保持林、风景林及用材林的重要组成
树种，也是备受关注的能源树种［1 － 2］。柳树种间及
其杂交子代的家系、无性系间都存在着非常丰富的
遗传变异，因此进行速生、高生物量、耐盐碱、抗病虫
害良种选育具有丰富的遗传基础［3］。
灌木柳的常规繁殖以扦插为主，不同种柳树插
条生根能力除了由遗传因素决定以外，还受到插条
年龄、粗度、木质化程度、有无生长叶或活动芽等指
标的影响，特别是繁殖时间有严格的季节限制。灌
木柳还可用播种育苗进行繁殖，但其种子较小，宜随
采随播，且不能保持良种原有的优良特性。组织培
养技术是目前林业生物技术的主要内容之一，其主
要用途是林木的大规模繁殖和分子育种［4］。灌木
柳高效组织培养再生体系的成功建立，对其生物学
研究、遗传改良和多目标分子育种等工作的开展均
具有重要意义。
本试验以 2 种灌木柳无性系的茎段为初始外植
体，通过分析其离体再生的影响因素，探讨最佳组织
培养条件，建立高效离体再生体系，为柳树遗传转化
研究和分子育种的离体诱导奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
本试验所用材料为江苏省林业科学研究院遗传
育种研究所杂交培育的 2 个高生物量灌木柳无性系
2345、2367，其来源见表 1。
表 1 2 种灌木柳无性系及其来源
无性系 杂交时间 杂交时间 母本来源 父本来源
2345
簸箕柳 ×杞柳
(Salix suchowensis ×
S． integra)
2001年 江苏如皋 哈尔滨
2367
蒿柳 ×银柳(S． vim-
inalis × S． argyra-
cea)
2001年 英国 Long Aston 上海
取生长健壮、无病虫害的 1 ～ 2 年生柳树枝条，
摘除老叶，置于室温下水培 7 d，每天换水 1 次，以新
长出的嫩茎作为外植体。
1． 2 方法
1． 2． 1 材料处理 将新生嫩茎去叶，剪成长 4 cm
的小段，用洗衣粉水浸泡 20 min，自来水冲洗 5 次，
备用。
1． 2． 2 接种 将冲洗干净的外植体转到超净工作
台上，用 70 %(体积百分数)乙醇和 0． 1 % (质量
百分数)HgCl2作为消毒剂，酒精处理时间相同都为
40 s，升汞的处理时间分别为 2． 5，3，4，5 min 及 6
min，再用无菌水冲洗 5 ～ 7 次。
将消毒处理后的外植体剪去接触消毒液的伤口
部位，留 1 ～ 2 cm 带芽茎段接种在含有诱导培养基
的培养瓶中。每处理接种 20 瓶，每瓶 5 个外植体。
14 d后观察其污染及成活情况，并统计污染率。
1． 2． 3 培养基和培养条件 诱导培养基:以 WPM
为基本培养基，其中均添加 CH 500 mg /L，活性炭
1 g /L，蔗糖 30 g /L和卡拉胶 6． 3 g /L，在 GA3质量浓
度相同的情况下，添加不同质量浓度的 6-BA ，在
6-BA质量浓度相同的情况下添加不同质量浓度的
GA3，探索适合灌木柳丛芽诱导的激素质量浓度筛
选出合适的培养基配方。
选取相同条件下生长良好的水培得到的嫩茎作
为外植体，用筛选出的适宜消毒时间进行消毒，消毒
后将其切成长 1 ～ 2 cm的茎段接种到添加不同质量
浓度激素的 WPM 培养基中(培养基中激素配比见
表 3) ，将其置于光照度为1 500 ～ 2 000 lx，每日光照
时间为 16 h，温度(26 ± 2)℃，相对湿度 65% ～
75%的条件培养;重复 3 次。培养 15 d 后统计萌
芽率。
增殖培养基:将诱导产生的试管苗，剪切成 1． 5
～ 2． 0 cm带有 1 ～ 2 个腋芽的节段，转接于以 WPM
为基本培养基，添加不同质量浓度激素的培养基中
进行继代培养(培养基中激素配比见表 4)。培养环
境同初代培养，培养 20 d 后统计增殖系数。
1． 2． 4 炼苗 将增殖培养获得的健壮再生植株开
瓶培养 2 d 进行炼苗，取出试管苗，洗净，移栽到含
有泥炭和黄心土的基质中进行炼苗，其中泥炭与黄
心土的体积比为 1∶ 1。
1． 2． 5 结果评测指标 材料接种后，定期观察记录
生长情况，主要统计指标及计算公式如下［5］:
死亡率 /% =死亡的外植体数 /接种的外植体总
数 × 100;
污染率 /% =污染的外植体数 /接种的外植体总
数 × 100;
诱导率 /% =萌发出叶片的外植体数 /接种的外
植体总数 × 100;
增殖系数 /% =增殖后的芽苗数 /接种的外植体
总数 × 100;
生根率 /% =生根的外植体数 /接种的外植体总
数 × 100;
移栽成活率% =移栽成活的植株数 /移栽的植
株总数 × 100。
2 结果与分析
2． 1 不同消毒处理对诱导培养的影响
由结果(见表 2)可知，不同灭菌处理对 2 种灌
木柳无性系的死亡率和污染率影响不尽相同。使用
质量分数为 0． 1%的 HgCl2消毒 5 min，2 个品种的成
活率均最高，分别为 98%和 99%，灭菌效果明显。
随着 HgCl2消毒时间的延长，污染率均降低，但对外
植体造成了伤害，致使死亡率升高。综合分析死亡
率、污染率的测定结果，2 种试验材料均以体积分数
为 75%的乙醇 40 s结合质量分数为 0． 1%的 HgCl2
处理 5 min为最佳消毒方案。
表 2 不同方式的灭菌效果
不同灭菌处理时间
70%
乙醇 / s
0． 1 %
HgCl2 /min
接种
瓶数
死亡率 /% 污染率 /%
2345 2367 2345 2367
40 2． 5 20 1 1 22 20
40 3 20 2 2 9 8
40 4 20 2 2 8 8
40 5 20 2 2 2 1
40 6 20 4 3 2 1
2． 2 不同激素质量浓度配比对诱导培养的影响
灌木柳 2345 及 2367 均在接种后 7 d 即开始萌
芽，从结果(见表 3)可以看出，2 个品种在各个培养
基间的差异均极显著，在 GA3质量浓度相同的情况
下，诱导率随着 6-BA 质量浓度的增加均呈现先高
后低的趋势，在 6-BA质量浓度为 0． 4 mg /L时，诱导
率达 96%和 95%。在 6-BA 质量浓度相同的情况
下，诱导率随着 GA3 质量浓度的增加而增加，且在
各个培养基中均有根产生。
2． 3 继代与增殖培养
组织培养苗的增殖指在无性条件下芽的生长与
分化，最后繁殖成完整植株［6 － 7］。本研究中，2 个品
种在不同激素组合间的差异均极显著。生长调节物
质配比对茎芽增殖的影响见表 4，在 GA3质量浓度
相同时，随着 6-BA质量浓度的增加，增殖系数呈现
先降后增的趋势。在 6-BA 质量浓度相同时，随着
NAA质量浓度的增大增殖系数逐渐降低。在各个
培养基中均有大量根系产生，其中在培养基 WPM +
6-BA 0． 6 mg /L + NAA 0． 05 mg /L + CH 500 mg /L
82 江 苏 林 业 科 技 第 41 卷
+ 活性炭 1 g /L + 蔗糖 30 g /L + 卡拉胶中 6． 3 g /L
的增殖系数可达 4 ～ 6 倍，生根率高达 100%。
表 3 不同激素组合对灌木柳带芽茎段萌发的影响
激素组合 /(mg /L) 诱导率 /% 萌发后长势
6-BA GA3 2345 2367 2345 2367
0． 2 0． 1 92 ab 93 abc 苗高且壮 苗高且壮
0． 4 0． 1 96 c 95 c 苗高且壮 苗高且壮
0． 6 0． 1 95 c 94 bc 苗高且壮 长势一般
0． 8 0． 1 95 bc 92 ab 苗高且壮 长势一般
0． 6 0． 01 90 a 91 a 长势一般 长势一般
0． 6 0． 05 95 ab 92 ab 长势一般 长势一般
0． 6 0． 08 94 bc 93 abc 长势一般 长势一般
0． 6 0． 1 95 c 94 bc 苗高且壮 苗高且壮
0． 6 0． 12 95 c 94 bc 苗高且壮 苗高且壮
同列中相同字母间表示差异不显著，P ＜ 0． 01。
2． 4 驯化移栽
将试管苗株高 6 ～ 8 cm、根系发达，根长且叶片
展开的再生植株开瓶培养 2 d 进行炼苗，取出试管
苗，洗净，移栽到含有泥炭和黄心土的基质中，其中
泥炭与黄心土的体积比为 1∶ 1，然后浇透水，用塑料
薄膜覆盖容器口，保持温度 24 ～ 28 ℃，相对湿度
75% ～85%，适当遮荫，培养 15 ～ 20 d 至长出的新
叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得灌木柳苗
木，成活率 98%以上(见图 1)。
3 结论与讨论
酒精对细胞具有较强的穿透性和杀伤性，容易
使被处理的材料受到损伤，因此把握好消毒时间是
保持材料活性的关键。以灌木柳茎段为外植体进行
组织培养时，适宜的消毒条件为以 70 %(体积分
数)乙醇 40 s + 0． 1 %(质量百分数)升汞 5 min。
表 4 不同激素组合对灌木柳带芽茎段增殖的影响
激素组合 /(mg /L) 增殖系数 苗生长情况
6-BA GA3 NAA 2345 2367 2345 2367
0． 6 0． 12 2． 2 a 2． 17 a 叶片稍泛黄，根系发达 叶片稍泛黄，根系发达
0． 8 0． 12 1． 6 a 1． 6 a 根长苗壮 叶绿苗壮
1． 2 0． 12 2 a 2． 16 a 根长苗壮 叶绿苗壮
0． 6 0． 05 5 b 5 b 根长苗壮 叶绿苗壮
0． 6 0． 1 2． 7 a 2． 38 a 根长苗壮 叶绿苗壮
0． 6 0． 15 2 a 2． 03 a 根长苗壮 叶绿苗壮
相同字母间表示差异不显著，P ＜ 0． 01。
图 1 灌木柳离体培养与植株再生
2 种灌木柳芽苗诱导最适培养基为 WPM 基本
培养基 + 6-BA 0． 4 mg /L + GA3 0． 1 mg /L + CH
500 mg /L + 活性炭 1 g /L + 蔗糖 30 g /L + 卡拉胶
6． 3 g /L。在选择茎段培养基时，激素搭配应以外植
体不愈伤化为基本原则，使其直接发育长成植株。
因为若经过愈伤组织分化，植株容易发生变异，所以
倡导以不含生长素的培养基进行茎尖分生组织的
诱导［8］。
本研究中最适增殖培养基为 WPM 基本培养基
+ 6-BA 0． 6 mg /L + NAA 0． 05 mg /L + CH 500
mg /L + 活性炭 1 g /L + 蔗糖 30 g /L + 卡拉胶 6． 3
g /L。在该培养基中同时可获得健壮的生根苗，无
需专门的壮苗培养和生根培养阶段。活性炭可促进
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92第 5 期 陈智敏等:灌木柳无性系茎段组织培养快速繁殖试验
过引种可在短期内获得大量的遗传材料，缩小我国
鸡爪槭品种选育方面与国外的差距。有些引进品种
可能仅适应选育国家当地的气候环境，前期研究发
现日灼伤害是影响引种鸡爪槭生长和观赏价值的重
要原因。因此，加强引进品种的适应性研究，并通过
人工杂交、实生后代选育等方式，不断创制观赏价值
高、适应我国长江流域夏季高温高湿气候环境生长
的优新品种。(3)优化鸡爪槭品种的繁殖技术。研
究不同砧木树种对鸡爪槭园艺品种嫁接苗的生长影
响，为不同品种选择生长快、亲和力强的专用砧木。
研发和完善鸡爪槭品种的组织培养、体胚培养等技
术，逐步实现良种苗木的工厂化繁育。
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( 上接第 29 页)
组织培养苗健壮生长，有利于根的生成［9］。组织培养
苗根系有避光生长的特性，活性炭可提供暗环境，为
培养基中光敏性生长素的积累提供合适的环
境［10 ～ 11］。由于根顶端能产生利于根生长的 IAA，但
IAA 易受光氧化而被破坏，因此活性炭的作用正是通
过减弱光照保护了 IAA，从而间接地促进了根的生
长。本研究也发现如果不加活性炭植株会变弱，且根
系减少。
近些年，生物技术的不断发展与应用为柳树遗
传育种开创了新的途径。柳树组织培养的难易与基
因型、培养基的类型和光照温度等培养条件密切相
关［12］。如何继续提高芽的增殖系数和试管苗的成
苗速度，建立高效的遗传转化体系，还有待于进一步
研究。
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54第 5 期 吕运舟等:鸡爪槭园艺品种分类及栽培研究综述