全 文 ：中国药房 2008年第 19卷第 18期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.18 · 1393·
Δ湖南省教育厅资助项目(03C292)
*讲师 , 硕士 。研究方向:药用植物生物技术。电话:0731-
8458233。E-mail:liuyem an@163.com
凹叶厚朴愈伤组织的诱导及其有效成分含量的比较 Δ
刘叶蔓 * ,赵碧清 ,曾 婷(湖南中医药大学 ,长沙市 410208)
中图分类号 R284.1;R283 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2008)18-1393-03
摘 要 目的:研究凹叶厚朴愈伤组织的诱导 、生长情况并比较愈伤组织内有效成分的含量 。方法:采用单因素比较 、正交设计试
验 ,研究影响凹叶厚朴愈伤组织诱导和生长的各种因素;采用高效液相色谱法测定不同来源愈伤组织内有效成分的含量 。结果:外
植体脱分化形成愈伤组织的能力 , 以顶芽及茎段最好 , 雌蕊次之;愈伤组织诱导的最适培养基为 B5 +NAA0.1 mg ·L -1+6-
BA1.0 mg ·L -1 ,而 B 5+NAA0.5 mg ·L -1+6-BA4.0 mg ·L -1对愈伤组织生长促进作用明显 。以 WPM 为基本培养基诱导愈
伤组织 ,继代后厚朴酚与和厚朴酚含量的总和可达 0.167 9%～ 0.234 4%, 但愈伤组织诱导率低 ,为 33.08%～ 48.65%;培养条件
为MS +NAA0.5 mg · L -1+6-BA1.0 mg ·L -1时 ,愈伤组织诱导率为 62.12%,继代后 2酚总量为 0.168 6%。结论:本试验结
果对凹叶厚朴愈伤组织的诱导及高产细胞系的筛选具有一定的参考价值 。
关键词 凹叶厚朴;组织培养;厚朴酚;和厚朴酚;含量测定
Induction of Magnol ia off icinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.Callus and Contents of Active
Components in Callus from Different Sources
LIU Ye-man ,ZHAO Bi-qing ,ZENG Ting (Hunan University of TCM , Changsha 410208 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the induction and grow th o f Magnolia of f ici nalis Rehd.et Wils.var.bi loba Rehd.e t
Wils.callus and to compare t he content of active component s in callus from different sources.METHODS :The f acto rs influ-
encing the induction and grow th o f Magnolia of ficinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.callus w ere studied by sing le
fac tor analysis and or thogonal design.T he contents o f ac tive com ponents in callus f rom diffe rent sources w ere de termined by
HPLC.RESULTS:In the various explants , the apical buds and stem fragm ents exhibited the best ability of dedifferentiation
to fo rm callus , followed by pistils.The optimum culture m edium of the callus induction w as B5+NAA0.1mg · L -1+6-BA1.0
mg ·L -1 , w hile the culture medium B5 +NAA0.5 mg ·L -1+6-BA4.0 mg ·L -1 markedly im proved the grow t h o f the callus;
af ter secondary culture o f the callus induced by the WPM basic m edium , the to tal content of Magnolol plus Honokio l ranged
f rom 0.167 9%to 0.234 4%, but the induction rate o f the callus w as low at 33.08%～ 48.65%.Under the culture condition o f
MS +NAA0.5 mg ·L -1+6-BA1.0 mg ·L -1 , the rate of callus induction w as 62.12%and the to tal content of M agno lo l plus
Honokio l af ter secondary culture was 0.168 6%.CONCLUSION :The results se rve as refe rence in the tissue culture of Mag-
nolia of ficinalis Rehd.et Wils.var.bi loba Rehd.et Wils and the sc reening o f the high production ce ll line.
KEY WORDS Magnolia of ficinalis Rehd.e t Wils.var.bi loba Rehd.et Wils.;Tissue culture;M agno lo l;Honokio l;Content
dete rmination
量(%)。结果 ,甘肃红芪的总灰分含量为 5.7%。②酸不溶性灰
分的测定:将上述所得灰分在坩埚中分别加入稀盐酸 10mL ,用
表面皿覆盖坩埚 ,置水浴中加热 10 min ,表面皿用热水 5 mL冲
洗 ,洗液并入坩埚中 ,用无灰滤纸滤过 ,坩埚内的残渣用水洗至
滤纸上 , 并洗涤至滤液不再显氯化物为至 , 滤渣连同滤纸移至
同一坩埚中 ,干燥 ,炽灼至恒重 。根据残渣重量 ,计算供试品中
酸不溶性灰分的含量(%)。结果 ,甘肃红芪的酸不溶性灰分的
含量为 0.68%。
3 讨论
红芪作为黄芪的近缘植物及代用品 , 有着悠久的药用历
史 。长期中医实践证明 , 红芪与黄芪药效相近 , 均具有补气升
阳 、益气固表的功效 。
从药材性状来看 ,甘肃红芪饱满 、条大 、匀实;水分测定 、醇
溶性浸出物含量测定 、 UV测定 、 TLC测定显示其结果均符合
《中国药典》规定 。但灰分测定高于 5%,不符合《中国药典》规
定 ,这可能与采收 、加工 、贮藏方式或人工栽培有关 。至于有害
物质的测定 ,由于条件有限 ,有待于以后进一步研究 。
参考文献
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(收稿日期:2007-06-20 修回日期:2007-09-24)
· 1394· Ch ina Pharmacy 2008 Vol.19 No.18 中国药房 2008年第 19卷第 18期
凹叶厚朴 Mag nolia of f icinalis Rehd.e t Wils.var.bilo_
ba Rehd.e t Wils.为木兰科落叶乔木 ,其主要有效成分为厚朴
酚及和厚朴酚 。凹叶厚朴在 20 a左右成材入药 ,近年来野生资
源濒临枯竭 ,已被列为国家Ⅲ级保护植物 。开展凹叶厚朴的组
织培养 ,在不受季节 、气候 、环境等的影响下 ,保存种质 ,扩大资
源的贮存量 , 培育高产细胞系等 , 可以减轻对凹叶厚朴野生资
源的压力 。刘贤旺等 [1 , 2 ]研究了凹叶厚朴的组织培养和愈伤组
织超低温保存技术 , 得到了愈伤组织诱导及增殖的基本培养
基 。童再康等 [3 ] 开展了厚朴组织培养与高产细胞系建立的研
究 , 并照 2000年版 《中国药典》测定了厚朴愈伤组织中厚朴酚
及和厚朴酚的含量。结果表明 , 不同来源的厚朴愈伤组织酚总
量介于 0 ～ 0.110 6%之间 ,含量甚微 。到目前为止 ,凹叶厚朴愈
伤组织有效成分的含量测定未见报道 。故本文在上述文献基础
上 , 开展凹叶厚朴愈伤组织诱导及有效成分含量的比较研究 , 以
期为凹叶厚朴资源的保护以及高产细胞系的筛选提供依据 。
1 材料
1.1 外植体
2007年 4月初采自湖南省植物园 , 以成年树当年生嫩茎
及顶芽 、花蕾作外植体 。
1.2 仪器与试药
HP1100系列高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司);
DNP -9052型电热恒温培养箱 (中新医疗仪器有限公司);
KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);
AF1004电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。厚朴酚对照
品(供含量测定用 , 中国药品生物制品检定所 ,批号:110729-
200309);和厚朴酚对照品(供含量测定用 , 中国药品生物制品
检定所 , 批号:0730-200306);甲醇为色谱纯 , 水为重蒸馏水 ,
其它试剂均为分析纯 。
2 方法
2.1 外植体处理
取外植体 ,先用 75%酒精消毒 1 min ,再用 0.1%氯化汞浸
泡 10 min ,无菌水冲洗 3 ～ 4遍 。
2.2 愈伤组织诱导
剥去最外层托叶 , 基部纵向切开 , 茎段 、雌蕊切成 0.5 ～ 1
cm 3小段 , 花被 、嫩托叶切成 0.5 ～ 1 cm 2小段 , 雄蕊若干枚 , 接
种到培养基上 。采用单因素比较法考察不同外植体对愈伤组织
诱导的影响 。采用 L 9(34)正交设计试验考察基本培养基 、激素
种类及配比在 10 d 内对愈伤组织诱导的影响 。以上每个试验
号重复 20次 ,每瓶接种 4块 。计算方法:愈伤组织诱导率=出
愈数/接种数×100%。
2.3 愈伤组织继代
愈伤组织诱导 25 d后 , 将 1 ～ 9号愈伤组织分别转移到
B5/MS+6-BA4.0 mg · L -1+NAA0.5 mg ·L -12种生长培
养基上 , 每种培养基按试验号分别重复接种 10瓶 , 每瓶接种 4
块 。以上培养基均含 3%蔗糖 、0.65%琼脂 , pH=5.5 ～ 5.8 ,培
养温度为 23 ～ 25 ℃,暗室培养 。
2.4 愈伤组织中厚朴酚及和厚朴酚含量的测定
2.4.1 色谱条件 :色谱柱为 Diamonsil C18(150 mm ×4.6
mm , 5 μm), 柱温为 25 ℃, 流动相为甲醇-水(78∶22), 流速
为 1.0 mL ·m in -1 , 检测器为二极管阵列检测器(DAD), 检测
波长为 294 nm 。
2.4.2 对照品溶液的制备:精密称取厚朴酚对照品 、和厚朴
酚对照品适量 , 加甲醇分别制成每 1 mL 含厚朴酚 40μg 、和厚
朴酚 24μg 的溶液 ,即得 。
2.4.3 供试品溶液的制备:分别收获经 “2.3”项下方法所得
的愈伤组织 , 60 ℃干燥至恒重 , 碾碎 ,过 60目筛 。分别精密称
定愈伤组织粉末 400 mg ,置于具塞锥形瓶中 ,精密加入甲醇 10
mL ,称重 ,40 ℃水浴 ,超声 20 min ,冷却 ,加甲醇补足损失的重
量 ,即得 。
3 结果与分析
3.1 不同外植体来源对愈伤组织诱导的影响
外植体来源不同 ,愈伤组织的诱导率也会不同:雌蕊 、茎段
及顶芽诱导最快且诱导率高;花被 、雄蕊其次;托叶比较慢 , 有
一定程度诱导;诱导最慢的是叶柄且诱导率最低 。不同外植体
对愈伤组织诱导的影响见表 1 。
表 1 不同外植体对愈伤组织诱导的影响
Tab 1 Effect of d ifferent explants on callus induct ion
外植体来源 接种数/个 愈伤组织产生量 愈伤组织诱导情况
雌蕊 80 很多 膨大较明显 , 4～ 5 d内大部分诱导出白色小颗粒状愈伤组织
茎段及顶芽 80 很多 4～ 5 d内大部分诱导出白色及浅黄色愈伤组织
花被 80 多 膨大较明显 , 8～ 9 d内于切面处部分诱导出浅黄色愈伤组织 , 15 d后大部分诱导出雄蕊 80 多 15 d后少部分诱导 , 25 d后大部分诱导出黄褐色愈伤组织
托叶 80 较少 膨大不明显 , 8～ 9 d极少量诱导浅黄色略带粉红色愈伤组织 , 15 d后部分诱导 ,膨大较明显
叶柄 80 很少 诱导率低 , 棕褐色 , 大部分褐化、死亡
3.2 基本培养基和激素种类及配比对愈伤组织诱导的影响
采用正交试验法对愈伤组织诱导的条件进行优选 。以基本
培养基 、不同种类的激素及配比作为考察因素 , 以 10 d内愈伤
组织诱导率的百分比为评价指标 ,选用 L 9(34)正交设计表安排
试验 。因素水平见表 2;正交试验结果见表 3。
表 2 因素水平
Tab 2 Levels of factors
水平 因素
A:基本培养基 B:NAA/mg·L -1 C:6-BA/mg·L -1
1 B 5 0.1 1
2 M S 0.3 2
3 WPM 0.5 3
对表 3进行数据处理 , 以 10 d内愈伤组织诱导率的百分
比为评价指标 ,各因素的主次顺序为 A>C>B 。其中 ,A 、C因
素经方差分析表明对愈伤组织的诱导有显著性的影响 。方案
A 1B1C1与正交表中的第 1号试验方案一致 ,而第 1号试验方案
的愈伤组织诱导率的百分比是所有方案中最高的 。因此 , 确定
中国药房 2008年第 19卷第 18期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.18 · 1395·
表 3 正交试验结果
Tab 3 L 9(34)orthogonal design experiments and results
水平 因素 诱导率/% 诱导情况
A B C D
1 1 1 1 1 89.01 增长明显 , 迅速 ,白色颗粒状
2 1 2 2 2 67.98 增长明显 , 迅速 ,浅黄色颗粒状
3 1 3 3 3 57.85 诱导较慢 , 黄色颗粒状 , 褐化较严重
4 2 1 2 3 56.34 诱导较慢 , 浅黄色颗粒状
5 2 2 3 1 50.75 诱导较迅速 , 白色颗粒状
6 2 3 1 2 62.12 增长明显 , 迅速 ,白色颗粒状
7 3 1 3 2 43.26 增长不明显 , 较前6组慢 , 白色颗粒状 , 褐化较严重 ,
8 3 2 1 3 48.65
9 3 3 2 1 33.08
K 1 214.84 188.60 199.78 172.84
K 2 169.21 167.38 157.40 173.35
K 3 124.98 153.05 151.85 162.84
R 89.86 35.55 47.93 10.51
表 5 不同来源愈伤组织内厚朴酚与和厚朴酚的含量测定果
Tab 5 Contents of Magnolol and Honokiol in callus from
dif ferent source
试验号
厚朴酚含量/% 和厚朴酚含量/ % 酚总量/ %
MS生长培养基 B5生长培养基 M S生长培养基 B 5生长培养基 MS生长培养基 B5生长培养基
1 0.087 1 0.085 2 0.002 5 0.002 1 0.089 6 0.087 3
2 0.091 5 0.087 6 0.003 1 0.003 4 0.094 6 0.091 0
3 0.075 3 0.070 4 0.001 7 0.001 3 0.077 0 0.071 7
4 0.144 9 0.139 3 0.018 9 0.017 6 0.163 8 0.156 9
5 0.166 7 0.157 7 0.020 2 0.020 5 0.186 9 0.178 2
6 0.153 2 0.133 4 0.015 4 0.014 9 0.168 6 0.148 3
7 0.205 6 0.201 5 0.028 8 0.026 3 0.234 4 0.227 8
8 0.172 4 0.167 8 0.023 7 0.023 4 0.196 1 0.191 2
9 0.155 8 0.147 4 0.0121 0.012 2 0.167 9 0.159 6
愈伤组织的最佳培养条件为 A 1B1C 1 , 即:B5+NAA0.1 mg ·
L -1+6-BA1.0 mg ·L -1。方差分析结果见表 4。
表 4 方差分析结果
Tab 4 L9(34)analysis of variance
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F P
A 1 345.91 2 672.96 57.484 8 <0.05
B 213.27 2 106.64 9.109 0 >0.05
C 458.24 2 229.12 19.571 7 <0.05
误差 23.41 2 11.71
注:F0.0 5(2, 2)=19.0;F 0.01(2 , 2)=99.0
note:F0.0 5(2, 2)=19.0;F0.01(2 , 2)=99.0
3.3 愈伤组织的继代培养
1 ～ 9号长势好的愈伤组织分别转移到 B5/MS+NAA0.5
mg ·L -1+6-BA4.0 mg ·L -12种生长培养基上 , 5 d后进行
观察 。结果发现 , 在 B5培养基上的愈伤组织大小为接种时的
2 ～ 3倍 , 呈白色颗粒状且紧密;MS 培养基上的愈伤组织生长
比 B5培养基上的慢 。因此 , 愈伤组织的继代可采用 B5 +
NAA 0.5 mg ·L -1+6-BA4.0 mg ·L -1。2周后 ,所有愈伤组
织均未见分化出不定芽 。
3.4 愈伤组织内厚朴酚及和厚朴酚的含量测定结果
不同来源愈伤组织内厚朴酚与和厚朴酚的含量测定结果
见表 5 。
表 5结果表明 , 7 ～ 9号试验材料的愈伤组织内的酚总量
较高 , 4 ～ 6号次之 , 1 ～ 3号含量最低 。继代培养以M S为基本
培养基愈伤组织内的酚总量高于 B5培养基 。由此看来 ,愈伤组
织诱导快 、生长较快的 ,其体内的次生代谢产物含量低 ,反之较
高 。以WPM 为基本培养基(第 7 ～ 9号试验材料)诱导愈伤组
织能产生较高的酚总量 , 含量可达 0.167 9%～ 0.234 4%;但
在本试验愈伤组织诱导时的效率是最低的 , 为 33.08%～
48.65%。第 6号试验的愈伤组织诱导率为 62.12%,经继代后
2酚总量为 0.168 6%, 第 6号试验设计为 A 2B3C 1 , 即M S+
NAA0.5 mg · L -1+6-BA1.0 mg · L -1。可见 ,在以次生代谢
产物为目的的组织培养时 , 第 6号试验既有较高的愈伤组织诱
导率 ,同时亦有较高的酚产量。
4 结论
综上所述:(1)外植体脱分化形成愈伤组织的能力大小为:
顶芽及茎段>雌蕊>花被>雄蕊>托叶>叶柄 。(2)所有设计
在 10 d 内均能诱导出愈伤组织 。最佳诱导配方为 :B5 +
NAA0.1 mg · L -1 +6-BA1.0 mg · L -1;B 5 +NAA0.5
mg ·L -1+6-BA4.0 mg ·L -1对愈伤组织生长的促进作用明
显 。(3)培养条件为 MS +NAA0.5 mg · L -1 +6-BA1.0
mg ·L -1时 ,有较高的愈伤组织诱导率和酚产量 。
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26(4):23.
(收稿日期:2007-11-02 修回日期:2008-04-10)
本刊讯 卫生部于 2008年 6月 2日发出通知 , 要求做好
2008年洪涝 、台风 、干旱等自然灾害的卫生应急工作 , 切实保
障灾区人民群众的身体健康与生命安全 。
通知强调 , 各级卫生行政部门要高度重视洪涝等自然灾害
卫生应急工作 , 加强救灾防病工作领导 , 明确医疗卫生各部门
的责任 , 并将相关职责和任务落实到具体单位和个人 , 确保各
项救灾防病措施落到实处 。尤其是地震灾区的各级卫生部门和
支援队伍 ,应密切关注洪涝 、泥石流 、溃坝等次生灾害引发的公
共卫生危机 ,提前做好防范工作部署 。同时 ,各级卫生行政部门
要与气象 、水利 、民政等部门保持密切合作 ,做好自然灾害的卫
生应急准备。灾情发生后 ,要在当地政府的统一领导下 ,加强部
门间的相互配合和协同联动 。
卫生部要求做好自然灾害卫生应急工作