全 文 ：动物医学进展 ,2006 ,27(11):72-75
Progress in Veterinary Medicine
三种方法纯化相思子毒素单抗的比较*
罗胜军 ,李小兵 ,魏　东 ,马惠海 ,徐慧娟 ,姜　涛 ,刘国文 ,谢光洪 ,高英杰 ,王　哲*
(吉林大学畜牧兽医学院 ,吉林长春 130062)
中图分类号:S859. 87 文献标识码:A 文章编号:1007-5038(2006)11-0072-04
摘　要:采用不同的方法纯化相思子毒素单
抗 ,寻求一种效果好 、操作简便的纯化方法。
采用硫酸铵沉淀法 、辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-
蛋白 A 亲和层析法三种方法分离纯化相思子
毒素单抗 ,并采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰
胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、BCA 蛋白检测试
剂盒(BCA Pro tein Assay Kit)和双抗夹心酶
联免疫吸附试验(ELISA)对纯化产物进行相
对分子质量 、浓度 、纯度 、回收率及免疫活性
的鉴定。结果表明 ,纯化后单抗的回收率以
硫酸铵沉淀法及辛酸-硫酸铵法较高 ,硫酸铵-
蛋白 A 亲和层析法较低;产物纯度以硫酸铵-
蛋白 A 亲和层析法和辛酸-硫酸铵法较高 ,硫
酸铵沉淀法较差;不同方法纯化后的单抗活
性未见降低。
关键词:相思子毒素;单克隆抗体;纯化
随着人类对生命科学研究的深入 ,单克隆抗体
现已广泛应用于生命科学 、免疫学 、生物化学 、分子
生物学等许多领域 ,尤其在疾病的诊断治疗和基础
研究中起着越来越重要的作用 。特别是抗体在药物
导向方面的研究成功后 ,对抗体的质量要求越来越
高。而由于腹水中有许多杂蛋白 ,所以在对腹水中
IgG的纯化方法上的研究显得尤为重要。
虽然免疫学实验技术已经普及和发展 ,从腹水
或动物血清中提纯 IgG已经成为常用的免疫化学技
术 ,纯化方法也较多 。但在科研及生产实践中 ,抗体
纯化往往是一个很容易被忽视的环节 ,导致所提纯
得到的 IgG 的活性 、回收率和纯度较低 ,这严重制约
了纯化产物的应用。因此 ,迫切需要寻求一种能满
足实际需要的较好的提纯方法 。为此 ,本文对辛酸-
硫酸铵法 、硫酸铵法和硫酸铵-蛋白 A亲和层析三种
IgG纯化方法进行了比较。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　试剂　相思子毒素单抗腹水由本实验室制
备 ,蛋白检测试剂盒(BCA Pro tein A ssay Ki t)购自
美国 Pierce公司 ,其他试剂均为进口分装或国产分
析纯化学试剂;试验用水为超纯水或去离子水。
1. 1. 2　主要设备　电热恒温水温箱 GB11241-89 ,
北京市医疗设备厂;DELTA 320 pH 计 ,梅特勒-托
利多(METT LER TOLEDO)仪器(上海)有限公司;
超速低温离心机 SCR20BA , HITACHI 公司;酶联
免疫检测仪为美国 Bio-Rad550 型;TG16A-WS 微
量高速离心机 , 长沙湘仪离心机仪器有限公司;
BS124S电子天平 ,美国塞多利斯(Shimadzu)仪器系
统有限公司;WD-9405B型水平摇床 ,沃德生物医学
仪器公司;微量可调移液器 ,芬兰 EPPEMDOF 公
司;TH-300梯度混合器 ,上海青浦沪西仪器厂;HD
21-1核酸蛋白检测仪 ,上海青浦沪西仪器厂;LM17
型记录仪 ,永青示波器厂;HiT rapTM 1 mL protein
A FF ,蛋白电泳仪 Pow er Pac Universal ,美国 BIO-
RAD公司 。
1. 2　方法
1. 2. 1　辛酸-硫酸铵法纯化相思子毒素单抗　取相
思子毒素单抗腹水 50 mL , 除掉表层脂质 。用
200 mL 、60 mmol /L 的醋酸钠-醋酸缓冲液稀释 ,并
用0. 1 mol /L的氢氧化钠调混合液 pH 至 4. 5。将辛
酸逐滴慢慢加入样品中 ,边加边搅拌 ,以每毫升血清
25 μL 辛酸计算。加完后继续搅拌 30 min。8 000
r /min离心 30 min ,取上清按体积比 10∶1与 10倍
PBS 混合 ,用 0. 1 mol /L 的氢氧化钠调 pH 至 7. 4。
加入硫酸铵(每升混合液加入硫酸铵 0. 227 g),搅拌
30 min后 , 6 000 r /min 离心 15 min 。弃上清 ,将沉
* 收稿日期:2006-08-14
基金项目:国家自然基金项目(30230260)
作者简介:罗胜军(1974 -), 男 ,安徽望江人 ,硕士研究生 , 主要从事动物营养代谢及中毒病研究。 *通讯作者
DOI牶牨牥牣牨牰牬牫牱牤j牣cnki牣牨牥牥牱牠牭牥牫牳牣牪牥牥牰牣牨牨牣牥牪牥
淀用适量 PBS溶解后吸出并装入透析袋内 ,于 4 ℃
条件下 ,对 100倍体积的 PBS 透析 24 h ,中途换液
3次 ～ 4次。取出透析袋 ,吸出蛋白溶液 ,在 4 ℃条
件下 ,以 4 000 r /min离心 15 min ,取上清即为纯化
产物 ,分装后于 - 20 ℃保存[ 1] 。
1. 2. 2　硫酸铵沉淀法纯化相思子毒素单抗　取相
思子毒素单抗腹水 50 mL ,加同样体积的 PBS 液 ,
混匀 。滴加 50 mL 饱和硫酸铵 ,边滴加边搅拌。充
分混合后室温静止 1 h 或 4 ℃过夜。10 000 r /min
离心 10 min ,弃上清 。将沉淀用少量 PBS 液溶解 ,
并悬浮于 100倍体积的 PBS中 。于 4 ℃透析 24 h ,
换液 3 次 ～ 4次 。取出透析袋 , 吸出蛋白溶液 ,于
4 ℃,以 4 000 r /min离心 15 min ,取上清即为纯化
产物 ,分装后于 - 20 ℃保存[ 2-3] 。
1. 2. 3　硫酸铵-蛋白 A亲和层析法纯化相思子毒素
单抗　将 50 mL 腹水用饱和硫酸铵法初步纯化 IgG
(具体步骤参照 1. 2. 2)。将层析柱与蠕动泵 、收集
器和核酸蛋白检测仪相连 ,至少用 10倍柱床体积的
PBS 缓冲液平衡 ,以 1 mL /min速度 ,洗涤柱中的亲
和层析介质 。上样:一般按 25 mg ～ 30 mg 的 IgG
每分钟湿胶比例加样 ,室温作用 15 min ,应用 LM17
型记录仪记录检测(Ⅰ峰),收集 3 mL 于离心管作
为对照。用 0. 1 mol /L pH 8. 0磷酸缓冲液充分淋
洗至淋洗液 OD 值<0. 02。用醋酸-醋酸钠洗脱缓
冲液洗脱所结合的 IgG ,应用 LM 17 型记录仪记录
检测 。收集 3 mL 于离心管待测(Ⅱ峰)。收集过程
中 ,每管立即加入 pH 9. 0的 Tris-HCl中和缓冲液
调 pH 7. 0 ,以中和洗脱所得的 IgG 液。用至少 5倍
～ 10倍柱床体积的 PBS 缓冲液平衡层析柱 ,再用含
200 mL /L 乙醇的 PBS 平衡后保存 。将收集的液体
放入透析袋中 ,悬于 PBS 溶液中 ,4 ℃透析过夜。次
日将透析袋取出 , 吸出蛋白溶液 , 于 4 ℃, 以
10 000 r /min离心 15 min ,取上清分装冻存[ 4] 。
1. 2. 4　三种方法纯化后单抗的纯度和浓度分析　
将以上三种方法纯化的样品分别用 SDS-PAGE 和
BCA 法分析纯化后相思子毒素单抗的纯度和浓度。
SDS-PAGE 按常规实验室方法操作 , BCA 法按试剂
盒说明书进行 。
1. 2. 5　三种方法纯化后单抗的免疫活性鉴定　用
相思子毒素多抗(4 μg /mL)包被酶标板 , 4 ℃包被
18 h ,洗板 4次 ,每次 3 min;10 mL /L BSA 37 ℃封
闭 1 h ,洗板同上 ,加入相思子毒素抗原(50 ng /mL)
37 ℃作用 2 h ,洗板同上;再加入纯化前的腹水和经
不同方法纯化后的单抗 ,分别倍比稀释成不同的浓
度 ,37 ℃作用 1 h;加酶标二抗和显色终止并测 OD
值 ,按常规夹心 ELISA操作。
2　结果
2. 1　三种方法纯化后相思子毒素单抗纯度
的 SDS-PAGE 分析
　　根据电泳结果可明显看到两条带(图 1),一条
为 IgG的重链 ,另一条为 IgG 的轻链 。经蛋白 A 亲
和层析和辛酸-硫酸铵法纯化后的蛋白纯度比硫酸
铵沉淀法要高 ,根据标准蛋白画出的标准曲线计算
出 IgG的重链和 IgG的轻链分子质量(表 1)。
1.蛋白分子质量标准;2.蛋白 A 亲和层析法纯化后的样品;3. 辛酸-
硫酸铵法纯化后的样品;4.硫酸铵沉淀法纯化后的样品;5.未纯化的
腹水
1. Protein marker of low molecu lar w eigh ts;2. S am ples pu ri fied by
protein A chromatog raphy;3. Samples pu ri fied by caprylic acaid-am-
m onium sulfate meth od;4. S amp les purifi ed by amm onium sulfate
method;5. The asci tes of ab rin m onclonal an tib ody
图 1　不同纯化方法的 SDS-PAGE电泳结果
Fig. 1　T he result s of SDS-PAGE of sam ples pu rified b y dif ferent
methods
表 1　纯化后样品的分子质量
T able 1　Th e molecular w eight of purifi ed samples
条带
Band
蛋白移动距离
Protein m oving dis tance
染料移动距离
Dye moving distance
泳动率
Mobilit y
分子质量 /ku
Molecular w eigh t
重链　Heavy chain 2. 21 6. 25 0. 353 6 55. 85
轻链　Ligh t chain 4. 55 6. 25 0. 728 30. 34
73罗胜军等:三种方法纯化相思子毒素单抗的比较
2. 2　三种方法纯化后相思子毒素单抗的浓度
2. 2. 1　标准曲线绘制　按 BCA 说明书操作 ,测定
标准蛋白的 OD 值。将分光光度计波长设为 562
nm ,用样品稀释液调零 ,测定标准浓度的光密度值。
在 10 min内读取所有样品的光密度(OD562 nm)值 ,
每一浓度两管取平均光密度值 ,样品管平均光密度
值减去空白管平均光密度值 ,即为修正后各管的光
密度值(表 2)。用 SPSS10. 0软件分析并拟合曲线
方程 ,以吸光度值为横坐标 ,标准蛋白浓度为纵坐标
绘制标准曲线(图 2)。曲线方程为 Y=3. 434 5+
567. 229X+338. 424X2 - 75. 529X 3 , R2 =0. 998。
表 2　标准浓度的光密度值
T ab le 2　Th e optical density valu es of s tandard con cen t rat ion
试管号
Cuvet te n o.
1 2
平均值
General average
BSA 终浓度
BSA final concent rat ion /(μg mL - 1)
A 2. 207 2. 023 2. 115 0 2 000
B 1. 606 1. 637 1. 621 5 1 500
C 1. 170 1. 166 1. 168 0 1 000
D 0. 925 0. 926 0. 925 5 750
E 0. 643 0. 649 0. 646 0 500
F 0. 369 0. 347 0. 358 0 250
G 0. 199 0. 194 0. 196 5 125
H 0. 041 0. 035 0. 038 0 25
I 0 - 0. 009 - 0. 004 5 0
图 2　标准蛋白曲线
Fig. 2　S tandard protein curve
2. 2. 2　测定三种方法纯化后样品的浓度和回收率　
根据所测出待测样品的 OD值 ,利用回归方程计算
出待测样品稀释后的蛋白质浓度 ,并利用稀释倍数 、
回收体积等参数计算出三种方法从同体积腹水中纯
化出的相思子毒素单抗的量和每种方法的回收率
(表 3)。从表中可以看出 ,经辛酸 —硫酸铵法纯化后
的浓度和回收率要高于蛋白 A 亲和层析法和硫酸铵
法。
2. 3　双抗夹心 ELISA 法对不同方法纯化后单抗
免疫活性的检测
经三种方法纯化后的单抗与纯化前腹水的效价
均为 1:6 400 ,说明用这三种方法纯化后的单抗的免
疫活性均未降低 。
表 3　三种纯化方法的浓度及回收率
Table 3　The con cen t rat ions an d recovery rate of ab rin m onoclonal an tib ody purif ied by three methods
纯化方法
Pu rif icat ion m ethod
OD值
OD value
稀释倍数
Dilution times
回收体积 /m L
Recovery volume
纯化产物浓度 /(μg mL - 1)
Concent ration of pu rified products
回收率 /%
Recovery rate
辛酸-硫酸铵法
Caprylic acid-ammonium
sulfate m ethod
1. 604 30 14 12 367. 15 57. 00
蛋白 A 亲和层析法
Protein A ch rom atography
1. 164 5 64 6 419. 851 29. 50
硫酸铵法
Ammonium sulfate method
0. 749 40 16 7 506. 032 34. 60
74 动物医学进展　2006年　第 27 卷　第 11 期(总第 158 期)
3　讨论
3. 1　辛酸-硫酸铵法具有简便 、快速的优点 。而它
纯化 IgG 的纯度要高于硫酸铵沉淀法 ,但低于蛋白
A亲和层析法。此法是在酸性条件下 ,先沉淀腹水
中的非 IgG类蛋白质 ,再结合饱和硫酸铵盐析 ,最终
从腹水中获得高纯度的 IgG 。
3. 2　饱和硫酸铵沉淀法的回收率高于蛋白 A 亲
和层析法 ,而低于辛酸-硫酸铵法。此法的纯度都低
于辛酸-硫酸铵和蛋白 A 亲和层析法。但它具有操
作简便 、设备简单的优点 ,不需要高级的仪器和试
剂 ,可以满足一般的临床和基层的需要。如果需要
获得纯度较高的免疫球蛋白产品 ,可以用此法结合
其他方法 ,如离子交换层析法 、凝胶过滤法和亲和层
析法等。
3. 3　蛋白 A 亲和层析法纯化后的纯度均高于辛
酸-硫酸铵法和硫酸铵沉淀法。但它的回收率却低
于另外两种方法 。并且对设备要求高 ,耗时长 ,比较
昂贵 ,不适宜在抗体批量纯化中使用 ,可以在实验室
少量制备 。
3. 4　经双抗夹心 ELISA 法检测 ,三种方法纯化后
的单抗的效价未见降低 ,这说明纯化后的单抗的免
疫活性均未降低 。
因此 ,从实际效用等方面比较 ,辛酸-硫酸铵法
是一种操作简单 、快速 、成本低 、纯化效果和回收效
果较佳的纯化 IgG 的方法 ,便于在基层单位和临床
上大量推广使用 。是作为免疫监测所用于 IgG 的最
理想 、首选的纯化方法。
参考文献:
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Study on the Purification Methods of Abrin Monoclonal Antibody
LUO Sheng-jun , LI Xiao-bing ,WEI Dong ,MA Hui-hai ,XU Hui-juan ,
JIANG Tao , LU Guo-wen ,XIE Guang-hong ,GAO Ying-jie ,WANG Zhe
(Co llege o f Animal S cience and Veterinary Medicine , J i l in Univer sity , Chang chun , J i lin , 130062 , China)
Abstract:The experiments w ere conducted to select g ood methods fo r the purification of abrin monoclonal
ant ibody. The methods used included ammonium sulfate precipi tat ion , capry lic acid-ammonium method and
pro tein A chromatog raphy. T he relative mo lecular w eight , concentra tion ,puri ty , recovery ra te and immu-
nolo gical activi ty of parif ied products w ere examined by SDS-PAGE , BCA pro tein assay , ELISA. The re-
sults showed that the recovery rates of puri fied monoclonal antibody were higher by using ammonium sul-
fate precipitation and capry lic acid-ammonium method than that by using pro tein A chromatog raphy . The
purities of monoclonal antibody w ere higher by using pro tein A chromatog raphy and capry lic acid-ammoni-
um method than that by using ammonium sulfate precipitio n. The activit ies of monoclonal antibody purif ied
wi th different methods w ere normal.
Key words:abrin;monoclonal antibody ;purification
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75罗胜军等:三种方法纯化相思子毒素单抗的比较