全 文 ：响应曲面法优选粪箕笃总皂苷的提取工艺
杨安平1，柯俊东2
收稿日期:2015-02-27
基金项目:广东省自然科学基金项目(No． S2012010010489)
(1．佛山科学技术学院，佛山 528000;2．广东医学院，东莞 523808)
摘 要 目的:利用响应面法优化粪箕笃总皂苷的提取工艺条件。方法:以提取温度、液料比、乙醇浓度及提取时间
为影响因子，应用 Box － Behnken中心组合设计建立数学模型，以提取粪箕笃总皂苷的提取率作为响应值，进行响应面法
分析。结果:粪箕笃总皂苷提取的最佳工艺为:提取温度:90 ℃，液料比 25∶ 1，乙醇浓度 40%，提取时间 100 min，理论提
取率 19． 59%，实际测得值为 18． 80%，两者较接近。结论:Box － Behnken 设计结合响应面分析法可以用于粪箕笃总皂苷
提取工艺的优化。
关键词 粪箕笃，皂苷，响应面法
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1006-5687(2015)02-0005-05
Optimization of the extraction of total saponins from Stephania Longa L by response surface analysis
Yang Anping1，Ke Jundong2
(1． School of Medicine，Foshan University，Foshan 528000; 2． Guangdong Medical College，Dongguan 523808)
ABSTＲACT Objective:To optimize the extraction technology of total saponins from Stephania Longa L． by response surface meth-
odology (ＲSM)． Methods:Extraction temperature，solvent － solid ratio，ethanol concentration and extraction time were selected as
influencing factors during extraction． The experiment mathematical model was arranged according to Box － Behnken central com-
posite experiment design． Ｒesults:The optimal extraction conditions were as follows:extraction temperature :90 ℃，solvent － sol-
id ratio:25∶ 1，ethanol concentration:40%，and extraction time:100 min． The predicted extraction rate of total saponins was
19． 59% under the optimum conditions while the actual rate was 18． 80% ． Conclusion:The combination of Box － Behnken design
and response surface analysis can optimize the extraction technology of total saponins from Stephania Longa L．
KEY WOＲDS Stephania Longa L，saponins，response surface methodology (ＲSM)
粪箕笃为防己科多年生的草本植物粪箕笃
(Stephania longa Lour)的全草或根茎及根，产于我国南
部，主要分布于广东、广西等地，为岭南地区特有药材，
具有清热解毒、利湿消肿、祛风活络之功效，用于热病
发狂、泄泻、痢疾、小便淋涩、水肿、黄疸、风湿痹痛、喉
痹、疮痈肿毒、毒蛇咬伤［1］。杨淑君等［2］采用皮下注射
丙酸睾酮制作前列腺增生小鼠模型，观察粪箕笃乙醇
提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等各萃取物
对前列腺增生小鼠的前列腺湿重、前列腺体积与前列
腺指数的影响，结果显示粪箕笃乙醇提取物的氯仿萃
取物可明显降低前列腺增生小鼠的前列腺湿重、前列
腺体积和前列腺指数。经化学鉴别粪箕笃乙醇提取物
的氯仿萃取物为皂苷类成分，本实验以粪箕笃总皂苷
提取率为指标，应用响应面法对粪箕笃总皂苷的提取
工艺条件进行优化，得到粪箕笃总皂苷的最佳提取工
艺，为粪箕笃皂苷分离纯化与开发应用提供参考。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 紫外可见分光光度计(北京凯奥科技发
展有限公司，型号:k5600)，超声波清洗仪(昆山市超声
仪器有限公司，型号:KQ3200B)，TC － 15 套恒温器(海
宁市新华医疗器械厂)，HH － 4 数显恒温水浴锅(常州
奥华仪器有限公司)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器
厂，型号:ＲE52CS － 1)，低温冷却循环泵(巩义市予华
仪器有限责任公司，型号:DLSB5L /20)，循环水式真空
泵(巩义市予华仪器有限责任公司，型号:SHZ － DШ)。
1. 2 试药 粪箕笃(采集于广西，经广西中医药大学
李勇华教授鉴定为真品)，人参皂苷 Ｒg 1 标准品(中国
食品药品检定研究院，批号 U5CY － 4Q30)，香草醛、高
氯酸、冰醋酸、石油醚、无水乙醇、甲醇均为市售分
析纯。
2 方法与结果
2. 1 粪箕笃总皂苷的提取方法 将粪箕笃药材粉碎，
称取粪箕笃粉 100． 0 g，加 300 ml 石油醚脱脂、脱色提
取 30 min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在一定温度、液
料比、乙醇浓度等条件下提取一定时间，过滤，将滤液
减压浓缩干燥得粪箕笃提取物。
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2. 2 粪箕笃总皂苷的定性分析
2． 2． 1 泡沫反应 取粪箕笃提取物 0． 01 g，置于试管
中，加蒸馏水 5 ml，强力振摇 1 min，试管内产生大量泡
沫，15 min后消失，结果显示粪箕笃提取物含有皂苷类
化合物。
2． 2． 2 醋酐 －浓硫酸反应(liebermann － burchard)
取少量粪箕笃提取物置于试管中，加醋酐超声溶解，加
浓硫酸 －醋酐试剂，观察到试管内颜色变化:淡黄色变
成黄棕色，颜色变深，并产生热量，结果显示粪箕笃皂
苷类化合物为三萜皂苷类化合物。
2． 2． 3 三氯醋酸反应(rosen － heimer) 取少量粪箕
笃提取物置于试管中，加水超声溶解，滴在滤纸上，喷
洒三氯醋酸试剂，分别在 60 和 100 ℃观察其颜色变
化。结果显示 60 ℃时无任何明显变化，100 ℃时颜色
变为紫色，进一步说明粪箕笃皂苷类化合物为三萜皂
苷类化合物。
2. 3 粪箕笃总皂苷含量测定(香草醛 －高氯酸法)
2． 3． 1 最大波长的确定 精密称取干燥至恒重的人
参皂苷 Ｒg 1 对照品 5． 0 mg，加甲醇超声溶解，定容至
10 ml，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液
0． 2 ml置于试管中，水浴加热除去溶剂，加入新配制的
5%香草醛 －冰乙酸溶液 0． 2 ml、高氯酸 0． 8 ml，摇匀，
溶液呈玫瑰红色后，在 60 ℃水浴中加热 15 min，流水
冷却，加冰乙酸 5 ml，摇匀，放置 20 min，在 480 ～ 800
nm下扫描，确定最大吸收波长。结果显示人参皂苷
Ｒg 1 的在可见光区域内最大吸收波长为 555 nm。
2． 3． 2 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的人
参皂苷 Ｒg 1 对照品 5． 0 mg，加甲醇超声溶解，定容至
10 ml，摇匀，作为备用液，分别精密吸取对照品溶液
125、150、200、250、300 和 350 μl于 10 ml试管中，水浴
加热除去溶剂，加入新配制的 5%香草醛 －冰乙酸溶
液 0． 2 ml、高氯酸 0． 8 ml，摇匀，溶液呈玫瑰红色，在
60 ℃水浴中加热 15 min，流水冷却，加冰乙酸 5 ml，摇
匀，放置 20 min，在 555 nm处测定吸光度，甲醇溶液作
空白对照。以人参皂苷 Ｒg 1 浓度为横坐标，吸光度为
纵坐标，绘制标准曲线，以浓度对吸光度进行回归，计
算回归方程为 A = 20． 098 C + 0． 005 3(Ｒ2 = 0． 999 2)。
人参皂苷 Ｒg 1 在 0． 010 42 ～ 0． 0291 7 mg /ml范围内，
呈现良好的线性关系。
2． 3． 3 精密度考查 取同一供试品溶液，按“2． 3． 1”
项下方法操作，连续测定 6 次，计算 ＲSD 为 1． 21%，说
明仪器精密度符合要求。
2． 3． 4 重复性考查 精密称取 6 份粪箕笃粉末，按
“2． 1”项下方法进行提取，按“2． 3． 1”项下方法测定吸
光度，计算 ＲSD为 1． 22%，说明本试验方法重复性符
合要求。
2． 3． 5 稳定性考查 取同一供试品溶液，按“2． 3． 1”
项下步骤，分别在 0、5、10、30、60 和 120 min 各测定一
次，得出总皂苷吸光度，计算其 ＲSD为 1． 64%，该样品
溶液在 120 min 内稳定。
2． 3． 6 加样回收率试验 取已知总皂苷含量的粪箕
笃粉末 6 份，分别加入 Ｒg 1 对照品约 0． 1 mg，按
“2． 1”项下方法进行提取，按“2． 3． 1”项下方法测定吸
光度，测定各供试品溶液的吸光度值，按照公式［回收
率(%)=(加标样品实测值 －样品测定值)/加入对照
品量 × 100%］计算，平均回收率为 98． 09%，ＲSD 值为
2． 30%，显示该试验方法的准确度符合要求。
2． 3． 7 总皂苷含量测定 准确称取粪箕笃总皂苷样
品 130 mg 溶解于 20 ml 量瓶中，加甲醇超声溶解，定
容，准确吸取 0． 2 ml 置于试管中，其余步骤同
“2． 3． 1”。
2． 3． 8 总皂苷含量的计算 总皂苷(%)=(测得粪
箕笃皂苷的量 ÷称取的粪箕笃粉量)× 100%。
2. 4 单因素试验 选择提取温度、液料比、乙醇浓度、
提取时间等因素考查对粪箕笃总皂苷提取率的影响，
以确定相关因素及其范围。
2． 4． 1 提取温度对提取率的影响 称取粪箕笃粉末
100． 0 g 5 份，分别加 300 ml 石油醚脱脂、脱色提取 30
min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在固定液料比10∶ 1，
提取溶剂为 70%乙醇，分别在 50、60、70、80 和 90 ℃条
件下提取 30 min，过滤，将滤液减压浓缩干燥得粪箕笃
粗皂苷，并测定，考查温度对粪箕笃总皂苷提取率的影
响。结果见图 1。
图 1 提取温度对粪箕笃总皂苷提取率的影响
2． 4． 2 液料比对提取率的影响 称取粪箕笃粉末
100． 0 g 5 份，分别置于 500 ml 圆底烧瓶中，加 300 ml
石油醚脱脂、脱色提取 30 min，过滤，滤液回收石油醚，
滤渣在固定提取温度 80 ℃，提取溶剂为 70%乙醇，分
别在液料比 10∶ 1、15∶ 1、20∶ 1、25∶ 1 和 30∶ 1 条件
下提取 30 min，过滤，将滤液减压浓缩干燥得粪箕笃粗
皂苷，并测定，考查液料比对粪箕笃总皂苷提取率的影
响。结果见图 2。
2． 4． 3 乙醇浓度对提取率的影响 称取粪箕笃粉
100． 0 g 5 份，分别加 300 ml 石油醚脱脂、脱色提取 30
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min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在固定温度 80 ℃，液
料比为 20∶ 1，分别在 10%、30%、50%、70%和 90%乙
醇浓度条件下提取 30 min，过滤，将滤液减压浓缩干燥
得粪箕笃粗皂苷，并计算，考查乙醇浓度对粪箕笃总皂
苷提取率的影响。结果见图 3。
图 2 液料比对粪箕笃总皂苷提取率的影响
图 3 乙醇浓度对粪箕笃总皂苷提取率的影响
2． 4． 4 提取时间对提取率的影响 将粪箕笃粉碎，准
确称取粪箕笃粉 100． 0 g 5 份，分别加 300 ml石油醚脱
脂、脱色提取 30 min，过滤，滤液回收石油醚，滤渣在固
定温度 80 ℃，液料比为 20 ∶ 1，乙醇浓度为 50%条件
下，分别提取 20、40、60、80 和 100 min，过滤，将滤液减
压浓缩干燥得粪箕笃粗皂苷，并计算，考查提取时间对
粪箕笃总皂苷提取率的影响。结果见图 4。
图 4 提取时间对粪箕笃总皂苷提取率的影响
2. 5 响应曲面试验
2． 5． 1 试验设计 参考文献的方法［3 － 5］，根据 Box －
Behnken 中心组合试验设计原理，在单因素试验基础
上，以提取温度(A)、液料比(B)、乙醇浓度(C)和提取
时间(D)4 个因素为自变量。每个自变量的低、中、高
水平分别以 － 1，0，1 进行编码，以粪箕笃总皂苷提取
率(Y)为响应值，应用 Design － Expert 7． 0 软件设计 4
因素 3 水平(共 29 个试验点 5 个中心点)的响应面试
验，利用响应面试验结果，确定粪箕笃中总皂苷的最佳
提取条件。试验因素与水平设计见表 1。
2． 5． 2 结果与分析 以乙醇浓度(A)、液固比(B)、提
取温度(C)和提取时间(D)为自变量，以粪箕笃总皂
苷得率为响应值(Y)，进行响应面分析试验。试验方
案及结果见表 2。
表 1 响应面试验因素与水平表
水平
A
提取温度(℃)
B
液料比
C
乙醇浓度(%)
D
提取时间(min)
－ 1 70 15∶ 1 30 60
0 80 20∶ 1 50 80
1 90 25∶ 1 70 100
表 2 响应面分析方案及试验结果
样品
编号
A
温度
(℃)
B
液料比
C
乙醇浓度
(%)
D
提取时间
(min)
总皂苷
提取率
(%)
1 80 20 70 60 11． 64
2 90 20 30 80 12． 17
3 80 20 30 100 13． 17
4 90 15 50 80 7． 73
5 70 25 50 80 14． 36
6 80 20 50 80 11． 25
7 80 20 50 80 11． 55
8 80 25 70 80 7． 89
9 70 20 50 100 7． 22
10 80 20 70 100 12． 39
11 90 25 50 80 9． 89
12 90 20 50 60 11． 84
13 80 20 50 80 14． 09
14 90 20 50 100 11． 21
15 70 20 50 60 11． 98
16 80 25 30 80 16． 36
17 80 20 50 80 10． 95
18 70 20 30 80 10． 18
19 70 20 70 80 10． 97
20 80 15 50 60 13． 21
21 80 20 30 60 8． 66
22 80 15 50 100 16． 79
23 80 20 50 80 14． 21
24 80 15 30 80 13． 07
25 80 25 50 60 14． 97
26 90 20 70 80 9． 12
27 80 25 50 100 13． 81
28 80 15 70 80 11． 54
29 70 15 50 80 10． 29
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采用 Design － expert 软件对表 6 中数据进行多项
式拟合回归，建立多元二次响应面回归模型:Y =
122． 175 19 － 1． 884 12 A －4． 016 37 B + 0． 467 52 C －
0． 315 49 D + 4． 000 00 E － 003 AB + 4． 250 00 E －
003 AC + 3． 750 00 E － 005 AD － 8． 250 00 E － 003
BC + 0． 019 350 BD －2． 531 25 E － 003 CD +0． 010 707
A2 + 0． 069 580 B2 － 5． 010 63 E － 003 C2 + 3． 300 00
E － 004 D2，各因素的方差分析结果见表 3。
表 3 粪箕笃总皂苷提取回归模型的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob ＞ F
A 18． 63 1 18． 63 51． 21 ＜ 0． 000 1
B 14． 83 1 14． 83 40． 78 ＜ 0． 000 1
C 17． 89 1 17． 89 49． 18 ＜ 0． 000 1
D 0． 002 7 1 0． 00 0． 01 0． 932 6
AB 0． 16 1 0． 16 0． 44 0． 517 9
AC 2． 89 1 2． 89 7． 95 0． 013 7
AD 0． 000 225 1 0． 00 0． 00 0． 980 5
BC 2． 72 1 2． 72 7． 49 0． 016 1
BD 14． 98 1 14． 98 41． 18 ＜ 0． 000 1
CD 4． 10 1 4． 10 11． 28 0． 004 7
A2 7． 437 1 7． 44 20． 45 0． 000 5
B2 19． 63 1 19． 63 53． 97 ＜ 0． 000 1
C2 26． 06 1 26． 06 71． 65 ＜ 0． 000 1
D2 0． 11 1 0． 11 0． 31 0． 586 0
残余 5． 09 14 0． 36
模型 141． 00 14 10． 07 27． 69 ＜ 0． 000 1
失拟项 4． 70 10 0． 47 4． 75 0． 073 4
纯误差 0． 39 4 0． 10
总和 146． 09 28 10． 07
由表 3 可知，模型的 Prob ＞ F 值小于 0． 000 1，表
明二次方程拟合极显著，失拟项 F 值为 0． 073 4，表明
失拟项相对于绝对误差是不显著的，而不显著的失拟
项才可用。温度(A)、液料比(B)和乙醇浓度(C)的
Prob ＞ F值小于 0． 01，表明其对总皂苷提取率影响极
显著，提取时间(D)的 Prob ＞ F值大于 0． 05，表明其对
总皂苷提取率影响不显著，则影响粪箕笃总皂苷提取
率的各因素按影响大小排序依次为提取温度 ＞乙醇浓
度 ＞液料比 ＞提取时间。二次项 A2、B2 和 C2 影响显
著，交互项按影响大小排列依次为 BD ＞ CD ＞ AC ＞
BC ＞ AC ＞ AB ＞ AD，其中 BD 达到极显著水平，AC、
BC、CD 也处于显著水平，其他不显著，表明各因素对
皂苷提取率不是简单线性关系。各交互因素响应曲面
图见图5 － 16。
图 5 温度与液料比对提取率的等高线图
图 6 温度与液料比对提取率的响应面图
图 7 温度与乙醇浓度对提取率的等高线图
图 8 温度与乙醇浓度对提取率的响应面图
图 9 温度与提取时间对提取率的等高线图
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图 10 温度与提取时间对提取率的响应面图
图 11 液料比与乙醇浓度对提取率的等高线图
图 12 液料比与乙醇浓度对提取率的响应面图
图 13 液料比与提取时间对提取率的等高线图
图 14 液料比与提取时间对提取率的响应面图
图 15 乙醇浓度与提取时间对提取率的等高线图
图 16 乙醇浓度与提取时间对提取率的响应面图
决定系数 Ｒ2 = 0． 965 1，CV值为 5． 06%，说明模型
拟合好，试验误差小，试验操作可信，可用此模型对粪
箕笃总皂苷提取进行分析和预测。通过回归模型预测
的粪箕笃总皂苷提取的最佳工艺条件为:提取温度 90
℃，液料比 25 ∶ 1，乙醇浓度 40%，提取时间为 100
min，在此条件下，粪箕笃总皂苷得率理论上可达
19． 59%。采用此工艺条件进行验证实验，实际测得粪
箕笃总皂苷得率为 18． 80%，与实际值相差不大，说明
采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实际
价值。
参考文献
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