全 文 ：205
小花八角多糖提取优化工艺
及自由基清除作用研究
连路宁，李雅双，刘 杰，刘春兰*
(中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081)
摘 要:小花八角多糖是一种水溶性天然多糖，本文研究了小花八角多糖的提取工艺及其清除自由基的能力。通过单
因素实验和正交实验，结果表明，小花八角水溶性多糖的最佳提取工艺条件为:提取温度 75℃、料液比 1∶14、提取时间
2h、超声波功率 300W，水溶性小花八角多糖的得率为 0.83%。进行清除自由基活性研究，结果显示，小花八角多糖具
有清除自由基的作用。
关键词:小花八角，多糖提取，正交实验，清除自由基
Optimization of the extraction technology and free radical scavenging
activity of polysaccharide from Illicium micrantbum
LIAN Lu－ning，LI Ya－shuang，LIU Jie，LIU Chun－ lan*
(College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081，China)
Abstract:The extraction of Illicium micrantbum polysaccharide and its scavenging capacity of free radical were
studied in this paper. Through single factor experiment and orthogonal experiment，the optimum extracting
conditions were investigated through that the temperature was 75℃，material to water 1 ∶ 14，extracting time 2h，
ultrasonic power 300W.The polysaccharide yield was up to 0.83% .Meanwhile，the polysaccharide of Illicium
micrantbum had strong scavenging effect on free radical.
Key words:Illicium micrantbum Dunn;polysaccharide;orthogonal experiment;free radical
中图分类号:TS201.2 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2014)15－0205－05
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2014． 15． 036
收稿日期:2013－12－26 * 通讯联系人
作者简介:连路宁(1988－) ，女，硕士研究生，研究方向:植物多糖化学。
基金项目:中央民族大学“985”工程项目(MUC985－9) ;“111 创新引
智计划”工程项目(B08044)。
小花八角(Illicium micrantbum Dunn)为木兰亚
纲(Magnoliidae)八角目(Illiciales) ，为单一科属，仅
八角科(Illiciaceae)八角属(Illicium)。产于中国广
东，广西融水、金秀、临桂、龙胜，四川峨眉山，云南南
部，为中国特有种属［1］，具有杀虫、散瘀止痛、祛风除
湿、止吐腹泻之效［2］。
多糖在自然界广泛存在，是一类分子结构复杂
而庞大的生物大分子，其药理作用涉及广泛［3－4］。近
年来的研究发现，植物多糖具有免疫调节［5］、抗肿
瘤［6］、降血糖［7］、抗病毒［8］、抗炎［9］等生物活性，已是
当前国内外研究的热点［10－11］。而目前人们对小花
八角多糖的研究较少［12－13］，主要集中在莽草酸、黄
酮类、挥发性成分及倍半萜类物质等。据文献报
道，莽草酸是对抗亚洲禽流感最有效的成分［14］，而
八角属的植物又是莽草酸的主要来源，所以大多数
研究主要集中在分析莽草酸的结构及组成上［15］。
利用多种色谱法从小花八角根茎中得到黄酮类物
质，如山奈酚［16］;利用化学层析技术从小花八角的
果实中鉴定出 20 多种挥发性成分［17］;倍半萜内酯
类是普遍存在八角属植物中的，但大量食用八角可
导致人类中毒现象。经查阅资料发现，研究小花八
角多糖的文献还未见报道，就此采用超声波辅助水
浸法，对小花八角干燥枝叶的水溶性多糖进行初步
研究。
利用水提醇沉法从料液比、温度、提取时间和超
声波助提功率四个因素对小花八角多糖的提取进行
了优化，得出小花八角多糖的最佳提取工艺。同时
初步探究了小花八角多糖对自由基清除能力的研
究，以期为合理利用小花八角植物资源提供科学依
据和理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
小花八角干燥枝叶 采自云南省文山县，由中
央民族大学生命与环境科学学院王文蜀教授鉴定。
浓硫酸、苯酚、无水乙醇、80%乙醇、乙醚、氯仿、正丁
醇等 均为分析纯，北京化工厂产品;葡萄糖、抗环
血酸标准品 上海国药集团产品;Pronase(蛋白酶)
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德国默克公司;DPPH Sigma 试剂 北京欣科中晶
生物科技有限公司。
8002 型电热恒温水浴锅 天津市中环实验电
炉有限公司;KQ－250DB 超声波清洗机 江苏省
昆山市超声仪器有限公司;LD4－8 型离心机 北
京医用离心机;Benchmark plus酶标仪 美国伯乐
公司;22pc 可见分光光度计 上海棱光技术有限
公司。
1.2 实验方法
1.2.1 提取工艺 原料粉粹→烘干→称重→用水提取两
次抽滤［18］→合并滤液浓缩→醇沉(80% 的酒精)→离心
(3500r /min，8min)→抽取上层清液，得多糖沉淀→无水乙醇、
乙醚吸水→真空干燥→复溶(2%的糖溶液)→脱蛋白(酶法
和 Sevage法联合脱蛋白［19］)→浓缩(原溶液的体积的 1 /3)→
醇沉(80%的酒精)→离心(3500r /min，8min) ，得沉淀→无水
乙醇、乙醚吸水后→真空干燥→小花八角粗多糖。将此粗多
糖称重，计算多糖质量。由粗多糖的质量和样品的质量之比
得粗多糖得率。
多糖得率(%)=粗多糖质量 /样品质量 × 100
1.2.2 总糖含量的测定 采用苯酚－硫酸法［20］，用
已烘干至恒重的葡萄糖配制成 50μg /mL 的溶液。
再将葡萄糖溶液进行梯度稀释，浓度分别为 25、30、
35、40、45μg /mL。然后加入 1.0mL 5% 苯酚和
5.0mL浓硫酸，摇匀，室温放置冷却，于 490nm 处测
吸光度。以 2.0mL 蒸馏水为空白对照。以计算葡
萄糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，进行线性
回归，得标准曲线，计算回归方程。
配制 50μg /mL的小花八角多糖溶液，按上述方
法加入试剂，于 490nm处测定吸光度，将所测值代入
上述回归方程中计算小花八角粗多糖的含量。
1.3 单因素实验
1.3.1 不同时间对多糖提取率的影响 准确称取
20g小花八角，在料液比为 1∶11、提取温度为 75℃、超
声波功率为 300W 的条件下［21］，分别提取小花八角
多糖 1、1.5、2、2.5h，比较不同时间对小花八角多糖提
取的影响。
1.3.2 不同温度对多糖提取率的影响 准确称取
20g小花八角，在料液比为 1 ∶11、提取时间为 2h、超
声波功率为 300W的条件下，分别在 65、70、75、80℃
的条件下提取小花八角多糖，比较不同温度对小花
八角多糖提取的影响。
1.3.3 不同料液比对多糖提取率的影响 准确称取
20g小花八角，在提取温度为 75℃、提取时间为 2h、
超声波功率为 300W 的条件下，分别以 1 ∶ 5、1 ∶ 8、
1∶11、1∶14 的料液比提取小花八角多糖，比较料液比
对其的影响。
1.3.4 不同超声波功率对多糖提取率的影响 准确
称取 20g小花八角，在料液比为 1 ∶ 11、提取温度为
75℃、提取时间为 2h 的条件下，选择 200、300、400、
500W的超声波功率进行提取，比较不同的超声波功
率对多糖提取率的影响。
粗多糖的得率(%)=粗多糖质量(g)/小花八角
干燥枝叶质量(g)× 100
1.4 正交实验
在单因素实验的基础上，准确称取 30g(由于小
花八角的提取率较低，遂在正交实验中提高小花八
角的质量)小花八角枝叶以料液比、提取时间、提取
温度、超声波功率为 4 个因素，各取 3 个水平，用
L9(3
4)正交表进行实验，见表 1。
表 1 正交实验因子和水平表
Table 1 Factor and level of orthogonal test
水平
因素
A料液比
(V/V)
B温度
(℃)
C时间
(h)
D超声波
功率(W)
1 1∶8 70 1.0 300
2 1∶11 75 1.5 400
3 1∶14 80 2.0 500
1.5 体外清除自由基活性
1.5.1 羟基自由基体系 Fenton 反应体系［22］模型:
体系依次加入水杨酸、H2O2 和 Fe
2 +，H2O2 在 Fe
2 +的
催化作用下分解产生·OH，而水杨酸与·OH 反应生
成紫色化合物。该化合物在 510nm 波长处有强吸收
值。在上述体系中再加入多糖溶液，若具有清除·OH
的功能，与水杨酸反应结合的·OH 就会减少，而使紫
色化合物减少，从而使 510nm处吸收值降低。
用蒸 馏 水 配 制 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、
4.0mg /mL的小花八角多糖溶液，向 96 孔微量滴定板
中加入上述一系列不同浓度的多糖溶液 75μL(3 个
平行) ，加入相同体积的反应体系(8.8mol /L H2O2，
9mmol /L Fe2 +，9mmol /L水杨酸－乙醇溶液各 15μL) ，
37℃烘箱中反应 30min，然后以蒸馏水为参比，与加
入水的反应体系作空白对照，在酶标仪 510nm 处测
量吸光度 Ax，空白对照 A0，根据公式计算得多糖对·
OH的清除率。计算公式如下:
清除率(%)=(A0－Ax)/A0 × 100
同样地，按上述方法，以 VC 作为对照组同时进
行测定。
1.5.2 DPPH 自由基体系［23］ 用蒸馏水配制 12.5、
25、50、100、200、800μg /mL 的小花八角多糖溶液，向
96 孔微量滴定板加入 50μL不同浓度多糖溶液(3 个
平行) ，再加入 50μL 120μmol /L 的 DPPH(使用蒸馏
水配制) ，遮光反应 30min 后，在 525nm 的条件下测
量器吸光值为 Ai。同时，在滴定板中加入 50μL不同
浓度的多糖溶液与 50μL的无水乙醇溶液，混匀后吸
光值为 Aj;取 50μL DPPH 和 50μL 的无水乙醇为空
白对照，吸光值为 A0，计算公式如下:
清除率(%)A =［1－(Ai－Aj)/A0］× 100
与此同时，用上述方法，绘制 VC 曲线，以 VC 作
参照［24］。
2 结果与分析
2.1 粗多糖的提取与含量测定
以标准葡萄糖绘制标准曲线如图 1 所示，y =
0.0242x + 0.0686，Ｒ2 = 0.9961。小花八角多糖溶液反
应后吸光度值为 0.363，带入到回归方程计算得小花
八角粗多糖中糖含量为 12.15%。
207
图 1 多糖含量标准曲线
Fig.1 Calibration curve for content of polysaccharide
2.2 单因素实验
2.2.1 不同时间对多糖提取的影响 从图 2 分析可
知，在料液比为 1∶11、提取温度为 75℃、超声波功率
为 300W 的条件下，提取时间为 2h 时，多糖得率较
高，为 0.55%。随着时间的增加，2.5h 的提取率与 2h
的提取率变化不大，所以从经济适用角度，选择提取
时间为 2h为宜。
图 2 不同时间对多糖得率的影响
Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate
of Illicium micrantbum polysaccharide
2.2.2 不同温度对多糖提取的影响 从图 3 分析可
知，在料液比为 1∶11、提取时间为 2h、超声波功率为
300W的条件下，随着温度的升高，多糖得率不断上
升。当温度达 75℃时，得率最大，为 0.92%。但如果
温度过高，容易破坏多糖的结构，不利于提取，所以
初步确定最佳温度为 75℃。
图 3 不同温度对多糖得率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate
of Illicium micrantbum polysaccharide
2.2.3 不同料液比对多糖提取的影响 比较料液比
对多糖提取的影响，计算其得率，见图 4。结果表明，
当料液比为 1∶11 时，得率可达 0.51%，此后随着料液
比的增加，多糖得率没有呈上升趋势，其可能原因是
小花八角的水溶性多糖含量是一定的，当料液比为
1∶11 时，20g小花八角中的水溶性多糖已基本全部
浸出。
图 4 不同料液比对多糖得率的影响
Fig.4 Effect of material / liquid ratio on extraction rate
of Illicium micrantbum polysaccharide
2.2.4 不同超声波功率对多糖提取的影响 比较不
同的超声波功率对多糖提取的影响，计算多糖得率，
见图 5。结果表明，随着功率的加大，小花八角的得
率随着功率的加大而提高，300W 超声波功率时，小
花八角多糖得率为 0.75%。因为超声功率的增强，
使得小花八角内的多糖分子大量溶出。而当功率达
到 400W时，得率呈下降的趋势。这可能是因为功率
过大时反而使得多糖分子分解在水中，从而导致得
率下降。
图 5 不同超声波功率对多糖得率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate
of Illicium micrantbum polysaccharide
2.3 正交实验
准确称取 30g 小花八角枝叶(由于单因素实验
得多糖得率太低，所以在正交实验中提高了样品的
质量) ，根据表 2 可知，比较 4 个因素的极差 Ｒ 值发
现，ＲA ＞ ＲC ＞ ＲB ＞ ＲD，可看出料液比对多糖提取的得
率影响最大，其次为提取时间、提取温度，最后为超
声波功率。所以最佳工艺组合为 A3B2C3D1，即料液
比为 1∶14，温度为 75℃，提取时间为 2h，超声波功率
为 300W，多糖得率为 0.83%。
将正交实验表进行方差分析，结果如表 3。可
知，料液比影响显著(F ＞ F0. 10) ，说明在提取小花八角
水溶性多糖时料液比起着重要的作用。
2.4 体外清除自由基活性
2.4.1 羟基自由基清除 羟基自由基是活性氧最强
208
的自由基之一，它可以迅速地与有机化合物发生一
系列的反应，破坏生物体的细胞结构，影响其功能，
进而导致疾病的发生，危害生物体的健康。在 96 孔
微量滴定板中，采用 fenton体系观察小花八角多糖对
羟基自由基的清除能力［25］。结果如图 6 所示，清除
率随着浓度的增大而加强，表明多糖浓度与羟自由
基的清除率呈正相关，并得回归方程 y = 0.1070x +
0.1187，Ｒ2 = 0.9921。当多糖浓度在 4mg /mL 时，清除
率达到了 54%。随着多糖浓度的提高，羟自由基的
清除能力提高，表明小花八角多糖对羟自由基具有
一定的清除效果。
表 2 正交实验结果
Table 2 The results of orthogonal test
序号 A B C D 得率(%)
1 1 1 1 1 0.56
2 1 2 2 2 0.63
3 1 3 3 3 0.65
4 2 1 2 3 0.73
5 2 2 3 1 0.83
6 2 3 1 2 0.66
7 3 1 3 2 0.78
8 3 2 1 3 0.81
9 3 3 2 1 0.82
k1 0.615 0.689 0.679 0.740
k2 0.738 0.757 0.727 0.689
k3 0.807 0.714 0.753 0.731
Ｒ 0.192 0.068 0.074 0.051
最优水平 A3 B2 C3 D1
A ＞ C ＞ B ＞ D
表 3 方差分析表
Table 3 Variance analysis of orthogonal test
方差来源 SS df F 显著性
料液比 0.057 2 14.25 *
温度 0.007 2 1.75
时间 0.009 2 2.25
功率(误差) 0.004 2 1
注:F0. 05(2，8)= 19.37，F0. 10(2，8)= 9.37;当 F ＞ F0. 10时，差异
显著，用* 表示。
图 6 羟基自由基清除作用
Fig.6 The scavenging effect of
Illicium micrantbum polysaccharide on hydroxyl radicals
2.4.2 DPPH自由基清除 作为一种稳定的自由基，
DPPH可以捕获清除其他的自由基，通过加入生物试
剂对 DPPH自由基的清除能力来判断其抗氧化能力
的强弱。DPPH作为一种监测反应的物质，多用于抗
氧化成分的体外抗氧化性实验中。向 96 孔微量滴
定板中按上述方法测定小花八角多糖与 VC 溶液对
DPPH的清除率，结果如图 7。由图可知，小花八角多
糖与 VC 溶液对 DPPH 自由基均有清除的功效。在
相同条件下，小花八角多糖的清除效果均低于 VC 的
清除效果。在 800μg /mL 的条件下，VC 对 DPPH 自
由基的清除率高达 97.09%，而小花八角多糖的清除
率则为 52.64%。表明小花八角多糖对 DPPH自由基
也是具有一定的清除效果。
图 7 DPPH自由基清除作用
Fig.7 The scavenging effect of
Illicium micrantbum polysaccharide on DPPH·radicals
3 结论
本研究通过单因素实验和正交实验，得到在超
声波辅助提取小花八角多糖的最佳工艺条件:料液
比为 1∶14，温度为 75℃，提取时间为 2h，超声波功率
为 300W。通过正交实验与方差分析又得到在提取
过程中料液比对提取的结果影响较大，其次是提取
时间、提取温度，最后为超声波功率。在最优条件下
小花八角多糖的提取率为 0.83%。
自由基的清除可以使机体增强体内的抗衰老系
统或是维持机体的健康生长，所以研究多糖清除自
由基的能力显得尤为重要［26］。小花八角多糖能有效
地清除 Fenton反应产生的羟基自由基，当小花八角
多糖浓度在 4.0mg /mL时，对羟自由基的清除效率在
50%以上;而对 DPPH 自由基的清除率测定中，清除
率在 50%以上的多糖浓度为 800μg /mL，但小花八角
粗多糖对两种自由基的清除能力均低于阳性对照组
VC 的清除能力。
本文研究的小花八角初步纯化多糖对羟自由基
和 DPPH自由基都有一定的清除效果，推测小花八角
水溶性的纯化多糖可能对这两种自由基在同等浓度
下有更高的清除率，以及对于其他自由基也有相关
的清除作用，但还有待于实验进一步证实。
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