全 文 ：〔收稿日期〕2007-12-27
〔基金项目〕湖南省教育厅资助项目(03C292)。
〔作者简介〕刘叶蔓(1975-),女,湖南新化人,讲师,主要从事药用植物学的教学和研究。
凹叶厚朴愈伤组织中厚朴酚及和厚朴酚的
提取方法和工艺的优选研究
刘叶蔓 1,曾 婷 1,赵碧清 1,段湘兰 2
(1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2.湖南省农科院职工医院,湖南 长沙 410125)
〔摘要〕目的 研究凹叶厚朴愈伤组织中厚朴酚及和厚朴酚提取方法和工艺的优选。方法 采用超声波法、浸
渍法及浸渍-超声波法提取厚朴酚及和厚朴酚,采用高效液相色谱法测定凹叶厚朴愈伤组织中酚的含量;采用正
交试验设计,以超声波法为提取工艺,进一步考察溶剂、温度、提取时间对含量检出值的影响。结果 厚朴酚与和厚
朴酚的含量浸渍法为 0.135%与0.017%,超声波法为0.144%与0.018%,浸渍-超声波法为 0.146%与 0.018%;最佳
工艺为A3B2C3,即用丙酮 30℃超声提取 60min。结论 本试验的结果可以为凹叶厚朴的生物技术利用提供科学
的实验及理论依据。
〔关键词〕凹叶厚朴;愈伤组织;厚朴酚;和厚朴酚;提取方法;工艺优选
〔中图分类号〕R284.2 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1674-070X(2008)02-0028-03
Studiesonextractingwaysofmagnololandhonokiolfrom
calusinMagnoliabiloba(Rehd.etWils)cheng
andoptimizingtechnology
LIUYe-man,ZHAOBi-qing,ZENGTing,DUANXiang-lan
(TCMUniversityofHunan,Changsha,Hunan410007,China)
〔Abstract〕ObjectiveTostudythewayofextractingthemagnololandhonokiolfromthe
calusinMagnoliaoficinalisRehd.etWils.var.bilobaRehd.etWilsandtheselectionofsuperior
technology.MethodsMagnololandhonokiolwereextractedwiththeultrasonicwaveway,the
immersionwayandtheimmersion-ultrasonicwaveway;thecontentofthemagnololandhon-
okiolinthecalusoftheMagnoliawasdeterminedwithHPLC;thesolvent,temperatureand
extractingtimeweresearchedfortheefectonthetestdigitwiththeorthogonaldesigntests
andtheultrasonicwaveway.ResultsThecontentsofMagnololandhonokiolwere0.135% and
0.017% withtheimmersionwayand0.144% and0.018% withtheultrasonicwavewayand
0.146% and0.018% withtheimmersion-ultrasonicwaveway,whichshowsthatthebesttech-
nologywasthegroupA3B2C3.ConclusionTheresultcanprovideafoundationforthebiotech-
nologyusingofMagnoliaoficinalisRehd.etWils.var.bilobaRehd.etWils.
〔Keywords〕Maganoliabiloba (RehdetWils)cheng;calus;magnolol;honokiol;extrac-
tion;technology
2008年4月第28卷第2期
Apr.2008Vol.28No.2
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
JournalofTCM Univ.ofHunan28
表1不同提取方法含量测定结果 (%)
供试液
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
厚朴酚含量(a)
0.144
0.135
0.146
和厚朴酚(b)
0.018
0.017
0.018
酚总量(a+b)
0.162
0.152
0.164
图2凹叶厚朴愈伤组织供试品HPLC色谱图
图1厚朴酚及和厚朴酚对照品HPLC色谱图
凹叶厚朴 MagnoliaoficinalisRehd.etWils.var.biloba
Rehd.etWils为木兰科落叶乔木,以其干燥的干皮、根皮
及枝皮入药,是胃肠道疾病常用的中药,具有温中下气、
化湿引滞的功效。其主要成分是厚朴酚与和厚朴酚。刘贤
旺等研究了凹叶厚朴的组织培养和愈伤组织超低温保存
技术[1,2],得到了愈伤组织诱导及增殖的基本培养基。有人
测定了厚朴愈伤组织中有效成分的含量[3],但凹叶厚朴愈
伤组织有效成分含量测定未见有报道。本文在此基础上,
以凹叶厚朴愈伤组织为实验材料,通过不同的提取方法
与正交试验,比较同一实验材料含量检出值的差异,确定
凹叶厚朴愈伤组织中厚朴酚及和厚朴酚的最佳提取工
艺。
1实验材料
1.1 试剂
经凹叶厚朴愈伤组织诱导培养基:B5+6-BA1.0mg/L+
NAA0.1mg/L诱导愈伤组织,在生长培养基 B5+6-BA
4.0mg/L+NAA0.5mg/L上增殖所得的愈伤组织,60℃
干燥至恒重,碾碎,过60目筛;甲醇,色谱纯;丙酮,分析纯;
乙醇,分析纯;水为重蒸水;厚朴酚及和厚朴酚对照品(中
国药品生物制品检定所提供,供含量测定用)。
1.2 仪器
HP1100系列高效液相色谱仪 (美国安捷伦);GNP-
9002型电热恒温培养箱 (中新医疗仪器有限公司);
KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司);AF1004电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。
2方法与结果
2.1 不同提取方法对厚朴酚与和厚朴酚含量的影响
2.1.1 样品供试液的制备 ①超声波法:精密称定愈伤
组织粉末 100mg,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇 25
mL,称质量,40℃水浴,超声 40min,冷却,擦干,加甲醇
补足损失的质量,取上清液过滤,为供试液Ⅰ。②浸渍法:
精密称定愈伤组织粉末100mg,置具塞锥形瓶中,精密加
入甲醇 25mL,称质量,摇匀,密塞,室温浸渍 24h,加甲
醇补足损失的质量,取上清液过滤,为供试液Ⅱ。③浸渍-
超声法:精密称定愈伤组织粉末 100mg,置具塞锥形瓶
中,精密加入甲醇 25mL,称质量,摇匀,密塞,浸渍 24h
后于 40℃水浴超声 40min,冷却,擦干,加甲醇补足损
失的质量,取上清液过滤,为供试液Ⅲ。
2.1.2 色谱条件 DiamonsilC18柱(150mm×4.6mm,5
μm),柱温为 25℃,流动相为甲醇∶水(78∶22),流速为
1.0mL/min,DAD二极管阵列紫外检测器,检测波长为
294nm[4-6]。
2.1.3 标准曲线及精密度 精密称取厚朴酚及和厚朴酚
对照品各10.0mg,分别置于100mL的量瓶中,加甲醇溶
解并定容至刻度,作为储备液。分别移取0.5、1.0、2.5、5.0、
7.5mL厚朴酚及和厚朴酚储备液,混合置于100mL容量
瓶中,加甲醇至刻度,即得浓度分别为0.5、1.0、2.5、5.0、7.5
’g/mL的对照品溶液。精密吸取20’L进样,记录色谱图,
进样量与峰面积关系经计算机处理得回归方程为:
厚朴酚:Y=503.35X-16.71,r=0.9983(n=5);
和厚朴酚:Y=40.01X-12.52,r=0.9962(n=5)。
取供试品溶液Ⅰ,按照上述色谱条件,进 6针,分别
计算厚朴酚、和厚朴酚峰面积的相对标准偏差,分别为
2.72%、1.65%。色谱图记录结果见图1、2。
2.1.4 稳定性试验 取供试品溶液,分别在 0、4、8、12、
24、48h进样 20’L,计算厚朴酚、和厚朴酚峰面积的相
对标准偏差分别为 1.57%、1.92%,表明供试品溶液在 48
h内稳定。
2.1.5 样品测定结果 精密吸取上述3种样品供试液 20
’L、对照品溶液 (1.0’g/mL)20’L注入高效液相色谱
仪,按上述色谱条件测定其峰面积积分值,按外标两点法
计算含量,结果见表1。
2.2 正交设计优选超声法的最佳工艺条件
2.2.1 以超声波法为提取工艺,考察溶剂、温度、提取时
间3因素对含量检出值的影响。各因素水平见表2。
2.2.2 正交试验及结果 经过3种提取方法的比较,得出
t/min
t/min
刘叶蔓,等 凹叶厚朴愈伤组织中厚朴酚及和厚朴酚的提取方法和工艺的优选研究第2期
m
A
u
m
A
u
29
表2正交试验因素水平
水平
1
2
3
A溶剂
甲醇
乙醇
丙酮
B温度(℃)
20
30
40
C时间(min)
20
40
60
浸渍法检出值最低,浸渍-超声法检出值最高,而超声法
的检出值间于两者之间,与超声-浸渍法的检出值相差
0.002%,相差不大。鉴于超声法比浸渍-超声法快速,因此
对超声法的提取工艺条件进行优化,选用 L9(34)正交表,
根据实验号分别考察提取溶剂、温度、时间3个因素,表3
直观分析表明,影响因素顺序是 A>B>C。由表 4方差分
析表明,A因素(溶剂)对厚朴酚与和厚朴酚含量的总和
各水平之间具有显著意义,B因素(温度)与C因素(提取
时间)没有显著性意义。最佳组合是A3B2C3,即:以丙酮为
溶剂,在 30℃温度条件下,超声提取 60min,且 A因素
具有显著性。因A3B2C3在正交表找不到,故应作验证实
验。
2.2.3 验证实验 精密称定愈伤组织粉末100mg,置具
塞锥形瓶中,按上述优选出的最佳工艺条件精密加入丙
酮25mL,称质量,30℃水浴,超声60min,冷却,加丙酮
补足损失的质量,取上清液过滤,得供试品溶液。按上述
色谱条件测定厚朴酚与和厚朴酚峰面积积分值,按外标
两点法计算含量,结果厚朴酚为0.1725%、和厚朴酚为
0.0241%,其含量较正交表 3中最高者(5号)还高,表明
该组合工艺为最佳工艺。
表3正交试验结果
表4L9(34)方差分析
变异来源
A
B
C
Eror
SSg
0.0069
0.0039
0.0007
0.0015
f
2
2
2
4
MS
0.0034
0.0020
0.0004
0.0004
F
8.888
5.103
0.905
P
<0.05
>0.05
>0.05
3讨论
本试验以凹叶厚朴的愈伤组织为检测材料,采用高效
液相色谱法进行其厚朴酚及和厚朴酚含量的测定。从表1
和表2可以看出,凹叶厚朴愈伤组织中厚朴酚及和厚朴酚
含量很少,两酚总量在0.1054%~0.1836%之间。比较不
同的提取方法,超声波法较传统的浸渍法检出值高
0.01%,比浸渍-超声波法检出值低0.002%,超声波法简单
快速,能提高试验效率,故最后确定用超声法提取。对超声
法进行了L9(34)正交设计实验,优选出最佳工艺为:A3B2C3,
即用丙酮作溶媒,置30℃水浴,超声60min为优。
参考文献:
[1]刘贤旺,杜 勤,赖学文,等.凹叶厚朴组织培养的研究[J].江西林
业科技,1997(2):1-2.
[2]刘贤旺,杜 勤.凹叶厚朴愈伤组织的超低温保存[J].植物资源与
环境,1996,5(1):9-13.
[3]童再康,朱玉球,王章荣.厚朴组织培养与高产细胞系建立的研究
[J].南京林业大学学报(自然科学版),2002,26(4):23-26.
[4]中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].北京:化学工业出版社,
2005:176.
[5]李阳春,高家鉴,张伟敏,等.厚朴姜制前后厚朴酚及和厚朴酚总量
的变化[J].中成药,2001,23(6):415-417.
[6]黄淑彰,黎小伟.厚朴药材中厚朴酚含量测定方法研究综述[J].中
国药事,2002,16(8):499-502.
注:F0.05(2,4)=6.94;F0.01(2,4)=18.00。
(本文编辑 徐爱良)
湖南中医药大学学报 2008年第28卷30