全 文 ：!!《癌症》#$%&’(’ )*+,&-. */ #-&0’,1 23321 24 56 7：!! 8 !9
收稿日期：2334:44:46;修回日期：2334:42:44
基金项目：国家重点基础研究发展规划项目 5
4<<93?444! 7 ;国家杰出青年基金 5=*> !<92?42@ 7
%通讯作者：A’.：9@ 8 22 8 9!4234<
B-C：9@ 8 22 8 9!42@99
D:E-%.：0-%F%&G32H 4@!> &’I
中药光叶合欢为豆科合欢属植物，文献报道其
同属植物茎皮的化学成分有抗癌活性 J 4 K，但未见对
光叶合欢的化学成分和生物活性的研究报道，本实
验室在体外实验中发现光叶合欢提取物能抑制多种
光叶合欢提取物诱导细胞凋亡的研究
蔡 兵%， 张华凤， 张冬云， 崔承彬， 李文欣
5天津生物医药研究所活性室，天津 !33!96 7
【摘 要】 背景与目的：光叶合欢为豆科合欢属植物，文献报道其同属植物茎皮的化学成分有抗癌活性，但未
见对光叶合欢的化学成分和生物活性的研究报道，本文的目的是探讨光叶合欢提取物诱导癌细胞凋亡及其机制。方
法：采用四甲基偶氮唑盐（略称 LAA）法、细胞核形态学特征检测法、细胞颗粒粒度分析法、琼脂糖凝胶电泳法以及流
式细胞术等细胞生物学手段，检测光叶合欢提取物对癌细胞增殖和细胞周期的影响以及诱导癌细胞凋亡的作用。应
用细胞微生理感应仪（0MI*(’&(*, E%0,*N$M(%*E’I,M）检测癌细胞在活细胞状态下对药物的反应，并利用蛋白印迹法研
究药物作用后凋亡相关蛋白 OPQO、F0.:2 和 R-C的变化情况。结果：光叶合欢提取物对癌细胞有明显的增殖抑制作
用，并通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥此作用，对 S?@2 细胞株的半数抑制浓度（T#?3）为（2<> 36 U 42> @）!G V E.。蛋白
印迹检测结果显示，光叶合欢提取物作用后肿瘤细胞内的 OPQO蛋白被剪切，R-C蛋白的表达量增高，而 F0.:2 蛋白
的表达量未见明显变化。结论：光叶合欢提取物具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，且这一作用可能与上调 R-C蛋白表
达有关。
关键词：光叶合欢；细胞凋亡；机制
中图分类号：Q<@2 文献标识码：P 文章编号：4333 8 6@W（2332）36 8 3!! 8 3@
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L’0$-&%(E
!#
人癌细胞生长，如人慢性髓性白血病细胞 $%&’、人
淋巴瘤细胞 ()!、人急性早幼粒白血病细胞
*+,&-、人大肠癌细胞 *./,0%、人纤维肉瘤细胞
*/,0-1-，有广泛的开发应用前景。本文探讨了光叶
合欢提取物对 $%&’ 细胞和 *./,0% 细胞的凋亡诱
导活性及其相关机制。
! 材料和方法
! ! 实验材料
02 02 0 细胞株：$%&’和 *./,0%细胞用含 0-3 胎
牛血清、0-- ( 4 56 青霉素、0-- !7 4 56 链霉素、
-2 ’3 89*.:! 的 ;<=>,0&#- 培养基，在 !? %3
.:’的培养箱内培养。
02 02 ’ 药物处理：取光叶合欢的干燥茎皮 0-- 7，
用 0 + %-3乙醇反复提取 !次，合并提取液，过滤后
减压浓缩，得光叶合欢提取物。将光叶合欢提取物溶
于 1-3甲醇，配成实验所需各浓度。实验同时设空
白对照和阳性对照，阳性药选用顺铂，终浓度为 %-
!7 4 56。
02 02 ! 试剂：;<=>,0&#- 培养基、胎牛血清均为
@ABCDBE6产品；四甲基偶氮唑盐 （!, F#，%,GA5HIJK6,
’,IJA9LD6K6 M ,’， %,GANJHOK6,IHIE9LD6AP5 BED5AGH）、顺
铂 （CAQN69IAOR CSS<）、*DHCJQI !!’%1、碘化丙啶
（
日本和光制药工业株式会社产品；UOOHVAO W,X>/.
检测试剂盒为 /;YW>@Y82 >OC产品；兔 BC6,’、Z9V多
抗、鼠
+A[H TCAHOCH .D 产品；Y.+ 发光试剂盒为 <>Y;.Y
.JH5AC96 .D5N9OK产品。
02 02 # 仪器：T
=D6HCP69E SH]ACHQ .DENDE9IADO 出 品 ； .DP6IHE
=P6IAQALHE型颗粒计数仪、Y<>.T \+型四色流式细
胞仪均为 .DP6IHE出品；=-10型荧光显微镜 :6K5NPQ
出品。
! # 实验方法
02 ’2 0 =// 法检测药物对 $%&’ 细胞增殖的作
用：取对数生长期 $%&’按 ’ ^ 0-% 4 56的密度接种
到 )&孔板中，!?培养。0’ J后加入 CSS<和光叶
合欢提取物，使光叶合欢提取物的终浓度分别为
&2 ’%、0’2 %、’%、%-、0-- !7 4 56。处理 ’# J后加入
=//液，!?培养 # J，#?、’ --- E 4 5AO离心 % 5AO，
吸去上清后，每孔加入 0-- !6 S=T:溶解，利用酶标
仪测定各孔于 %- O5处的光密度（以下称 !）值 F ’ M。
按如下公式计算细胞增殖抑制率，并利用 8ST/软
件计算半数抑制浓度。
抑制率 _ F ‘ ! 空白 a ! 样品 b 4 ! 空白 M ^ 0--3
02 ’2 ’ 荧光显微镜检测药物对 $%&’ 细胞核形态
学特征的影响：$%&’细胞经 %- !7 4 56 CSS<和 %-
!7 4 56光叶合欢提取物分别作用 ’# J后，离心收集
细胞，加入 -2 %3 $.6室温静置 0% 5AO后，离心吸去
上清，加入甲醇 ,乙酸（!c 0）的固定液，将细胞滴于
载玻片上，待稍干燥后，滴加一滴 *DHCJQI !!’%1溶
液，荧光显微镜下观察、照相 F ! M。
02 ’2 ! 颗粒粒度分析仪检测药物对 $%&’ 细胞体
积大小的影响：$%&’细胞经 %- !7 4 56 CSS<和 %-
!7 4 56光叶合欢提取物分别作用 &、0’、’# J后，离
心收集细胞，用 .DP6IHE =P6IAQALHE >>型全自动颗粒粒
度分析仪检测细胞体积大小分布，每次检测的虹吸
体积为 %-- !6 F # M。
02 ’2 # 琼脂糖凝胶电泳检测药物对 $%&’ 和
*./,0%细胞总 S8U的作用：$%&’、*./,0%细胞经
%- !7 4 56的 CSS<和 %- !7 4 56光叶合欢提取物分
别作用 ’# J后，离心收集细胞，分别加入细胞裂解
液 !?静置过夜，#?、0’ --- E 4 5AO离心取沉淀即
总 S8U，加入适量 /Y缓冲液溶解。用 ’3琼脂糖凝
胶于 0 ^ /ZY缓冲液中电泳 ’ J以分离总 S8U，0-
W 4 C5。 然后用 % !7 4 56 YZ染色 0- 5AO，在紫外透
射反射仪下检测，并利用电泳凝胶自动成像系统拍
照 F % M。
02 ’2 % 流式细胞仪检测诱导 $%&’ 细胞凋亡及对
细胞周期影响：离心收集经 CSS<和 ’%、%-、0-- !7 4
56 的光叶合欢提取物分别作用 &、0’、’# J 后的
$%&’细胞，-3乙醇固定过夜后离心取沉淀物，加
入 0 57 4 56 ;8U 酶 U 溶液 !?消化 !- 5AO，
02 ’2 & dHQIHEO B6DI 检测凋亡相关蛋白的变化：
CSS<和光叶合欢提取物分别作用 *./,0% 细胞 ’#
J后，按常规方法提取细胞总蛋白，经聚丙烯酰氨凝
胶电泳分离后，用电转移的方法将蛋白转移至硝酸纤
维素膜上，#3的脱脂奶粉封阻过夜，!?条件下
02 ’2 对细胞代谢的影响：CSS<及光叶合欢提取
物分别用 EPOOAO7 BP[[HE（低缓冲能力 ;<=>,0&#- 培
蔡 兵R等 2 光叶合欢提取物诱导细胞凋亡的研究
!#
$ %&
蔡 兵’等 ( 光叶合欢提取物诱导细胞凋亡的研究
养液）稀释成终浓度为 #) !* + ,-的样品缓冲液供
用。取对数生长期 .%/01#细胞，稀释成密度为 2 3
1)# + ,-的细胞液，每一个 %4567-8 975中加入 1 ,-
细胞液，于 %:2培养箱中 !;培养过夜，细胞贴壁
后，将此 98-- 975放入 68<6=> 9?4,@8>检测药物对细
胞外酸化率的影响，以加药前的酸化率为 1))A，计
算加药后细胞外的酸化率 B C D。
1( 2( C 统计学方法：实验数据以平均值 E标准差
（! #）表示，用 F$F软件进行统计学处理。
! 结 果
! # $%%法测试结果
光叶合欢各浓度提取物对 G#H2 细胞的增殖均
有抑制作用，且呈良好的量效关系，与等浓度的 9I0
IJ效果相当，结果见表 1。2#、#)、1)) !* + ,-光叶合
欢提取物组同空白对照组比较有非常显著差异 （$
K )( ))1）。用 LIF/软件计算出其对 G#H2细胞的
M%#)为（2N( )O E 12( H）!* + ,-。
! ! 荧光显微镜检测细胞核变化结果
G#H2细胞用 #) !* + ,-的 9IIJ和光叶合欢提
取物分别处理 2O ?后，经 .=89?6P !!2#C染色，在荧
光显微镜下均可见许多凋亡细胞核特征性荧光斑
点，细胞呈胞膜裹着的许多雪花状小泡，最终形成许
多散在的凋亡小体，如图 1所示。
表 ! 光叶合欢提取物对 #$% 细胞增殖抑制活性
&’() ! *+,-./012-340’,-1+ 53346, 13 !#$%%$& ’()$*$+, -.
/$0102 57,0’6, 1+ #$% 84229
Q>=75
&-4
H( 2# !* + ,- $SL
12( #) !* + ,- $SL
2#( )) !* + ,- $SL
#)( )) !* + ,- $SL
1))( )) !* + ,- $SL
/86P /T,86
1C
1C
1C
1C
1C
1C
21
% U4-78
1( C)O E )( !)H
)( OOH E )( )CN%
1( CO E )( 22N
1( 1# E )( 2)H
)( H2 E )( OHO%
)( !! E )( OHC%
)( 1N2 E )( 1)C%
MV >4P8（A）
+
#( !
1( 1
#( )
#( C
N( !
CN( !
%%=,54>8W XTP? @-4
! & 颗粒计数仪检测细胞体积变化的结果
正常 G#H2细胞直径主要分布在 1) [ 1 !,，占
总细胞数的 （HC( H2 E O( 2O）A ，而 2 [ 1) !, 为
\ 2N] ## E O] #! ^A。当细胞受 #) !* + ,-的光叶合欢
提取物作用不同时间后，直径在 1) [ 1 !,区间的
细胞数明显减少，而在 2 [ 1) !,之间的细胞明显
增多，同空白对照组比较有非常显著的差异 （$ K
)( ))1），如表 2所示。相比之下，9IIJ组细胞直径变
化较缓慢。
! ’ 琼脂糖凝胶电泳检测结果
空白对照组细胞 IL$ 提取物经琼脂糖凝胶电
泳后只检测到一条总 IL$ 条带，而用 #) !* + ,-
9IIJ和光叶合欢提取物处理 2O ?后，均检测到细
胞发生凋亡时由于 IL$的规律性降解而形成的梯
状带，如图 2所示。
! ( 流式细胞术分析结果
空白对照组细胞中 F7@ Q1期细胞含量较低，而
不同浓度光叶合欢提取物作用不同时间后，F7@ Q1
期细胞百分率逐渐增高，与相应时间的空白对照组
相比均有统计学意义 \ $ K )( )1，$ K )( ))1 ^，存在
明显的时间依赖性和浓度依赖性，见表 !。相比之
下，同浓度的药物作用相同时间后，9IIJ对细胞周
期的影响不如光叶合欢提取物明显。
! ) 对凋亡相关蛋白的影响
空白对照组检测到的 11H RI4 的 J$_J 蛋白，
经 9IIJ和光叶合欢提取物作用 2O ?后，均被剪切
图 1 .=89?6P !!2#C染色后荧光显微镜观察光叶合欢提取物对 G#H2细胞核的影响
‘T*( 1 Yaa89P =a %&’())(* +,-(.(/0 12 3(4- 8ZP>49P =< G#H2 98--6 <79-84> ,=>5?=-=*V W8P89P8W XTP? ?=89?6P !!2#C 6P4T
!# 蔡 兵$等 % 光叶合欢提取物诱导细胞凋亡的研究
为 &’ ()*。同空白对照组比较，两者均使凋亡相关
蛋白 +*,的表达水平增高，而 -./01蛋白的表达水平
未发生明显的变化，结果见图 !。
! # 对细胞代谢的影响
’2 !3 4 5/ 的光叶合欢提取物能降低 67809’
细胞的细胞外酸化率（:7;<），即细胞代谢率。.))=
作用 >% 1! ?后，:7;<降至最低值 9’% @A；而光叶
合欢提取物作用 2% #1 ?后，:7;<即可降至最低值
!% 2A，然后继续给药，两者的 :7;<均保持平稳，不
再变化，结果见图 >。
$ 讨 论
借用现代提取分离技术，采用分子生物学手段
和动物模型进行中药提取部位和主要成分的筛选，
是中药现代化研究的重要手段。本实验室利用 B88
法，以抑制肿瘤细胞增殖为活性指标，对上百种中
药粗提物进行活性筛选，确定出一些有较好生物活
性、具有深入研究价值的植物，光叶合欢即是其中
之一。
B88 法发现光叶合欢提取物对多种人癌细胞
*7C5D*EFG HIJ? -/*K(，! L 2% 29M - 7C5D*EFG HIJ? -/*K(，! L 2% 229M ;NO：#$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J
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表 ! 药物处理不同时间后的 #$!细胞直径分布情况
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图 ! WFTJFEK -/CJ 法检测光叶合欢提取物对 =;<=、+*, 和
-./01 蛋白的影响
XI3 ! :YYF.J CY #$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J CK =;<=$ +*,
*KG -./01 DECJFIKT F,DEFTTICKT -Z WFTJFEK -/CJJIK3% ;[ +/*K(M +[
.))= ’2 !3 4 5/，1> ?M 7：#$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J 1’ !3 4 5/，
1> ?M )：#$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J ’2 !3 4 5/，1> ?%
图 1 琼脂糖凝胶电泳检测光叶合欢提取物对总 )O;的影
响
XI3% 1 :YYF.J CY #$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J CK JCJ*/ )O;
.?F.(FG -Z *3*ECTF 3F/ F/F.JECD?CEFTIT% ;[ \’#1 .F// /IKFM +[
67809’ .F// /IKFM B[ )O; TJ*KG*EG 5*E(FE Q922 -D R；7[ +/*K(；)[
.))= ’2 !3 4 5/，1> ?M ;：#$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J ’2 !3 4
5/，1> ?%
图 > 用细胞微生理感应仪检测光叶合欢提取物对细胞代谢
的影响
XI3% > :YYF.J CY #$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J CK .F//
5FJ*-C/IT5T GFJF.JFG -Z .ZJCTFKTCE 5I.ECD?ZTIC5FJEZ% ;：.))=
’2 !3 4 5/；+：#$%&&%’ ()*%+%,- ./ 0%1#213 F,JE*.J ’2 !3 4 5/
!蔡 兵#等 $ 光叶合欢提取物诱导细胞凋亡的研究
有明显的增殖抑制活性，且呈良好的量效关系，对
%&’(细胞 )*&+为（(,$ +- . /($ ’）!0 1 23。凋亡细胞
形态学检测结果显示，光叶合欢提取物作用后肿瘤
细胞体积变小，细胞核皱缩致密，随着药物浓度的增
加，细胞核缩小成斑块状。流式细胞仪检测结果显
示，随着药物浓度和作用时间的延长，4+ 1 4/期、5
期和 4( 1 6期细胞比例逐渐减少，578 4/ 期细胞含
量逐渐增多。9:; 3<==>?被认为是细胞凋亡的典型
特征 @ , A，本文利用琼脂糖凝胶电泳的方法检测了光
叶合欢提取物对肿瘤细胞总 9:;的影响，实验结
果显示出清晰的 9:; 3<==>? 条带。综合上述实验
结果，无论是从形态学还是从生化学角度检测，都
证实光叶合欢提取物具有诱导肿瘤细胞凋亡的活
性。
目前认为 B;CB 蛋白的剪切是细胞凋亡的标
志。B;CB 在维持 9:; 的完整性方面起着重要作
用，在 9:; 损伤部位扮演分子感受器的角色，把
9:;损伤的信息传递给参与 9:;修复过程或改变
细胞周期的蛋白。当 B;CB 被降解后便失去了对
9:;完整性监护的作用，结果使受 B;CB负调控影
响的 *<( D 1 60( D依赖性核酸内切酶活性增高，裂解
核小体间的 9:;，引起细胞凋亡 @ /+ A。 本文检测了
B;CB蛋白的变化情况，发现肿瘤细胞经 &+ !0 1 23
的光叶合欢提取物作用 (- E后，细胞内的 //’ F9<
的 B;CB 蛋白被剪切成 G& F9< 的片段，进一步证
实光叶合欢提取物具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性。
8H3I( 家族蛋白在细胞凋亡调控中也扮演重要
的角色。8H3I(和 J
具有抑制细胞凋亡的作用，J
发生 @ // A。本文检测了光叶合欢提取物对细胞内 8H3I(
和 J
用可能是通过 J
吸产生乳酸及二氧化碳，两者由载体蛋白以离子的
形式转运到细胞膜外或者被动扩散到细胞膜外，
最终形成 L D。细胞微生理感应仪 （*MNOP>QPO?
6RH?OSEMPRO2>N>?）可直接检测 L D浓度的变化情况，
即细胞外的酸化率 T*;C，以此反映细胞代谢状
况，提供活细胞即时动态反应信息 @ /( A。因此，为了
确切地反映癌细胞在药物作用下的真实情况，本文
用微生理感应仪在活细胞状态下直接检测了光叶合
欢提取物对 L*UI/& 大肠癌细胞的作用特点，结果
显示光叶合欢提取物和 H99B 均能降低 L*UI/& 细
胞的细胞外酸化率，但前者要比 H99B作用快而且
强。
体外研究发现光叶合欢提取物对白血病细胞以
及固型癌细胞均有诱导凋亡的作用，作用发挥快而
强，有望成为治疗实体瘤有效的抗癌新药。我们正进
4?O7S
表 ! 流式细胞仪分析光叶合欢提取物对 #$%细胞细胞周期的影响
&’() ! *++,-. /+ !#$%%$& ’()$*$+, -. /$0102 *0.1’-. /2 3,44 35-4, /+ #$% 3,446 (5 74/8 35./9,.15
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第一届广州国际肿瘤学会议
大 会 通 知
由中山大学肿瘤防治中心主办的 “第一届广州国际肿瘤学会议”将于 $%%$ 年 &月 $#日至 !% 日在广州举行。届时还将举
行中山大学肿瘤医院建院 !# 周年及新医疗科研大楼落成庆典活动。
大会荣幸地邀请到了来自美国、法国、澳大利亚、德国、捷克等国家和香港地区的著名肿瘤学专家，其中包括诺贝尔医学奖
获得者 ’美国 ()* +,-./癌症中心的 0-123, 45 06278/19教授、:; <=>/1.?=癌症中心的两位副院长、@)AB+时辰化疗学会主
席和捷克科学院副院长等一批资深教授，另外国内也有多位院士和肿瘤学专家应邀在大会作专题报告。会议内容涉及肿瘤基
础研究和临床治疗的最新进展。
参加本次会议将获得国家级继续教育 C类学分 （编号：$%%$ ’ %& ’ %#%!D）
报名时间：$%%$年 & 月 E% 日前 （以邮戳时间为准，请勿电话报名以防遗漏）
地 址：广州市东风东路 FGE 号中山大学肿瘤防治中心广州国际肿瘤学会议筹备组
联系电话：%$% ’ #FG!F# ’ G!G%或 $### 传真：%$% ’ #G&G%F
联 系 人：曹烨 孙瑞
网 址：,HHIJ K K H27?1,5 9L.27.5 />25 3= K 3= K .M7I?.N27 K C=>/O5 ,H7
学 习 费：参见上述网址中 “申请表格”内容，请自带大一寸免冠照片一张。
中山大学肿瘤防治中心
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蔡 兵P等 5 光叶合欢提取物诱导细胞凋亡的研究
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一步对光叶合欢的活性成分进行追踪分离、鉴定其
结构，并系统研究其在动物体内的作用，为将其开
发成抗癌新药奠定基础。
Q参 考 文 献 R
邹 坤，陈四平，赵玉英，等 5 合欢属植物茎皮的化学成分与
药理活性 Q S R 5 国外医药·植物学分册，EDD，E$（G）：$%% ’
$%F5
马瑾瑜，顾映红，余竹元 5 用快速比色计量法测定细胞生长
Q S R 5 上海医科大学学报，EDD!，$%（&）：!%D ’ !EE5
彭旭阳，何执鼎，吴 杨 5 吡柔比星诱导结肠癌细胞株 4T ’
$F% 的凋亡 Q S R 5 癌症，EDDD，E#（F）：FF& ’ FF5
睩本贺英，刀祢重信，山田武 5 最新アポト一シス实验法
Q: R 5 东京都：羊土社，EDDG：#F ’ #5
王三龙，蔡 兵，崔承彬，等 5 中药苏木提取物对 UGF$ 细胞诱
导凋亡的研究 Q S R 5 癌症，$%%E，$%（E$）：E!F ’ E!D5
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C772=?6 :/H,?>.P EDDEP E!DJ $E ’ $F5
Q美 R 萨姆布鲁克，弗里奇，曼尼阿蒂斯 5 分子克隆实验指南
Q: R 5 第 $ 版 5 北京：科学出版社，EDD#：### ’ #D5
A-8N=?YNHL B;P 0//.?= +P T26XN=9 +P /H -65 <6H/1/> B 3/66
1/3/IH?1 6N9-=>. H1N99/1 - .28./H ?X /-16M B 3/66 .N9=-6. Q S R 5
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-..?3N-H/> YNH, /=>?9/=?2. /=>?=236/-./ -3HN\-HN?= Q S R 5 V-H21/P
ED#%P $#&J GGG ’ GGF5
任泽舫 5 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶、细胞凋亡与肿瘤 Q S R 5 肿
瘤防治研究，$%%%，$（!）：$!F ’ $!D5
<>-7. S:P +?1M 45 B,/ 836]$ I1?H/N= X-7N6MJ -18NH/1. ?X 3/66
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Q编辑：张 菊；校对：杨允贵 R
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