全 文 ：收稿日期:2013-11-18
基金项目:国家自然科学基金(81130069，31360082) ;云南省科技计划项目(2012CG019)
作者简介:段宝忠(1983-) ，男，硕士，副教授，主要从事云南优势药用植物资源开发利用和质量控制研究;E-mail:bzduan@ 126. com。
* 通讯作者:王福生，E-mail:ynwfs@ 163. com。
白族药黄秦艽中 3 种环烯醚萜苷类成分的含量测定
段宝忠1，2，方海兰1，陈进汝1，尚飞能1，李 来1，刘 江1，王福生1*
(1. 大理学院药学院，云南 大理 671000;2. 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000)
摘要 目的:研究白族药黄秦艽中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷的含量。方法:采用高效液相色谱法，色谱
柱为 Agilent Zorbax SB C18(4. 6 mm × 50 mm，5 μm);流动相为甲醇-水，梯度洗脱;流速为 1. 0 mL /min;检测波长为
238 nm;柱温为 25 ℃。结果:龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷 3 种成分在黄秦艽中均有分布，其中，獐牙菜苦苷、獐
牙菜苷为首次在该药材中检测到，未检测到马钱苷酸。结论:所建立的方法简单、重复性好，准确可靠，可用于黄秦
艽药材的质量品质评价。
关键词 黄秦艽;环烯醚萜苷;HPLC;质量评价
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)06-1012-03
龙胆科黄秦艽属植物黄秦艽 Veratrilla baillonii
Franch. ，又名滇黄芩、丽江金不换、大苦参、黄龙胆
等。以根入药，主要分布于西藏东南部、云南西北
部、四川西部等地，是云南地方习用中草药，为 1974
年和 2005 年版《云南省中药材标准》收载药材〔1〕。
也是白族、纳西族、彝族等的民族药，具有清热解毒
的功效〔2〕，主治肺热咳嗽、扁桃体炎、胃炎、痢疾、慢
性胆囊炎、烧伤、跌打损伤、痈疮肿毒等症〔3〕。在白
族民间，白语名称之为“胃霜优”，民间常用其根治
急、慢性胃炎，肠炎，胃脘胁痛，肺热咳嗽，烧伤
等〔4〕。目前，已有研究表明，黄秦艽的主要化学成
分为 酮类化合物〔5-7〕。黄秦艽中环烯醚萜苷类成
分的分布情况，目前仅有龙胆苦苷含量的报道〔8〕，
且仅测定了 1 份样品，不具代表性。为更好的、全面
的了解黄秦艽中环烯醚萜苷类成分的分布情况，为
其质量控制提供进一步依据，本文采用 HPLC 法测
定了黄秦艽药材中的 3 种环烯醚萜苷类成分，现将
研究结果报道如下。
1 仪器与材料
1. 1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱系统(Agi-
lent Technologies，USA)，包括四元梯度泵、自动进样
器、柱温箱、G1314C /D VWD 检测器、Chemstation 工
作站;Agilent Zorbax SB C18色谱柱(4. 6 mm × 250
mm，5 μm，USA) ;超声波清洗仪(昆山市超声仪器
有限公司，KQ-400KDE) ;电子分析天平(AND GH-
252);电热鼓风干燥箱(上海市嵩明实验仪器厂，
01A-2B);中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公
司，FY-135)。
1. 2 材料 马钱苷酸(批号:MUST-11042501)、獐
牙菜苦苷(批号:MUST-11012401)、龙胆苦苷(批号:
MUST-12081505)、獐牙菜苷(批号:MUST-11020802)
对照品购于成都曼思特生物科技有限公司(质量分
数经 HPLC峰面积归一化法计算均大于 98%)。色
谱级甲醇、乙腈 (Fisher Scientific，Fairlawn New
Jersey)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。黄秦艽
样品采于云南剑川沙溪和购于云南大理三月街和洱
源三营药材市场等地。经笔者段宝忠副教授鉴定为
龙胆科黄秦艽属植物黄秦艽 Veratrilla baillonii
Franch. 的干燥根，凭证标本存放于大理学院中药标
本馆。药材经烘干后粉碎，过 60 目筛，备用。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Agilent Zorbax SB C18柱(4. 6 mm
×50 mm，5 μm);流动相为甲醇(A)-水(B) ，梯度洗
脱(0 ～ 10 min，20% ～ 30% A;10 ～ 17 min，30% ～
35% A;17 ～ 20 min，35% A) ;流速 1. 0 mL /min;检
测波长 238 nm;柱温 25 ℃;进样量 10 μL。
2. 2 系统的适用性 按“2. 1”项下色谱条件检测
各相邻色谱峰之间的分离度均大于 1. 81，拖尾因子
在 0. 95 ～ 1. 16 之间;理论板数均大于 12 465
(USP)，对照品及黄秦艽药材样品中 3 个环烯醚萜
苷类成分基线分离。
2. 3 对照品溶液的制备 分别精密称取上述 4 种
环烯醚萜苷类对照品适量，分别加甲醇制成每 1 mL
含马钱苷酸 1. 56 mg、獐牙菜苷 1. 16 mg、龙胆苦苷
6. 01 mg、獐牙菜苦苷 2. 22 mg 的混合对照品储备
液，超声溶解，即得。
2. 4 供试品溶液的制备 精密称取样品粉末 0. 5
g，置于 50 mL锥形瓶中，精密加 50%甲醇 20 mL，混
匀，60 ℃下超声提取 60 min(400 W，40 kHz)，补足
减失重量后，过滤，取上清液用 0. 45 μm 微孔滤膜
·2101· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 6 期 2014 年 6 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.06.034
过滤，作为供试品溶液。
2. 5 线性关系考察 取上述对照品储备液，采用
逐级稀释法分别制备獐牙菜苦苷为 9. 78、48. 88、
244. 38、568. 32、1 136. 64、1 420. 80、1 776. 00、2
220. 00 μg /mL，龙胆苦苷为 26. 46、132. 32、661. 58、
1 538. 56、3 077. 12、3 846. 40、4 808. 00、6 010. 00
μg /mL，獐芽菜苷为 5. 11、25. 54、127. 69、296. 96、
593. 92、742. 40、928. 00、1 160. 00 μg /mL 的对照品
溶液。按“2. 1”项下色谱条件进行 HPLC 分析，以
峰面积(y)对其浓度(x)建立回归方程，其回归方程
和线性范围分别为:獐牙菜苦苷 y1 = 17. 097x1 －
94. 772，r1 = 0. 9999，9. 78 ～ 2 220. 00 mg /mL;龙胆
苦苷 y2 = 9. 0298x2 + 70. 619，r2 = 0. 9999，26. 46 ～ 6
016. 00 mg /mL;獐牙菜苷 y3 = 10. 551x3 + 43. 689，r3
= 0. 9999，5. 11 ～ 1 160. 00 mg /mL。
2. 6 精密度试验 分别吸取高、中、低 3 个浓度的
对照品溶液，重复进样 6 次和连续进样 3 d，计算各
对照品浓度的 ＲSD，日间和日内的 ＲSD 分别小于
1. 81%和 1. 23%。
2. 7 重复性试验 取同一样品 6 份按“2. 4”项下
方法制备供试品溶液，进样测定。计算 3 个环烯醚
萜苷类成分含量，其 ＲSD小于 1. 39%。
2. 8 稳定性试验 取上述供试品溶液，分别在 0、
4、8、12、18、24、48 h 进行测定，计算含量，ＲSD 值均
小于 2. 13%，表明供试品溶液在 48 h内稳定。
2. 9 加样回收率试验 取已知含量的黄秦艽药材
细粉 6 份，精密称定，分别精密加入一定量的对照
品，按“2. 4”项下方法制备供试品溶液，进样测定，
计算回收率，平均回收率在 98. 23% ～ 103. 21%之
间，ＲSD ＜2. 80%。
2. 10 样品含量测定 将样品按“2. 4”项下方法制
备供试品溶液，平行操作 3 次，按外标法计算 3 个成
分的含量，样品和对照品 HPLC 色谱图见图 1，结果
见表 1。
表 1 黄秦艽药材样品中 3 种环烯醚萜苷类成分含量测定结果(%，n =3)
样品编号 来源 獐牙菜苦苷 龙胆苦苷 獐牙菜苷
H1 云南省洱源县三营药材市场 0. 20 2. 06 0. 11
H2 云南省大理市金贝药材市场 0. 44 2. 74 0. 30
H3 云南省大理市三月街药材市场 0. 26 2. 87 0. 34
H4 云南省剑川县沙溪镇 0. 20 3. 13 0. 40
H5 云南省昆明市菊花村药材市场 0. 21 1. 99 0. 45
H6 云南省大理市苍山 0. 19 2. 34 0. 25
图 1 对照品(A)和黄秦艽样品(B)溶液的 HPLC色谱图
1. 獐牙菜苦苷 2. 龙胆苦苷 3. 獐牙菜苷 4. 马钱苷酸
3 讨论
本实验考察了甲醇、氯仿和 H2O 为提取溶剂，
比较发现甲醇的提取效率最高，在此基础上，考察了
超声和回流提取 2 种方法，二者提取效率相当，超声
提取简便易操作，是一个物理过程，物质的量没有损
失，最后确定选择用超声提取法。另外还考察了提
取时间、提取溶剂浓度和用量、提取温度，最终确定
提取方法为 60 ℃下用 50%甲醇 20 mL超声提取 60
min。
本文采用 HPLC 方法，根据对照品保留时间鉴
定了黄秦艽中的 3 个成分，实验结果表明，所分析的
6 批样品中，均含有龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜
苷 3 种成分，未检测到马钱苷酸。其中，獐牙菜苦
苷、獐牙菜苷为首次从黄秦艽中检测到。在几种成
分中，龙胆苦苷含量相对较高，达到 1. 99% ～
3. 13%。环烯醚萜苷类成分具有保肝、抑菌、抗炎和
抗病毒等多方面作用〔9，10〕，本研究表明黄秦艽中含
有丰富的环烯醚萜苷类成分，研究结果对阐释黄秦
艽在民间作为保肝药物使用提供了一定的科学依
据。本方法操作简便，可用于黄秦艽药材的质量控
制。
参 考 文 献
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(16) :2012-2017.
收稿日期:2014-01-26
基金项目:国家自然科学基金(30970935，31371088) ;广东省科技厅计划项目(36000-4202139)
作者简介:廖素芬(1988-) ，女，在读硕士研究生，专业方向:神经药理学;E-mail:lsufen88517@ gmail. com。
* 通讯作者:郑文华，Tel:18802003936，E-mail:whzheng123@ gmail. com。
·药理·
二氢杨梅素对 PC12 细胞氧化损伤的保护及机制研究
廖素芬1，汪海涛2，3，闫凤侠1，郑永欣2，曾志文2，郑文华2*
(1. 中山大学药学院，广东 广州 510006;2. 中山大学中山眼科中心国家重点实验室，广东 广州 510060;
3. 南方医科大学药学院，广东 广州 510015)
摘要 目的:探讨二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DMY)对硝普钠(SNP)诱导的 PC12 细胞氧化损伤的保护作用
及机制。方法:建立硝普钠诱导的 PC12 细胞氧化损伤模型，采用噻唑蓝(MTT)比色法及 Hoechst染色法考察二氢
杨梅素对 PC12 细胞活力的影响;DCFH-DA 荧光探针检测细胞间活性氧(ＲOS)的含量;蛋白免疫印迹(Western
blot)法检测 Akt和 EＲK1 /2 的磷酸化水平。结果:MTT显示硝普钠剂量依赖性损伤 PC12 细胞，而二氢杨梅素可保
护硝普钠所致的细胞损伤。ＲOS结果表明二氢杨梅素能显著降低硝普钠诱导的活性氧增加。丝裂原活化蛋白激
酶(MAPK)抑制剂 PD98059 和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)抑制剂 LY294002 可抑制二氢杨梅素对硝普钠诱导细胞损
伤的保护作用。Western blot结果显示 LY294002 和 PD98059 可分别抑制二氢杨梅素对 Akt和 EＲK1 /2 的磷酸化作
用。结论:二氢杨梅素对硝普钠诱导的 PC12 细胞损伤具有显著的保护作用，这一作用可能是通过上调 Akt 和
EＲK1 /2 的活性来介导的。
关键词 二氢杨梅素;硝普钠;Akt;EＲK1 /2;神经退行性疾病
中图分类号:Ｒ285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)06-1014-07
Protective Effect and Mechanisms of Dihydromyricetin on PC12 Cells Induced by Oxidative Injury
LIAO Su-fen1，WANG Hai-tao2，3，YAN Feng-xia1，ZHENG Yong-xin2，ZENG Zhi-wen2，ZHENG Wen-hua2
(1. School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China;2. State Key Laboratory of Ophthalmology，
Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510060，China;3. School of Pharmaceutical Sciences，Southern
Medical University，Guangzhou 510015，China)
Abstract Objective:To study the protective effect and possible mechanisms of Dihydromyricetin(DMY)on PC12 cells injury in-
duced by sodium nitroprusside(SNP). Methods:SNP toxicity cellular model was established using PC12 cells treated with SNP. Cell via-
bility was determined by MTT assay. The apoptosis of treated cells was detected by Hoechst Staining. Effect of DMY on accumulation of
ＲOS in PC12 cells induced by SNP was detected by fluorometric analysis. The pathways involved were studied by kinase specific inhibi-
tors;The level of phosphorylated Akt and EＲK1 /2 was detected by Western blot with specific phosphor-antibodies. Ｒesults:SNP in-
duced the apoptosis of PC12 cells in a dose-dependent manner. DMY dose-dependently protected PC12 cells from injury induced by
SNP. Hoechst staining indicated that SNP decreased the number of viable cells and induced shrinkage and aggregation of the nucleus，
whereas DMY attenuated the toxic effects of SNP. The level of ＲOS induced by SNP in PC12 cells was decreased gradually by
DMY. PI3K specific inhibitor LY294002 and the MAPK pathway specific inhibitor PD98059 attenuated the protective effect of DMY on
SNP-induced injury of PC12 cells. However，the effect of DMY could be blocked by LY294002 and PD98059 respectively. Conclusion:
DMY possesses protective effect against apoptosis induced by SNP in PC12 cells，and its mechanisms may be partially related with Akt
·4101· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 6 期 2014 年 6 月