全 文 ：第 36 卷　第 3 期 西北农林科技大学学报(自然科学版) Vol.36 No.3
2008 年 3 月 Journal of No rthwest A &F Univer sity(Na t.Sci.Ed.) Mar.2008
箭杆杨组织培养再生体系的建立＊
陶延珍1 ,李　枫2 ,李　毅2
(1兰州市城关区皋兰山造林站 ,甘肃 兰州 730000;2甘肃农业大学林学院 ,甘肃 兰州 730070)
[ 摘　要] 　【目的】探讨常温下适宜箭杆杨试管苗腋芽增殖 、生根的最佳培养条件。【方法】以MS 培养为基本培
养基 ,附加不同浓度的吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)以及 6-氨苄基腺嘌呤(6-BA)组成试验培养基 , 对箭杆杨组织进
行培养 ,观察其生根情况和愈伤组织诱导情况。【结果】箭杆杨脱分化最佳培养基为:MS+1.0 mg/ L 6-BA+0.1
mg/ L IBA ,该条件下的愈伤组织诱导率为 90%;不定芽分化诱导培养基为:1/2MS +0.1 mg/ L IBA +0.5 mg/ L
6-BA , 该条件下的诱导分化率为 67.1%;芽增殖培养基为:MS+1.0 mg/ L 6-BA+0.1mg/ L IBA , 该条件下的增殖数
为 5.8;最佳生根培养基为:1/2MS+1.0 mg/ L IBA , 该条件下的生根率为81.3%。【结论】建立了箭杆杨组织培养再
生体系 ,为其种质资源的试管保存奠定了基础。
[ 关键词] 　箭杆杨;组织培养;愈伤组织;分化;生根
[ 中图分类号] 　S792.119 [ 文献标识码] 　A [ 文章编号] 　1671-9387(2008)03-0203-05
Establishment of tissue culture regenerat ion system of
populus nigra var thevestina
TAO Yan-zheng1 , LI Feng2 , LI Yi2
(1 Gaolan Mounta in A f for esta tion S tat ion o f Ch engguan Distr ict , Lanzhou, Gansu 730000 , Ch ina;
2 Col leg e o f Forest ry Gan su Ag ricul tu ral Universi ty , Lanzhou , Gan su 730070 , China)
Abstract:【Objective】The study is to Explore the best culture condi tion of ax illary buds mut iplication
and roo ting in Populus nigra var thevestina t issue culture unde r normal tempe ra ture.【Method】With the
basic MS medium added wi th dif ferent concentra tions of IBA , NAA and 6-BA , the roo ting and cal lus induc-
tion w ere obse rv ed .【Resul t】The best medium fo r dedifferent iation w as MS +6-BA 1.0 mg/L +IBA 0 .1
mg/L , the f requency of callus induction w as 90 %;The ideal medium fo r induction and dif fe rentiat ion of the
callus w as 1/2MS+IBA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/ L , induction and dif ferentiation rate was 67.1%;The medium
for shoo t proliferation w as MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1mg/L ,proliferation number w as 5.8;The optimum me-
dium for producing roots w as 1/2MS+IBA 1.0 mg/L w ith 81.3% roo ting ratio .【Conclusion】The tissue cul-
ture regeneration sy stem w as established ,which laid a basis for the sto rage invit ro of germplasm resources.
Key words:Populus nigra var thevestina;tissue culture;callus;di fferentia tion ;roo ting
　　箭杆杨(Populus nigraL .V ar.thevest ina)是我
国西北地区主要农田防护林及“四旁”绿化树种[ 1] 。
近年来 ,由于环境恶化和人为破坏加剧 ,许多优良种
质资源日趋减少 。同时 ,农田防护林及“四旁”绿化
林现已到达采伐期 ,若不及时采取保护措施 ,箭杆杨
优良种质资源将遭受严重破坏 ,甚至消亡 。
在传统的林业生产中 ,种质资源主要依靠田间
定植得以保存 ,需占用大量的土地 。这种保存方法
＊[收稿日期] 　2007-03-19
[基金项目] 　甘肃省自然科学基金项目(YS021-A21 001))
[作者简介] 　陶延珍(1968-),女 ,甘肃兰州人 ,工程师 ,主要从事抗旱造林技术研究。 E-mail:susp008@163.com.
[通讯作者] 　李　毅(1962-),男 ,湖北汉川人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事林木遗传育种研究。 E-mail:liyi@g sau.edu.cn.
既浪费土地资源 ,又需大量的人力去种植与管护。
利用生物技术对树木的组织或细胞进行培养和保
存 ,不仅保存迅速 、保存量大 、可在短期内获得大量
无性系后代 ,而且保存所占空间很小 ,可节省土地资
源 、降低保存成本 。利用组织培养方法进行种质资
源离体保存已有许多报道 。张力平等[ 2] 对葡萄种质
资源保存的研究结果表明 ,在培养基中加入适量多
效唑可以有效延长继代周期 ,减少保存成本 。王大
元等[ 3] 在柑桔种质资源保存的研究中发现 ,组织培
养方法可以大大减少保存所占空间 、保存手续简便 、
保存的培养物有可能大量再生繁殖 。李毅等[ 4] 对毛
白杨的研究表明 , MS +0.5 mg/ L 6-BA +0.1
mg/L IAA 对愈伤组织诱导率可达 90%。但至今
尚未见用组织培养方法保存箭杆杨种质资源的报
道。为此 ,本试验对箭杆杨进行了组织培养研究 ,旨
在探索常温下适宜箭杆杨试管苗腋芽增殖 、生根的
最佳培养条件 ,为箭杆杨种质资源的保存和快速繁
殖提供科学依据 。
1　材料与方法
1.1　材　料
1.1.1 　箭杆杨枝条　2005-03 从甘肃张掖 、武威选
取箭杆杨优良单株 ,采集休眠枝条作为研究材料 ,带
回实验室进行水培催芽。
1.1.2　试　剂　吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)均
为天津市精细化工研究所生产;6-氨苄基腺嘌呤(6-
BA)为国药集团化学试剂有限公司生产 。
1.2　箭杆杨外植体的获取
剪取箭杆杨 1年生带芽茎段 ,每段保留 2个侧
芽 ,用洗衣粉液漂洗 30 min ,再用体积分数 75%酒
精浸泡 10 s 、1 g/L HgCl溶液浸泡 10 min ,无菌蒸
馏水冲洗 3 ～ 4次 ,置于无激素 MS 培养基上培养。
8 d后叶片展开 ,将叶片切成 0.5 cm ×0.5 cm 的小
块 ,接种于不同激素配比的 MS 脱分化培养基中诱
导愈伤组织。
1.3　箭杆杨愈伤组织诱导培养基的筛选
培养基是影响林木组织培养成败的最主要因
素 ,只有在适宜的生长 、分化培养基中 ,植物才能表
现出细胞的全能性 ,获得较高的分化率 ,从而实现快
速繁殖。在实际应用中 ,往往根据植物种类及其部
位选择不同的培养基[ 4] 。本研究以 MS 为基本培养
基 , IBA质量浓度设 0 .1 , 0.5 和 1.0 mg/L 3个水
平 ,6-BA质量浓度设置为 0.5 , 1.0 和 1.5 mg/L 3
个水平 ,在培养室温度(25 ±2)℃、光照 14 h 和光
强 1 500 ～ 2 000 lx 条件下 ,进行 2因素 3水平正交
试验。培养基中蔗糖质量浓度为 20 g/L ,琼脂质量
浓度为 4 g/L。根据愈伤组织诱导率和生长速度 ,
筛选适宜的箭杆杨愈伤组织诱导培养基 。
1.4　箭杆杨愈伤组织再分化培养与芽增殖培养基
的筛选
以 MS 为基本培养基 ,附加不同种类生长素与
6-BA组成 5种培养基:MS +0 .5 mg/L NAA +0.5
mg/L 6-BA ;MS +0.1 mg/L NAA +0.5 mg/L
6-BA ;MS +0.5 mg/ L IBA +0 .5 mg/ L 6-BA ;MS
+0.1 mg/ L IBA +0.5 mg/L 6-BA 和1/2M S+0.1
mg/L IBA +0.5 mg/ L 6-BA 。在上述 5种培养基
中接种箭杆杨愈伤组织 ,进行再分化研究 。
从带芽茎段上剪取无菌腋芽 ,分别接种 MS +
0.5 mg/ L 6-BA 、MS +1.0 mg/L 6-BA 、MS +0.5
mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA 和 MS +1 .0 mg/L
6-BA +0 .1 mg/ L IBA 4种培养基 ,进行培养 , 30 d
后检测腋芽增殖数及生长发育情况 。
1.5　箭杆杨生根培养基的筛选
分别以 MS 和 1/2 M S 为基本培养基 ,向其中
添加 IBA 和 NAA 构成生根培养基 , IBA和 NAA 2
种生长素的添加量均设 0.5 , 1.0和 1.2 mg/ L 3个
水平 ,培养基中蔗糖 、琼脂浓度同 1 .3节 。以生长
20 ～ 30 d的箭杆杨试管苗为继代材料 ,剪取带一个
叶片 、长度 3 ～ 4 cm 的茎段 ,转接到上述生根培养基
中 ,进行生根试验 ,培养条件同 1 .3节。
上述试验各处理均重复 3次 ,每次 20瓶 。
2　结果与分析
2.1　不同培养基对箭杆杨愈伤组织诱导的影响
外源激素 6-BA 与 IBA 配比 ,对箭杆杨愈伤组
织的诱导有较大影响 。由表 1可知 ,6-BA 浓度对愈
伤组织的产生起关键作用 , 0.5 mg/ L 6-BA 与不同
质量浓度的 IBA配比后 ,对箭杆杨愈伤组织的诱导
率为 31.2%～ 35.6%,且以小团块愈伤组织(直径
≤2 mm)居多 ,占84%以上 ,其中以 MS +0.5 mg/L
6-BA +0 .1 mg/L IBA 最为明显 ,达到 88.6%;1 .0
mg/L 6-BA 与不同质量浓度 IBA 配比后 ,对箭杆杨
愈伤组织的诱导率较高 ,为 72.8 %～ 90.0 %;1.5
mg/L 6-BA 与不同质量浓度 IBA 配比后 ,对箭杆杨
愈伤组织的诱导率为 65.1%～ 67.3%,愈伤组织生
长迅速 ,直径>2 mm 的团块占 90%以上 , 其中以
MS +1 .5 mg/L 6-BA +1.0 mg/L IBA 最为明显 ,
达 93.5 %。综合诱导率和生长速度两因素 , MS +
204 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
1.0 mg/6-BA L+0 .1 mg/L IBA 为箭杆杨愈伤组 织诱导适宜的培养基 。
表 1　6-BA/ IBA 对箭杆杨愈伤组织诱导的影响
Table 1　Effect of 6-BA/ IBA on callus inducting rate
6-BA/(mg· L-1) IBA/(mg· L -1) 诱导率/ %
Induct ing rate
不同直径愈伤组织诱导率/ %C allus diameter
≤2 mm >2 mm
0.1 31.2 88.6 11.4
0.5 0.5 35.6 84.5 15.5
1.0 34.9 86.8 13.2
0.1 90.0 12.6 87.4
1.0 0.5 87.9 15.3 84.7
1.0 72.8 10.4 89.6
0.1 65.1 9.8 90.2
1.5 0.5 67.3 7.9 92.1
1.0 66.4 6.5 93.5
2.2　不同培养基对箭杆杨愈伤组织再分化与不定
芽形成的影响
将长势良好的愈伤组织转入低细胞分裂素培养
基中 ,进行不定芽分化培养。由表 2可知 , IBA/6-
BA 配比的诱导效果优于 NAA/6-BA 配比;诱导率
随生长素(NAA 和 IBA)质量浓度的下降而升高;诱
导时间随 NAA 和 IBA 质量浓度的下降而缩短 ,随
大量元素的减少而提前。NAA/6-BA 配比培养的
愈伤组织可直接诱导出不定根 ,而不定芽诱导率很
低 ,组织较容易褐变;IBA/6-BA 配比可提高不定芽
的诱导率 ,但不定芽有玻璃化现象;1/2 MS培养基可
有效降低玻璃化试管苗的形成。综上可知 , 1/2MS+
0.1 mg/L IBA +0.5 mg/L 6-BA 是箭杆杨愈伤组织
再分化和不定芽形成的较适宜诱导培养基。
表 2　不同培养基对箭杆杨不定芽分化诱导的影响
Table 2　Effec t o f different media on adventitious shoo t induction
培养基配比
Cultu re m edium com bination
诱导时间/d
Indu ction t ime
诱导率/ %
Inductivi ty
愈伤组织状况
Callus status
M S+0.5 m g/ L NAA+
0.5 mg/ L 6-BA 25.7 21.9
愈伤组织增长快 , 产生大量不定根 ,组织易褐变 Fast-
grow th calli , massive adventi tiou s root s , easy b row ning
M S+0.1 m g/ L NAA+
0.5 mg/ L 6-BA 23.1 36.4
生长缓慢 , 有不定根产生 ,易褐变 Slow-grow th , produc-
t ion adventi tiou s root s , easy b row ning
M S+0.5 m g/ L IBA+
0.5 mg/ L 6-BA 22.7 36.5
生长较快 ,不定芽有玻璃化现象 Faster-grow th , dventi-
t ious sh oot vi t rif icat ion.
M S+0.1 m g/ L IBA+
0.5 mg/ L 6-BA 19.6 60.9
生长良好 ,不定芽有玻璃化现象 Well-grow th , Adventi-
t ious sh oot vi t rif icat ion.
1/ 2MS +0.1 m g/ L IBA+
0.5 mg/ L 6-BA 20.2 67.1
生长良好 ,产生的不定芽长 2～ 3 cm ,有褐变现象 Well-
grow th , advent it ious sh oot were 2～ 3 cm , b row nin g.
2.3　不同激素配比对箭杆杨腋芽试管快速增殖的
影响
由表 3可知 , 6-BA 与 IBA 搭配对腋芽的增殖
效果优于其单独使用 ,不含 IBA 的培养基 ,腋芽增
殖少 ,且生长缓慢;腋芽增殖数与 6-BA的质量浓度
正相关 。
表 3　不同激素配比对箭杆杨腋芽增殖的影响
Table 3　Effect of different hormone a ssocia tions on axillary shoot
培养基配比
Cultu re m edium com bination
腋芽增殖数
Axi llary shoot p ropagation num ber
生长与发育
Grow th and development
M S+0.5 m g/ L 6-BA 3.5 生长缓慢 ,分化率低 Slow-grow th , low dif ferentiat ion rate
M S+1.0 m g/ L 6-BA 3.9 腋芽生长缓慢 ,分化率低 Slow-grow th Axil lary shoot , l ow dif-
f erent iation rate
M S+0.5mg/ L 6-BA +
0.1 mg/ L IBA 5.2
生长良好 ,无丛生芽 ,腋芽较多 Well-grow th , no cluster shoot ,
m any axi llary shoots
M S+1.0 m g/ L 6-BA +
0.1 mg/ L IBA 5.6
生长良好 ,无丛生芽 ,腋芽较多 Well-grow th , no cluster shoot ,
m any axi llary shoots.
2.4　不同激素对箭杆杨生根的影响
诱导生根是植物组织培养繁殖的关键环节之
一。由表 4可知 ,各种质量浓度 NAA 与 IBA 对箭
杆杨试管苗生根均有较好的诱导效果 ,且随其质量
浓度的提高 ,诱导率也增大。从基本培养基选择来
看 ,1/2 M S 更有利于生根。从试管苗根发生数量与
根形成的质量综合考虑 , 1/2 M S +1 .0 mg/ L IBA
为箭杆杨的适宜生根培养基。
205第 3 期 陶延珍等:箭杆杨组织培养再生体系的建立
表 4　不同激素对箭杆杨试管苗生根的影响
Table 4　Effect of different hormones on roo t formation
培养基配比
Cu lture medium
生根率/ %
Root ing rate
生根数目
Rooting num ber
根形态
Root conf iguration
MS+0.5 mg/ L NAA 48.4 1.5 根粗而短 , 基部无愈伤组织 Thick and short root , no callu s
on base.
MS+1.0 mg/ L NAA 54.8 2.2 毛根较多 ,基部无愈伤组织 M any hai r root s , no cal lus on
base
MS+1.2 mg/ L NAA 69.3 3.7 毛根多 ,基部产生大量愈伤组织 A lot of h air root s , massive
cal li on base.
MS+0.5 mg/ L IBA 56.1 2.1 根细而短 ,基部无愈伤组织 Thin an d sho rt root , n o callus on
base.
MS+1.0 mg/ L IBA 71.6 2.6 根发育良好 ,基部无愈伤组织 Root grow th well , no callus on
base.
MS+1.2 mg/ L IBA 74.7 4.2 气生根明显 , 基部产生大量愈伤组织 Evident aerial root ,
m assive callus on base.
1/ 2 MS +0.5 mg/ L NAA 61.0 1.8 根细而短 ,基部无愈伤组织 Thin an d sho rt root , n o callus on
base.
1/ 2 MS +1.0 mg/ L NAA 67.8 2.4 毛根较多 ,基部无愈伤组织 M any hai r root s , no cal lus on
base
1/ 2 MS +1.2 mg/ L NAA 82.3 4.2 毛根多 ,基部产生大量愈伤组织 A lot of h air root s , massive
cal li on base.
1/ 2 MS +0.5 mg/ L IBA 69.1 2.3 根细而短 ,基部无愈伤组织 Thin an d sho rt root , n o callus on
base.
1/ 2 MS +1.0 mg/ L IBA 84.6 3.3 根发育好 , 基部无愈伤组织 Root grow th well , no callus on
base.
1/ 2 MS +1.2 mg/ L IBA 87.7 4.5 气生根明显 ,基部无愈伤组织 Evident aerial root , no callu s
on base.
3　讨论与结论
3.1　外植体消毒
灭菌是植物组织培养工作中的重要环节 ,对大
多数植物来说 ,采用新生的或新抽的枝条 、叶 、茎尖
为材料 ,污染率可下降 20%～ 30%[ 5] 。污染因素很
多 ,灭菌时既要求将外植体表面的微生物彻底杀死 ,
又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞 。现常
用的灭菌剂有:乙醇 、次氯酸盐 、氯化汞和抗生素类
杀菌剂等 。灭菌剂和灭菌程序的选择应视外植体的
具体情况而定 ,从野外采来的材料 ,菌类物质易粘附
其上 ,在做组织培养时不易消毒。因此 ,必须根据取
材时间 、材料幼嫩程度 、材料类型 ,来选择消毒剂 、消
毒程序和消毒时间[ 6-8] 。本研究箭杆杨枝条取自 3
月底 ,将其带回室内冲洗干净 ,放入培养室内水培 ,
待培养出嫩芽后 ,以其为初始培养材料进行组织培
养 ,由于芽是在室内长出的 ,翠嫩易受伤害 ,故应适
当减小酒精的消毒时间。本研究采用洗衣粉水漂洗
30 min ,然后酒精杀菌 10 s ,最后 1 g/L HgCl处理
10 min ,无菌水冲洗 3 ～ 4次的程序来消毒 ,结果污
染率可控制在 10 %以下 ,成活率达到 100%。另外 ,
水培过程中 ,喷洒适当浓度的 84消毒液 ,对减小污
染也有良好的作用。
3.2　培养基及盐类对杨树苗木组织培养的影响
在离体条件下 ,植物组织生长所需养分一般由
基本培养基提供 。目前常用的基本培养基有 MS
(包括 1/2 M S 、1/3 M S)、KC 、White和 Nitch等 ,其
中应用最多的是 MS 培养基及 1/2 MS 培养基 ,其
营养丰富且全面。在木本植物的组织培养中 ,还有
B5和 H 等培养基。本试验选择的基本培养基是
MS 及 1/2 MS 培养基 ,结果显示 ,在箭杆杨的初代
培养及苗木生根培养中 ,采用 1/2 M S 培养基效果
较好。
3.3　激素配比对杨树愈伤组织诱导的影响
对杨树组织培养的研究表明 ,植物生长调节剂
中的细胞分裂素与生长素 ,是诱导外植体脱分化的
主要因素 ,其种类和浓度配比对愈伤组织的诱导影
响很大[ 9-10] 。本试验结果表明 , 1.0 mg/L 6-BA +
0.5 mg/L IBA 对箭杆杨愈伤组织诱导率最高 ,达
90%,为箭杆杨愈伤组织诱导的适宜激素配比 。
3.4　愈伤组织的再分化与腋芽的增殖
对木本植物组织培养的研究表明 ,植物生长素
种类及其与细胞分裂素的配比 ,是影响愈伤组织再
分化和胚状体发生的关键[ 11] 。本试验中 , IBA 的诱
导作用要高于 NAA , 其中以 1/2 M S +0.1 mg/L
IBA +0 .5 mg/L 6-BA 培养基对不定芽的诱导分化
效果最佳。一般认为 ,以愈伤组织分化成的苗作为
商品化苗木容易引起培养物的变异 ,很难保持其亲
本特有性状 ,其原因是:(1)激活的外植体经愈伤组
织分化形成不定芽和根需较长时间;(2)愈伤组织在
206 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 36 卷
长时间培养过程中 ,幼芽分化遗传畸变及生根响应
中的变异性 ,导致随后的生长响应或形态学上的优
良性状发生变异[ 12-13] 。本试验结果表明 ,MS +1 .0
mg/L 6-BA +0.1 mg/ L IBA 为箭杆杨芽增殖的适
宜培养基 。
3.5　试管苗根的形成
植物激素中 , 生长素对根的形成具有重要作
用[ 9] 。在一定范围内 ,试管苗的生根率与生长素在
培养基中的含量呈正相关;过量时 ,则会形成大量的
愈伤组织团块而导致输导组织不畅 ,影响苗木生长
和移栽成活 。本试验发现 , MS +1.0 mg/L IBA 为
比较理想的箭杆杨生根培养基 。
3.6　愈伤组织继代培养中材料的褐化与试管苗的
玻璃化问题
愈伤组织继代中的褐化与试管苗玻璃化问题 ,
始终是林木组织培养的难题[ 9 , 13] 。培养材料和培养
条件(如湿度 、光照 、无机盐成分 、蔗糖浓度等)均会
影响到褐化[ 13-14] 。李毅[ 15] 对箭胡毛杨试管苗褐化
的研究结果表明 ,蔗糖浓度的大小与褐变开始的时
间成反比 。郝贵霞[ 16] 对毛白杨玻璃化成因的研究
表明 ,培养容器的透气性和相对湿度是导致毛白杨
产生玻璃化的重要因素 。本试验发现 ,在箭杆杨试
管苗培养过程中 ,愈伤组织在50 ～ 60 d开始出现褐化
现象 ,对不定芽的诱导产生抑制作用 ,通过降低培养
基中大量元素的含量 ,可以有效地降低玻璃化苗的发
生率。
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