全 文 ：收稿日期:2004-09-09初稿;2005-01-17三改稿
　＊上海市农委农科攻字(2001)第 5-4号 , “芳香植物综合开发利用研究”
作者简介:张艳玲(1965-),女,主管中药师 ,研究方向为药用芳香植物的开发利用。
联系电话:021-64786736;E-mail:Yanling_zhang5@hotmail.com
＊＊通讯作者
　上海农业学报　2005 , 21(1):4～ 6
　Acta Agriculturae Shanghai
文章编号:1000-3924(2005)01-04-03
芳香植物唇萼薄荷组织培养中的污染控制＊
张艳玲 , 姚　雷＊＊ , 申晓辉
(上海交通大学农业与生物学院,上海 201101)
摘　要:研究了芳香植物唇萼薄荷组织培养中污染的控制方法 ,结果表明 , 不加吐温-80 的唇萼薄荷在 25℃
培养 ,污染率分别为 38.4%和 53.2%;加吐温-80 的方法在相同条件下污染率分别降为 6.03%、8.94%。说明采
用加吐温-80 的方法可降低污染率 ,从而提高了组织培养的成功率。
关键词:唇萼薄荷;组织培养;污染控制
中图分类号:S567.23 +5　　　　文献标识码:A
唇萼薄荷(Mentha pulegium L.),英文名为Pennyroyal mint ,别名普列薄荷 、圆叶薄荷 ,为唇形科薄荷
属植物 ,原产于欧洲及西亚 ,是一种老式的香药草 ,也是世界五大薄荷之一 。唇萼薄荷不仅有很高的药用
价值 ,还是生产食品 、化妆品等的主要原料 ,并有相当高的观赏价值[ 1] ,也是很好的天然驱虫 、驱鼠的芳香
性草坪建植用材料[ 2] 。因此 ,对唇萼薄荷进行引种 、繁殖颇有意义。实践证明 ,组织培养是大量人工繁殖
薄荷的有效手段 。然而 ,由于薄荷叶片 、叶腋密生软毛 ,在进行组织培养时 ,对外植体的灭菌处理相当困
难 ,按一般常用的污染处理方法进行组织培养污染率太高 ,这也是严重制约其大量栽培 、繁殖的主要原因
之一 。关于薄荷属的组培已有报道[赖家业(2000)、吴涛(1999)、臧玉琦(1998)等] [ 3 ～ 5] ,但多是针对培养
基种类 、激素配比及用量等的研究 ,均尚未述及污染控制的问题;师素云等[ 6 , 7] 采用酒精和升汞对材料进
行灭菌处理以控制污染 ,但所用升汞对材料的杀伤力大 。即便如此 ,以上报道也只是针对薄荷属其它成员
的 ,对唇萼薄荷组培尚未见有报道 。近年来 ,唇萼薄荷在我国的引种 、栽培量不断增加 ,为了探索降低唇萼
薄荷组培污染的有效方法 ,本项目拟从取材和消毒等方面对控制污染的不同方法进行筛选试验 ,本文报道
该项试验结果。
1　材料 与方 法
1.1　材料与试剂
1.1.1　材料
唇萼薄荷来源于日本 ,在上海地区已有 5年适应性种植 ,生长良好。本试材取自上海交通大学农业与
生物学院实验农场的塑料大棚中 ,在 4 ～ 5月期间 ,选晴朗天气的 10:00时以前 ,用剪刀切取健壮植株的地
上部分 20cm 茎段。
1.1.2　化学试剂
漂白精片(每片含有效氯 0.2g ,上海世康特制药有限公司产品)、次氯酸钠溶液(上海双俭精细化工有
限公司产品)、无水乙醇(由上海振兴化工一厂产品)、吐温-80(上海华科化工有限公司产品)。
1.1.3　培养基
MS+6-BA1.0mg L+IBA2.5mg L+蔗糖 30.0g L+琼脂 7.0g L ,pH5.8。
1.2　外植体灭菌方法
1.2.1　饱和漂白精溶液法
将去除叶片的外植体 ,在洗洁精水中约浸洗 5min ,然后用自来水冲洗 2h ,沥干 ,置于 70%的酒精中
15s ,取出浸入饱和漂白精溶液中 10min ,其间用软毛刷不断刷拭材料 ,然后在洁净工作台上取出用无菌水
冲洗 3 ～ 4次 ,用灭菌吸水纸将水吸干 ,切取带腋芽的幼嫩茎段 ,迅速接种在培养基上 。
1.2.2　2%次氯酸钠溶液法
操作方法同“1.2.1” ,只是消毒液改为 2%次氯酸钠。
1.2.3　饱和漂白精溶液+吐温-80法
操作方法同“1.2.1” ,不同之处是在饱和漂白精溶液中加入 0.1%的吐温-80 ,充分混匀 ,然后用软毛
刷在浸液中刷洗材料 10min。
1.2.4　2%次氯酸钠溶液+吐温-80法
操作方法同“1.2.2” ,不同之处是在 2%次氯酸钠溶液中加入 0.1%吐温-80 ,充分混匀 ,然后用软毛刷
在浸液中刷洗材料 10 min。
2　结果 与讨 论
2.1　结　果
用饱和漂白精溶液灭菌的材料的污染率为 38.4%;用 2%次氯酸钠溶液灭菌的材料的污染率为
53.2%;用饱和漂白精溶液+吐温-80灭菌的材料的污染率为 6.03%;用 2%次氯酸钠溶液+吐温-80 法
灭菌的材料的污染率为 8.94%(表 1)。
表 1　几种不同灭菌方法的灭菌效果比较
Table 1　Comparison of sterili zing effect among several di fferent steril izing methods
方法
Method
灭菌时间
Sterili zing
time(min)
株数
Number of
individuals
48h污染数
Number of
contamination
in 48 hou rs
96h污染数
Number of
con tamination
in 96 hours
2周污染数
Number of
contaminat ion
in 2 w eeks
污染率(%)
Contamination
rate
“ 1.2.1”饱和漂白精溶液法
The method of using saturated ext ract
bleaching solut ion
10 112 4 28 11 38.4
“ 1.2.2”2%次氯酸钠溶液法
The method of using 2% of sodium
hypochlorite solution
10 124 6 39 21 53.2
“ 1.2.3”饱和漂白精溶液+Tween-80法
The method of using saturated ext ract
bleaching solut ion and Tw een-80
10 116 6 1 0 6.03
“ 1.2.4”2%次氯酸钠溶液+T ween-80法
The method of using 2% of sodium
hypochlorite solution and Tw een-80
10 123 9 2 0 8.94
2.2　讨　论
2.2.1　唇萼薄荷的组培取材
唇萼薄荷能通过种子繁殖 ,是异花传粉植物 ,易杂交变异致使品质降低 ,开发利用受到限制。杨增海
等[ 8 , 9]提出组培取材选择良好性状 、品质优良的植株 ,利用腋芽以芽繁芽进行快繁的方法能够保存优良品
种遗传稳定性和一致性。受此启发 ,本试验将所采集的植株去掉叶片 ,切取幼嫩带腋芽的茎段进行大量繁
殖。这样既能保存优良品种遗传稳定性和一致性 ,又能去除污染率最高的叶片 ,提高灭菌效率 。
2.2.2　灭菌方法的改进
由于芳香植物唇萼薄荷植物组织非常柔嫩且表面密生绒毛 ,在自然条件下 ,表面常被霉菌和细菌污
染。在进行组织培养时 ,对外植体的灭菌处理相当困难 ,如果选用灭菌试剂及浓度不当或消毒时间稍长就
会导致组织死亡 ,而消毒时间短又会导致灭菌不彻底 ,致使实验失败 。因此本试验做了以下改进:
2.2.2.1　消毒剂改进:一般的组培材料除了在洗洁精水中浸洗外植体后用自来水冲洗外 ,还需用 70%的
酒精 、饱和漂白精溶液或次氯酸钠溶液(0.5%～ 10%)、氯化汞溶液(0.01%)、过氧化氢(3%～ 10%)、硝酸
银(1%)等处理 ,杨增海等[ 8 , 9] 指出它们的消毒效果虽然很好 ,但有的消毒液残留在植物材料上不易去除
且容易造成材料的损伤 ,如硝酸银 、氯化汞等 。本实验采用 70%酒精依次和饱和漂白精溶液及 2%次氯酸
钠溶液配合使用 ,在消毒过程中严格控制浓度 ,这不仅保证了消毒液的消毒效果 ,也克服了药剂残留不易
去除和容易造成幼嫩材料损伤的缺陷 ,从而确保了组培的成活率 。
51 期　　　　　　　　　　　　张艳玲等:芳香植物唇萼薄荷组织培养中的污染控制
2.2.2.2　消毒时间和漂洗方法的改进:一般的组培材料在洗洁精水中浸洗外植体后用自来水冲洗一
段时间 ,放置于 70%的酒精中 20s ,再用饱和漂白精溶液或次氯酸钠溶液(0.5%～ 10%)、氯化汞溶液
(0.01%)、过氧化氢(3%～ 10%)、硝酸银(1%)等处理 20 min ,由于唇萼薄荷组织非常嫩且表面密生绒
毛 ,消毒的时间如果稍长(大于 10 min)材料就会出现褐色斑点(褐变率高于 60%),在消毒液中浸洗材料
的量如果多 ,材料接触消毒液不均匀 ,也会增加材料的损伤率从而降低消毒的效果。为此本试验采取少量
唇萼薄荷植物材料在 70%酒精中快速甩动 15s就立即取出分别放入饱和漂白精溶液和 2%次氯酸钠溶液
中 10 min ,其间不断用软毛刷轻轻刷洗材料 。按以上方法操作并严格控制浓度和时间 ,使材料的损伤率
降低到 3%。
2.2.2.3　采取加表面活性剂的方法:以上两种改进方法 ,虽然控制了材料的损伤率 ,但是由于材料表面特
别是腋芽密生绒毛且部位通常较隐蔽 ,似很难与消毒液彻底接触 ,致使消毒效果尚不尽如人意 ,于是又在
饱和漂白精溶液和 2%次氯酸钠溶液中分别加 0.1%吐温-80混合均匀 ,进行灭菌效果对比试验(表 1),并
且采用软毛刷轻轻刷洗材料 ,尤其是腋芽部位更应仔细 。这样不仅可避免对组织的破坏和机械损伤 ,也可
使消毒液与材料充分接触 ,使灭菌效果明显提高。
实验表明 ,通过此方法灭菌的外植体损伤率控制在 3%左右 ,但方法“1.2.1”和方法“1.2.2”材料的污
染率还是很高 ,而方法“1.2.3”和方法“1.2.4”中加入了表面活性剂吐温-80 的污染率有明显的下降 。非
离子型表面活性剂毒性最小 ,且吐温类尤其是吐温-80最小 ,对不同 pH值具有显著的适应性 ,与高浓度电
解质共存时也较稳定 ,能与大多数药剂配伍 。本方法加入吐温-80 的意义就在于它不仅可增加消毒液的
溶解度又能降低消毒液与植物材料之间的表面张力 ,使消毒液能充分与植物材料接触 ,提高组织培养的灭
菌效果 ,并且不会造成材料的损伤 ,还容易去除。
由实验结果得出 ,在控制消毒液浓度和消毒时间的前提下 ,加入非离子型表面活性剂吐温-80 ,操作时
用软毛刷轻轻刷洗材料 ,尤其是腋芽部位 ,不仅不会造成材料的损伤 ,还可提高消毒液的灭菌效果 ,提高组
织培养的成功率 。本实验也将为其它芳香植物组织培养材料的灭菌提供参考依据。
参　考　文　献
[ 1] 姚　雷.芳香植物[ M] .上海:上海教育出版社 , 2002 , 51 , 109.
[ 2] 鲁朝辉 , 张少艾.唇萼薄荷屋顶草坪建植与养护技术研究[ J] .草原与草坪 , 2004 ,(1):58～ 59.
[ 3] 赖家业 , 杨振德.野薄荷的茎段培养[ J] .广西热作科技 , 2000 ,(3):9～ 11.
[ 4] 吴　涛 , 朱玉灵 , 范泽民 , 等.薄荷组培苗的组培快繁技术研究[ J] .安徽农业科学 , 1999 ,(6):609～ 612.
[ 5] 臧玉琦 , 吴　涛 , 朱玉灵 , 等.薄荷茎尖生长点离体培养[ J] .中国农学通报 , 1998 ,(1):47～ 73.
[ 6] 师素云 , 陈兴明 , 薛启汉 , 等.薄荷离体培养愈伤组织诱导与植株分化[ J] .江苏农业科学 , 2000 ,(6):27～ 28.
[ 7] 赵恒田 , 王新华 , 班文杰 , 等.薄荷组培工厂化育苗技术[ J] .农业系统科学与综合研究 , 2004 ,(1):60～ 61.
[ 8] 杨增海.园艺植物组织培养[ M] .北京:农业出版社, 1999 , 9～ 12 , 48～ 52.
[ 9] 颜昌敬.植物组织培养手册[ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1990 , 26～ 31 , 62～ 79.
The Prevention of Bacteria Pollution from the
Process of Tissue Culture of Pennyroyal Mint
ZHANG Yan-ling , YAO Lei , SHEN Xiao-hui
(College of Agricul ture and Biology , Shanghai J iaotong University , Shanghai 201101)
Abstract:The methods of preventing bacteria pollution from the process of tissue culture of Penny royal
M int w ere studied.The resuls showed that the pollution rates of the culture at 25℃w ithout Tween-80 were
38.4% and 53.2% respectively , while the rate of pollution declined to 6.03% and 8.94%when Tw een-80
w as used in the culture , indicating that the pollution rate can bemarkedly reduced w ith the method of using
Tween-80.
Key words:Penny royal mint;Tissue culture;Prevention of pollution
6 上　　海　　农　　业　　学　　报　　　　　　　　　　　　　　　21卷