全 文 ：of hepatitise virus. Lan cet, 764 ～ 766
2　贺玉琢 ,高英杰,富杭育.正柴胡饮的抗病毒作用的实验研究.中国
实验方剂学杂志 , 1996, 2(1)∶12
3　卢长安.中西医结合病毒学研究技术与方法.孟庆云 ,主编.中西医结
合基础理论研究方法与实验技术 ,第 1版,北京:中国古籍出版社 , 1999:
390～ 420
夏至草总生物碱对休克血浆所致离体豚鼠乳头状肌电生理效应的影响*
张晓云 , 赵兰平 ,刘艳凯** ,温晓竞 ,王雪芳
(河北北方学院生理教研室 , 1病理生理教研室 , 3第一附属医院泌尿外科 ,张家口 　075029)
　　摘　要　目的:研究休克血浆(SP)对离体豚鼠心室乳头状肌细胞的电生理效应及夏至草生物碱(AH L)对心肌的保护作用。
方法:利用常规玻璃微电极细胞内记录技术 , 观察不同浓度的夏至草生物碱对抗休克血浆致离体豚鼠心室乳头肌动作电位变化的
作用。结果 :(1)SP灌流 , 豚鼠心室乳头肌细胞动作电位的 APA、OS均显著升高 , APD50 、APD90、APD明显延长。 (2)0. 5g%AHL可
明显降低休克血浆引起的 OS、APA升高效应 , 1. 0g%AHL使 OS、APA进一步下降 , 并明显对抗休克血浆引起的 APD50 、APD90、APD
延长效应 , 使动作电位时程显著缩短。结论:夏至草生物碱具有干预休克血浆所致豚鼠乳头状肌细胞动作电位改变的效应 ,可能对
心脏有一定的保护作用。
　　关键词　夏至草;乳头状肌;动作电位;休克血浆
　　夏至草 Lagopsis supina (Steph) Ik. Ga.l有活血去瘀 、调经等
功能 , 主治月经不调 、半身不遂 、血滞经闭 、贫血性头昏等疾病。
已分离鉴定 6个化合物 [ 1, 2] 。对心肌细胞的电生理作用尚未见
报道 , 本实验利用常规的玻璃微电极细胞内记录技术 , 观察了
休克血浆对离体豚鼠心室乳头状肌动作电位的影响及夏至草
生物碱对休克血浆的干预作用。
1　材料和方法
1. 1　 试验药物　夏至草由内蒙驻张家口医药站提供 , 经河北
北方学院中医系姜希强教授鉴定 ,按文献 [ 3]方法制备夏至草总
生物碱提取液 , 活性炭脱色 、灭菌制成生药含量为 0. 1g /m l的
注射液经检查 pH、澄清度 、溶血试验检测均合格。
1. 2　动物　200 ～ 300g成年豚鼠 , 中国医学科学院实验动物繁
育中心提供。
1. 3　仪器　PCLAB生物信号系统 , 浙江医科大学实验仪器厂
生产;DWF - 3型微电极放大器 , 军事医学科学院实验仪器厂生
产;SDQ - 4型三道电子刺激器 , 蚌埠实用技术研究所;微循环
显微电视录像设备 , 徐州光学仪器厂生产;ZCZ -50型自动抽注
机 , 浙江医科大学实验仪器厂生产。
1. 4　方法
1. 4. 1　 SP的制备　按我室方法复制豚鼠失血性休克模型 [ 3] ,
豚鼠颈动脉插管 , 经三通管一端连 Lam son瓶 , 另一端记录血压 ,
通过调节瓶的高度 , 将血压降至 5. 3kPa维持 60m in, 颈动脉放
血 4m l, 2000转 /分离心 10m in,取上清液 , 制备 SP。
1. 4. 2　标本制备 　豚鼠击颅致昏后迅速开胸取出心脏 , 置于
O2饱和的改良 Locke液中 , 暴露左室 , 选择分支少 、大小约 0. 6
mm ×1 mm ×3mm的柱状乳头肌。制好的标本以不锈钢针固定
于灌流槽内的硅橡胶上 ,用 36 ±0. 5℃的改良 Locke液恒温 、恒
速灌流 ,流速为 5m l /m in, 灌流液中持续充以 O2 , pH 7. 4。标本
在灌流液中稳定 120m in后开始实验。
1. 4. 3　电位引导 　采用标准玻璃微电极技术记录心肌细胞
电活动。玻璃微电极充以电极液后直流电阻为 10 ～ 20MΨ。将
刺激电极置于标本的心肌组织上 ,给一波宽 2m s、1H z,两倍阈强
度的方波刺激 , 动作电位经微电极引出后 , 经镀氯化银的银丝
输入 DWF - 3型微电极放大器后 , 一路输入监听器监听 , 另一
路经高速数模转换器输入微机 , 采样存储动作电位并分析其各
项参数指标。
1. 4. 4　观测指标 　静息电位( resting po ten tia l, RP)、超射 (o-
ve rshoo t, OS)、动作电位幅值 ( am plitude o f ac tion po tentia l,
APA)、 0 相最大除 极速率 (m axima l rate o f depo lariza tion,
Vm ax)、复极 50%和 90%时间 ( 50% and 90% o f duration o f ac-
tion po ten tial, APD50 and APD90)及动作电位时程(duration o f ac-
tion po ten tial, APD)。
1. 4. 5　实验过程 　引导豚鼠心室乳头肌动作电位 , 待动作电
位稳定 10m in后 ,采集正常的动作电位做对照;然后向心肌灌流
液中加入 SP 2m l(灌流液为 20m l)灌流 , 分别记录灌流后 1m in、
3m in、5m in、10m in、15m in时的电位变化;之后由低到高剂量依
次加入夏至草生物碱 , 使 100m l灌流液中夏至草浓度分别达到
0. 5g、 1g及 2g(0. 5、 1、 2%), 并于灌流后 1m in、 3m in、 5m in、
10m in、15m in时 , 记录每一浓度下的动作电位变化。
2　结果
2. 1 　休克血浆对豚鼠心室乳头状肌动作电位的影响　用 SP
灌流心室乳头肌 5m in,动作电位超射(OS)及幅值明显增高 , 分
别由 22. 73 ±4. 63mV、 113. 86 ±5. 89mV增高至 28. 78 ±4.
18mV、119. 61±4. 75mV(P均 <0. 05);10m in时 , 动作电位时程
32 中药药理与临床 2007;23(2)
* 基金项目:河北省中医药管理局项目(No. 200002)　　　**通讯作者
DOI牶牨牥牣牨牫牬牨牪牤j牣cnki牣zyy l牣牪牥牥牱牣牥牪牣牥牨牳
(APD)开始延长 , 尤其是 APD50由 156. 38 ±14. 70m s延长至
163. 25±15. 87m s(P<0. 01), 上述效应 10 ～ 15m in达到最大 ,
见表 1。
2. 2 　夏至草干预休克血浆对豚鼠心室乳头状肌动作电位的效
应　向 SP灌流液依次加入不同浓度的 AH L 0. 5、1. 0、2. 0%后 ,
0. 5%AHL即可明显降低休克血浆引起的 OS、APA升高 (P<0.
01), 1. 0%AHL使 OS、APA进一步下降 , 而且也明显对抗了休
克血浆引起的 APD
50
、APD
90
、APD延长效应 , 使动作电位时程显
著缩短(P<0. 01);上述效应在浓度为 2. 0%时达到最强 , 且呈
浓度依赖性 , 图 1、表 1。
图 1 　休克血浆对豚鼠心室乳头肌动作电位的影响及夏至草干预的作用
A:control;　 B:shock plasma;　C:0. 5%AHL;　 D:1. 0%AHL;　E:2. 0%
AHL.
　　表 1　休克血浆对豚鼠心室乳头肌动作电位的影响及夏至草的干
预作用 (–x±s, n=9)
Control组 SP组 AH L干预组 (灌流液夏至草含量 %)
AHLⅠ (0. 5) AHL Ⅱ(1. 0) AH LⅢ(2. 0)
PR(mV) 81. 15±3. 17　 80. 84±3. 77 79. 44±5. 19 80. 44±3. 13 81. 43±3. 61　　
OS(mV ) 22. 73±4. 63* 28. 78±4. 18 　　21. 55±2. 14**　　17. 38±4. 76** 11. 61±6. 17**
APA(mV) 113. 86±5. 89* 119. 61±4. 75　　110. 94±5. 51** 107. 76±6. 76** 102. 94±9. 14**
Vm ax(V /s) 235. 81±10. 75　221. 61±11. 19 205. 54±11. 88 199. 64±10. 94 196. 52±14. 90　　
APD50(ms) 156. 38±14. 70*163. 25±15. 87 159. 75±16. 64 　　150. 00±11. 51**134. 86±10. 38**
APD90(ms) 190. 38±16. 99*194. 75±18. 77 190. 63±17. 65 　　182. 25±15. 21**168. 00±11. 34**
APD(m s) 204. 00±18. 01*210. 88±17. 62 207. 50±19. 53 　194. 38±10. 49* 184. 43±9. 39**
　 　* p<0. 05, ** p<0. 01 v s SP
3　讨论
　　休克中 , 心泵功能的降低是引起微循环障碍 、组织细胞缺
血性损害的重要原因。因此 , 探讨心肌缺血性损伤的机制并寻
找抗心肌损伤的有效药物对疾病的治疗具有重要意义。实验
结果表明 , SP灌流液时豚鼠心室乳头肌细胞动作电位的 APA、
OS均显著升高 , APD50、APD90 、APD也明显延长 ,推测这些电位
改变与休克时机体的应激状态有关。休克时 , 由于 SP中肾上
腺髓质素 (ADM)、一氧化氮 、自由基等物质增多及细胞内 Ca2+
超载 ,使心肌细胞膜 Ca2+ - Na+交换异常 [ 5] , Na+负荷过度 , 去
极化时 Na+内流增加 , 因而心室肌细胞动作电位的 OS、APA明
显增高;另外 , Ca2+负荷过度 , 复极化缓慢 , 可能是 APD明显延
长的重要原因。
用含夏至草生物碱的休克血浆灌流液后 , 可明显拮抗 SP
导致的心室乳头状肌动作电位 OS、APA增高及 APD
50
、APD
90
、
APD延长效应。提示夏至草生物碱有拮抗 SP的电生理效应 ,
对心肌细胞有一定保护作用。我们过去的研究发现 , 夏至草生
物碱既可改善血液循环 ,增加心肌收缩力 , 又可通过增强淋巴管
收缩性 、增强淋巴循环转运及降低淋巴液粘度作用 , 有效改善淋
巴循环 ,促进疾病的转归 [ 6 ～ 10] 。
综上所述 ,夏至草生物碱对休克血浆引起的心肌电生理效
应有明显的干预作用 ,其机制可能与改善微循环障碍 、矫正血液
流变性异常 ,提高器官血液灌流 , 减轻对心肌细胞的损伤有关。
参 考文 献
1　袁久荣 ,李全文 ,李智立. 夏至草化学成分的研究. 中国中药杂志 ,
2000;25(7)∶ 421 ～ 423
2　李佳 ,陈玉婷. 夏至草中两种黄酮苷类化合物的研究. 药学学报 ,
2002;37(3)∶ 186 ～ 188
3　顾学裘 ,主编.药物制剂注解. 北京:人民卫生出版社 , 1988;239 ～
238.
4　牛春雨 , 张静 , 樊贵 , 等.淋巴液对失血性休克大鼠肠系膜微循环变
化的影响.循环学杂志 , 1996;6(3)∶1 ～ 3
5　Torozhevykh TP, Pinelis V inskaya, et a.l The lead ing role of m emb rane
Ca2+ -ATPase in recovery of Ca2+ hom eostasis after g lu tam ate shock. Bu ll
Exp B iolM ed, 2003;135(2)∶139～ 142.
6　刘亚军 ,祁秀峰 , 翟新玲. 夏至草对家兔离体心脏心肌收缩力的影
响. 张家口医学院学报 , 1998;15(2)∶ 8～ 9
7　张利民 ,姜华 ,刘艳凯 ,等.夏至草提取物对急性血瘀大鼠淋巴微循环
的作用作用. 中药材 , 2004;27(7)∶509 ～ 511
8　张利民 ,姜华 ,任君旭 ,等.夏至草提取物对大鼠实验性微循环障碍的
影响. 四川中医 , 2004;22(7)∶ 14 ～ 16
Effects of alkalo ids from H erba Lagopsis on elec trophysiological
effects of shock plasma in guinea pig papillarymuscles
Zhang X iaoyun, Zhao Lanping, L iu Yankai, et a l
(Depa rtm ent of Phy sio logy, H ebe i North Universicity, Zhang jiakou 　075029)
　　Objec tive:The purpo se of th is study was to investigate the e lec trophysio log ica l effec ts o f shock plasm a on gu inea pig papillary muscles
and the pro tective ac tions o f alka loids from Herba Lagopsis(AH L). Method:Ac tion po ten tials w ere recorded by using conven tiona l intrace l-
lu larm icroe le ctrode technique. Resu lts:(1) In norm a l pap illa rym usc les, shock p la sm a no t only increa sed the amp litude of action po tential
(APA), overshoo t(OS), but a lso p ro longed the dura tion o f action po ten tial(APD)(P<0. 05). (2)The e ffec ts of shock plasm a on guinea
pig pap illa ry musc le s we re inhib ited by AHL(0. 5、1. 0、2. 0%) in a concentra tion - dependent manner, AHL can significan tly decreased the
33中药药理与临床 2007;23(2)
amp litude of ac tion po tentia l(APA), overshoo t(OS)(P<0. 01)and shorted the dura tion of APD50 、APD90 、APD. C onclusion:AHL signifi-
cantly antagonized the e lectrophy sio log ica l effects o f shock plasma on gu inea pig papillary m uscles.
　　K ey words　 H erba Lagopsis ;papilla rym usc le s;ac tion potentia l;shock plasm a
黄芪提取物对人脐静脉内皮细胞的促血管新生作用*
张 ,胡光 ,洪思佳 ,刘倩青 ,李铭源** ,王一涛
(澳门大学中华医药研究院 ,澳门)
　　摘　要　目的:研究黄芪提取物(RAE)对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的促血管新生作用。方法:以体外培养 HUVEC为模
型 , XTT法及细胞计数法检测不同剂量黄芪提取物对细胞增殖的影响;细胞迁移实验检测加药后细胞迁移能力;采用 T ransw e ll
cham be r进行细胞侵入实验检测黄芪提取物对细胞侵入能力的影响;管形形成实验观察加入黄芪提取物后细胞分化情况。结果:
XTT法检测 HUVEC在黄芪提取物浓度为 12. 5μg /m l时产生最大增殖效应 , 增殖率为 42. 04%。细胞计数法测得在黄芪提取物浓度
为 25μg /m l时细胞数目比对照组增多 124. 64%。同时发现在黄芪提取物浓度为 25μg /m l时能够最大能力地诱导细胞侵入和管形
形成 , 其侵入率为 66. 68%, 管形分枝点增值率为 44. 38%;而在浓度为 12. 5μg /m l时能够最大限度地诱导细胞迁移 , 迁移率为 74.
94%。结论:黄芪具有促进血管新生的作用。
　　关键词　内皮细胞;黄芪提取物;血管新生
　　血管新生 (ang iogene sis)在人体正常发育和许多疾病的发
生发展中发挥重要作用 , 尤其与肿瘤的形成及转移关系密切。
近年来 , 针对疾病状态下异常的血管新生已经成为国内外研究
的热点。中医药关于活血化瘀 、益气补血等药物的研究成为中
药促血管新生的研究提供了重要线索。其中黄芪与当归及其
组方当归补血汤抗心肌缺血损伤及对血管内皮细胞的保护作
用已有报道 [ 1] 。目前 , 黄芪及其配伍方剂的应用除了对血管的
保护作用外 , 是否还有血管生成等作用;抑制或促进血管生成
的作用是否是因不同病理状态 、器官或配伍而产生 , 这些内容
都具有深入研究的价值。
　　黄芪提取物(Rad ix A straga li Ex trac t, RAE)是从黄芪提取的
有效部位群 , 主要成分为黄芪总黄酮和黄芪多糖。本研究以体
外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型 , 观察黄芪提取物对
HUVEC的作用特点。
1　材料与方法
1. 1　试验药物　黄芪粗提物由购于陕西方舟制药有限公司 , 并
由本研究院胡光进一步分离得到。 溶于 DMSO中制成含药浓
度为 100mg /m l的药液 , 储藏于-20℃冰箱中备用。 VEGF溶于
去离子纯水中 , 浓度为 100μg /m l,储藏于-80℃冰箱中备用。
1. 2　试剂 　Ka ighns modification o f H ams F12 medium (F-
12K), 小牛血清(FBS), 磷酸盐缓冲液 (PBS), 青霉素-链霉素
(PS)和 0. 25% (w /v)胰蛋白酶 /1mM EDTA 均购于 Invitrogen
(Ca rlsbad, CA, USA). 内皮细胞生长素 (ECGS), 肝素 , 明胶
由 S igm a(S t Louis, MO)公司提供。无生长因子基质胶(G row th
facto r-reduced M atrige l), 血管内皮生长因子 (VEGF), B io-
C oatTM M atrige lTM 24孔板和迁移孔 (T ranswe ll小室 , 滤膜孔径
为 8μm)均购于 BD Biosciences(Bedford, MA)。
1. 3　方法
1. 3. 1　细胞培养　人脐静脉内皮细胞(HUVE-12, ATCC, M an-
assa s)采用 Ka ighns modifica tion ofH ams F12 m edium (F-12K)培
养 ,其中含有 2mM的 L-谷氨酸 、 100U /m l青霉素 、100U /m l链霉
素 、100 μg /m l肝素 、 30μg /m l内皮细胞生长素和 10% FBS, 于
37℃ 5%CO2培养箱中进行培养。细胞培养瓶及实验中采用的
96孔板 、24孔板 、6孔板在使用前先覆盖一层含有 0. 1%的明
胶 ,实验中取 2 ～ 5代 HUVEC进行实验。
1. 3. 2　XTT法检测黄芪提取物对细胞增殖的影响　取 HUVEC
经清洗 , 消化 , 制成细胞悬液。 经细胞记数 , 按每孔 1 ×104 /
100μl接种与 96孔板。正常培养 24小时后弃去培养液 , 换上只
含有 0. 5%FBS的培养液预处理 24小时 , 以达到细胞同步化。
实验分为阳性对照组(VEGF)、黄芪提取物组及对照组。阳性
对照组含浓度为 20ng /m l的 VEGF和 0. 1%的 DM SO, 黄芪提取
物组设为 8个剂量组 , 按 200μl /孔加入含药培养液 , 每个剂量
组设 8个复孔 , 对照组只加含有 0. 5%FBS和 0. 1%DMSO的培
养液 ,继续常规培养 48小时 。弃去培养液 , 使用酶标仪(Perk in
E lm er, Singapo re),按 XTT法测定各孔 490nm、 690nm 处的吸光
度(OD值)。证实黄芪提取物在浓度为 12. 5μg /m l及 6. 25μg /
m l时对 HUVEC有促增殖作用 , 因此选用 25μg /m l、 12. 5μg /m l、
6. 25μg /m l为后续实验的参考浓度。
1. 3. 3　细胞计数法检测黄芪提取物对细胞增殖的影响　取
HUVEC按每孔 5×104 /500μl接种于 24孔板。正常培养 24小
时后弃去培养液 ,换上只含有 0. 5%FBS的培养液预处理 24小
时以达到细胞同步化。实验分组同上 , 阳性对照组含浓度为
20ng /m l的 VEGF和 0. 1%的 DM SO,黄芪提取物组设 25μg /m l、
12. 5μg /m l、 6. 25μg /m l 3个剂量组 , 按 500μl /孔加入含药培养
液 ,每个剂量组设 3个复孔 , 对照组只加含有 0. 5%FBS和 0.
34 中药药理与临床 2007;23(2)
* 基金项目:澳门科技发展基金资助项目(078 /2005 /A2)　　　　　**通讯作者