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(责任编辑 葛华忠)
超声波法提取加杨叶总酚条件的优化
李媛 ,陈媛梅＊
(北京林业大学理学院 ,北京 100083)
摘 要:为得到加杨叶中总酚的最佳提取工艺 , 通过单因素和正交实验进行优选 ,并进行方差分析。结果表明:影
响加杨叶总酚提取工艺的主要因素为乙醇浓度 , 其次是液料比和提取温度 , 而提取时间则影响不大。以乙醇为提
取溶剂 , 在提取两次的条件下 ,加杨叶总酚的最佳提取工艺为:乙醇浓度 70%、液料比 40∶1、超声时间 10 min、超声
温度 55℃,在此条件下加杨叶中总酚得率为1.43%。该方法重现性好 , 精密度高。
关键词:超声波法;加杨叶;总酚
OptimizationextractiononultrasonictechnologyoftotalphenolsinleavesofPopuluscanadensis
Moench.∥LI-Yuan, CHENYuan-mei
Abstract:Thesinglefactortestandtheorthogonalexperimentaldesignwerecariedouttooptimizetheextractiontechnology
oftotalphenolsfromleavesofPopuluscanadensisMoench..Theresultindicatedthatethanolconcentration, theratioofsol-
venttomaterialandtheextractiontemperaturehadaremarkableinfluenceontheextractionoftotalphenols, whiletheex-
tractiontimehadhardlyinfluenceonit.Extractedtwiceusing70% ethanolasextractionsolvent, theoptimalextraction
technologyoftotalphenolsis40∶1oftheratioofsolventtomaterial、 55 ℃ oftemperature、 and10minofextractingtime.
Byaboveextractiontechnology, totalphenolscontentwas1.43%.Theoptimizedtechnologyhadgoodreproducibilityand
highprecision.
Keywords:ultrasonicextraction;Populuscanadensisleaves;totalphenols
Author saddress:ColegeofScience, BeijingForestUniversity, 100083 Beijing, China
收稿日期:2010-04-01 修回日期:2010-06-20
第一作者简介:李媛(1982-),女 ,硕士生 , 研究方向为生物大分子结
构与物理化学研究。通讯作者:陈媛梅 ,女 ,副教授。 E-mail:chyml1@
bjfu.edu.cn
加杨 (PopuluscanadensisMoench.)又称加拿大
杨 ,是美洲黑杨和欧洲黑杨的杂交种 ,为杨柳科杨属
植物 ,早在 19世纪就已引入我国 ,由于繁殖容易 ,适
应性强 ,既可成片造林 ,又可 “四旁 ”种植 ,所以在我
国分布广泛 ,资源丰富[ 1] 。许多研究表明 ,杨属植物
的主要特征性成分是酚甙 、酚酸类化合物和黄酮类化
合物 [ 2-3] 。天然酚类物质是植物体内产生的一类特
殊次生代谢产物 ,广泛存在于植物体内 。酚类物质具
有抗菌 、消炎 、抑制血小板聚集 ,抗凝血及血栓形成等
作用 [ 4] ,被人们称为健康的 “第七营养素 ”[ 5] 。近年
来 ,随着酚类化合物功能认识的深入 ,酚类物质越来
越被人们重视 。
超声波法利用超声波产生的强烈振动 、空化效
应 、粉碎等作用 ,破坏植物材料的细胞 ,从而使细胞中
的有效成分得以释放 ,直接与溶剂接触并溶解在其
中 ,从而提高有效成分的提取率 [ 6] 。超声波提取方
法由于具有操作简便 、提取温度低 、提取率高 、提取物
的结构未被破坏等特点 ,已广泛用于天然植物的有效
成分提取 ,如含笑叶总酚的提取 [ 7] ,杜仲叶黄酮的提
取等 [ 8] 。本文以乙醇作为提取溶剂 ,借助于超声波
法进行提取 ,以总酚得率为指标 ,研究了加杨叶总酚
的最佳提取工艺条件 , 并测定了加杨叶总酚的含量 ,
为加杨叶的开发利用提供科学参考 。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂);Item
AR2140电子天平;电热鼓风干燥箱 (重庆万达仪器
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林业科技开发 2010年第 24卷第 6期 97
有限公司);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有
限公司);KQ500DB型超声波清洗器(昆山市超声仪
器有限公司);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生
化仪器厂)。
1.2 试剂与材料
试剂:没食子酸标准品 、无水乙醇 、三氯化铁 、铁
氰化钾 、盐酸为分析纯。
材料:均匀采集 5月生长良好的加杨叶 。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液的制备
精确称取没食子酸标准品 0.10 g,用乙醇溶液溶
解 ,定容至 100mL,摇匀得 1mg/mL的没食子酸贮备
液;然后准确吸取 5.0 mL没食子酸贮备液于 100mL
容量瓶中 ,加乙醇溶液定容得 5 μg/mL没食子酸标准
溶液 。
1.3.2 标准曲线绘制
参考王旭航等 [ 9] 方法绘制没食子酸的标准曲
线。具体方法如下:准确吸取没食子酸标准溶液 0.1、
0.2、0.3、 0.4、 0.5、 0.6mL, 分别置于 25 mL容量瓶
中 ,依次加入 0.5mLFeCl3 (0.10 mol/L), 0.5 mL
K3Fe(CN)6 (0.008 mol/L), 0.5mLHCl(0.10
mol/L),然后用乙醇定容至刻度线 ,摇匀 。待反应稳
定后 ,以试样空白作参比 ,在波长 695nm处测定吸光
度。以浓度 c(mg/mL)为横坐标 ,吸光度 A为纵坐
标绘制标准曲线。
1.3.3 样品总酚含量测定方法
在不同条件下用不同浓度的乙醇提取 2次后定
容到 100 mL,每次准确量取 0.1 mL置于 25 mL容量瓶
定容 。按照普鲁士蓝法[ 10]测定吸光度后 ,从标准曲
线中查出总酚的浓度 ,计算加杨叶中总酚得率。
加杨叶总酚得率 =c×25×100 /0.1m×1000 ×100%,
式中:c———从标准曲线上查得酚酸的浓度 , 单位
μg/mL;m———样品的质量 ,单位 g。
1.3.4 优化提取工艺
将加杨叶除杂 ,用蒸馏水洗净 , 40℃烘干后粉碎 ,
过筛得加杨叶粉末 。准确称取 1.00 g粉末若干份 ,分
别在不同浓度的乙醇 、液料比 、超声时间 、超声温度条
件下作单因素平行试验 ,按前面所述的方法测定各样
品总酚的含量 。
根据单因素试验结果选择乙醇浓度 、液料比 、超
声时间 、超声温度 4因素中有意义的 3水平作正交试
验。选用 L9(34)正交表对加杨叶总酚提取工艺进行
研究 ,确定最佳提取工艺 。
1.3.5 重复性试验
准确称取1.00g加杨叶粉末 5份 ,以确定的最佳
提取工艺进行 5次平行实验 ,按前面所述的方法进行
样品总酚含量的测定 。
1.3.6 精密度试验
为验证所用仪器的精密度 ,分别准确量取同一份
样品制备提取液 0.1 mL加入 5个 25 mL容量瓶 ,按照
前面所述的方法测定吸光度后 ,进行样品总酚得率的
计算。
1.3.7 加样回收试验
准确称取已知总酚含量的加杨叶粉末 5份 ,每份
1.00 g,分别加入一定量的没食子酸对照品 ,按最佳
工艺制备 ,参照前面所述的方法进行总酚含量的测
定 ,计算回收率 。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
标准曲线如图 1所示 ,用最小二乘法作线性回
归 ,结果表明在 0.2 ～ 1.2μg/mL的范围内 ,吸光度与
浓度呈良好的线性关系。
图 1 没食子酸标准曲线
2.2 单因素实验
2.2.1 乙醇浓度的选择
酚类在植物体内通常与蛋白质 、多糖以氢键和疏
水键形式形成稳定的分子复合物 ,多酚分子间也是如
此 ,所以酚类的提取试剂不仅要求对酚类有很好的溶
解性 ,而且需具有氢键断裂的作用。所以有机溶剂和
水的复合体系最适合酚类的提取 。鉴于乙醇对植物
细胞的穿透能力较强 ,无毒 ,为此选择乙醇和水的复
合体系 。
在 65℃、液料比 30∶1 (mL/g,下同)条件下 ,采用
不同浓度乙醇提取30min,结果如图 2所示。
加杨叶的总酚得率随着乙醇浓度的增高呈现先
升高后下降的趋势 ,当乙醇浓度为 70%(质量比 ,下
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98 林业科技开发 2010年第 24卷第 6期
同)时 ,总酚得率最高 ,为 1.29%。 60%和 80%的乙醇
浓度的提取得率也较高 ,这可能是 60% ～ 80%乙醇浓
度的复合体系对加杨叶酚类分子复合物中氢键的断
裂起一定的作用[ 10] 。因此 ,用于超声波法提取加杨
叶总酚的乙醇浓度为60% ～ 80%。
图 2 乙醇浓度对总酚得率的影响
2.2.2 液料比的选择
在65℃下 ,以70%的乙醇为提取液 ,以不同的液
料比超声提取 30min,不同液料比对加杨叶中总酚得
率的影响如图 3所示 。当液料比较低时 ,总酚得率随
着液料比的增加而提高;但液料比大于 30∶1时 ,总酚
得率趋于平稳 。这可能是当液料比为 30∶1时 ,加杨叶
中总酚的提取量已达到最大 ,所以继续增加液料比时 ,
总酚得率趋于平稳。同时 ,溶剂的用量是工业生产中
的一个重要经济指标 ,从节约成本上考虑 ,溶剂用量不
宜过大。因此 ,在此实验条件下 ,选择液料比为30∶1。
图 3 不同液料比对总酚得率的影响
2.2.3 超声时间的选择
在65℃、液料比 30∶1、70%乙醇条件下 ,以不同超
声时间对加杨叶总酚进行提取 ,结果如图 4所示。在
本实验条件下 ,超声时间在 10 ～ 20min之间 ,总酚得
率变化较大;超声时间在 20 min时 ,总酚得率达到最
大;以后随着超声时间的增加总酚的得率下降 ,最后
趋于平衡 。这可能是在 10 ～ 20min之间 ,酚类物质溶
出的速度大于降解的速度 ,得率呈上升趋势 ,但当超
声大于20 min以后 ,酚类物质溶出的速度小于降解的
速度 ,得率呈现下降趋势 ,最后趋于平衡。因此加杨
叶总酚超声提取的时间最佳为 20 min。
图 4 不同超声时间对总酚得率的影响
2.2.4 超声温度的选择
在液料比 30∶1、超声时间为 20min,乙醇浓度为
70%的条件下 ,在不同温度下提取加杨叶总酚 ,结果
如图 5所示 。当超声温度小于 55℃时 ,随着温度的升
高总酚得率增大;温度为 55℃时总酚得率最高 ,当温
度大于 55℃时提取率显著降低。这可能是提取温度
的升高增加了化合物溶解性和扩散速率 ,减小溶剂的
黏度 ,酚类物质容易穿透植物组织 ,得率升高 ,但是 ,
温度太高也易使酚类成分的结构发生变化 ,导致提取
得率降低 [ 11] ,所以加杨叶中酚类物质的提取不应超
过55℃。
图 5 不同超声温度对总酚提取率的影响
2.3 超声波法提取正交试验
采用 L9(34)正交表 ,以总酚得率为考察指标 ,对
超声波提取加杨叶总酚的工艺进行研究。正交实验
分析见表 1。
试验结果表明:在超声功率为 60w,提取 2次的
条件下 ,直观分析发现 ,对加杨叶总酚提取率影响最
小的因素是提取时间 。根据表 1中极差分析结果 ,可
知各因素对酚酸得率的影响顺序为 A﹥ B﹥ D﹥
C,其最佳水平组为 A2B3C1D2 ,即乙醇浓度为 70%,液
料比 40∶1、超声时间10min、超声温度 55℃。
2.4 重复性试验
按选定的最佳提取工艺进行 5次平行实验 ,结果
技术开发
林业科技开发 2010年第 24卷第 6期 99
见表 2。从表中可见 ,试验结果重现性好 ,该方法稳
定可行。
表 1 L9(34)正交试验结果与分析
实验号 乙醇浓度A/%
液料比 B
(mL/g)
超声时间
C/min
超声温度
D/℃ 得率 /%
1 60 20∶1 10 50 1.02
2 60 30∶1 20 55 1.04
3 60 40∶1 30 60 1.20
4 70 20∶1 20 60 1.37
5 70 30∶1 30 50 1.11
6 70 40∶1 10 55 1.43
7 80 20∶1 30 55 1.04
8 80 30∶1 10 60 1.03
9 80 40∶1 20 50 1.16
k1 3.26 3.43 3.48 3.29
k2 3.91 3.18 3.57 3.51
k3 3.23 3.79 3.35 3.60
K1 1.087 1.143 1.160 1.097
K2 1.303 1.060 1.190 1.170
K3 1.077 1.263 1.117 1.200
R 0.226 0.203 0.073 0.103
优化方案 A2 B3 C1 D2
表 2 重复性试验结果
指标 1 2 3 4 5 RSD/%
得率 /% 1.42 1.42 1.45 1.46 1.39 2.10
2.5 精密度试验
精密度试验结果见表 3。从表中可见 ,用分光光
度法测定加杨叶中总酚含量 ,相对标准偏差较小 ,精
密度较高 。
表 3 精密度试验结果
指标 1 2 3 4 5 RSD/%
得率 /% 1.42 1.40 1.43 1.46 1.40 1.84
2.6 加样回收试验
加样回收试验结果见表 4。由此可见 ,平均回收
率为 100.08%, RSD=3.50%(n=5),说明此工艺提
取加杨叶总酚是可行的 。
表 4 加样回收率试验结果
样品号样品中总酚含量 /mg
没食子酸加
入量 /mg
测定量
/mg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
1 14.33 1.20 15.61 100.62
2 14.33 3.60 17.96 103.94
3 14.33 5.20 19.53 97.49 100.08 3.50
4 14.33 7.00 21.30 102.75
5 14.33 9.20 23.49 95.60
3 结 论
本研究通过单因素及正交试验 ,考察乙醇浓度 、
液料比 、超声温度和超声时间对总酚得率的影响 。结
果表明 ,影响总酚得率的因素主次顺序是:乙醇浓度
﹥液料比﹥超声温度﹥超声时间;方差分析也表明:
乙醇浓度对总酚得率有显著影响 。确定了超声波法
提取加杨叶中总酚的最佳工艺参数为:乙醇浓度为
70%,液料比 40∶1、超声时间 10 min、超声温度 55℃。
在此条件下提取率可达 1.43%。重复性试验 RSD为
2.10%,表明重复性好;精密度试验 RSD为 1.84%,
表明所用仪器精密度良好;加样平均回收率为
100.08%, RSD为 3.50%。因此 ,本试验确定的技术
参数和方法适用于加杨叶总酚提取 。该测定方法操
作简单 ,适合大批样品的分析 。超声波辅助提取法不
仅可使酚类化合物得到有效的提取 ,而且提取温度
低 、提取时间短 ,能有效节约能源 ,可为资源的综合利
用提供参考 。
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(责任编辑 葛华忠)
技术开发