全 文 ：药物分析杂志C hi nJp h a r mA na l2 0 06 , 2 6 ( 10 ) 一 1 37 3 一
H P L C 法测定野生与栽培藏药麻花芜中 4 种环烯醚菇普类成分的含量 ’
孙蔷` ,2 , 陈桂深 ” ’ , 李玉林 ’ ,2 , 索有瑞 ` , 马玉花 ` ,2
( 1
. 中国科学院西北高原生物研究所 , 西宁 8 r0 0 1 ;2 . 中国科学院研究生院 , 北京 l以X拼9)
摘要 目的 :对野生和栽培藏药麻花芫中龙胆苦有 、 落干酸 、樟牙菜苦昔和樟牙菜什 4 种苦普类成分进行高效液相色谱的含量
测定 ,并 t匕较分析它们之间的差异 。 方法 : 采用 E e li p s e X D B 一 C : 色谱柱 ( 4 . 6 m m x 1 50 m m , 5 林m ) ,流动相 A 为 9 5% 乙睛水溶
液 , B 为 5 % 乙睛 (含 10 m m ol · L 一 ’ 的甲酸 )水溶液 , A 在 。 一 20 而 。 内比例由 。一 10 % 进行线性洗脱 , 流速 1 . o m L · 而 n 一 ’ ,检
测波长 2 4 0 n m , 柱温 30 ℃ 。 结果 : 4 种成分均达到基线分离 , 龙胆苦什 、落十酸 、 樟牙菜苦昔 、璋牙菜昔的线性范围分别为 0 . 60
一 19
.
2 0 协g ( r = 0 . 99 9 9 ) , 0
.
2 4 一 7
.
68 卜g ( r = 0
.
9 999 )
,
0
.
3 8
一 1 2
.
02 林g ( r = 0
.
999 9 )
,
0
.
0 5
一 1 . 66 协g ( r = 0 . 99 99 ) ; 回收率分别
为 9 . 73 % , 98 . 13% , 98 . 45 % , % . 2 % 。 结论 :栽培藏药麻花芫中苦昔类成分的含量已经接近或超过野生种的水平 , 可初步代
替野生药材人药 。
关键词 :高效液相色谱 ;麻花芙 ; 龙胆苦有 ; 落干酸 ; 樟牙菜苦昔 ;璋牙菜有 ; 野生 ; 栽培
中图分类号 : R9 17 文献标识码 : A 文章编号 : 02 5 4 一 1 7 9 3 (2 006 ) 10 一 13 7 3 一 04
H P L C
i l
s im u lat n e o u s d e t e r m i n a t i o n o f of u r i r id o i d g l y c o s id e s
初ld a n d c u l t i v a t e d G e n血 n a s t矛’a m i n e a M a x im . *
s u N J i n g `
,
2 , e H E N G u i 一 e h e n L x Y u 一 li n l
,
2 , s u o Y o u 一 ur i l
,
M A Y u 一 h u a l
,
2
( 1
.
N o rt h w e s t p la t e a u nI s t i t u r e o f B i o l o群 , C h i n e s e A e a d e m y o f Se i e n e e s , X i n i n g 8 l 0() o l , C h i n a ;
2
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e i e n e e s
,
B e ij i n g 10 0 04 9
,
C h i n a )
A bs t r a e t o 讨 e e it v e : orf d e t e rm i n a : e th e e o n t e n r s of of u r iir d o i d s gl y e o s id e s , g e n ti o p i e or s id e , l o ga n i e a e i d , s w e r -
t ia r n a ir n a n d s w e r o s i d e in w i l d a n d e u l t i v a t e d 晓 n t i a n a s t r a m i n e a M a x im . b y H P LC . M e ht o d : T h e s a m P l e s w e er s e P -
a r a t e d o n a n E e l ip s e X DB 一 C S e o l u m n ( 4
·
6 m m x 15 0 m m
,
5 林m ) w i t h 9 5% a e e t o n i tir l e ( A ) a n d s % a e e t o n i t r i l e
( 10 m m o l
·
L
一 ’
fo mr i
C 。 e id ) ( B ) g
r a d i e n t 。 l u t i o n w it h n o w r at e 。 t 1
.
0 m L
·
m i n
一 ’ . M o b i l。 p h a s e ( A ) i n e r e a s e d
fr o m 0 to 10 0 % i n 2 0 m i n w i th UV d e t e e t i o n a t 24 0 n m a n d e o l u m n te m p e r a t u r e a t 3 0 ℃ . R e s u lst : F o u r e o m -
p o u n d s w e er is o l a r e d o n b a s e l i n e
.
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e l i n e a r ar n ge s of iir d o id s
,
g e n t io p i e or s id e
,
l o g a n i e a e i d
, s w e rt i a m a ir n a n d
s w e or s i d e w e
r e o
,
6 0 一 19
.
2 0 协g ( ; = 0 . 9 9 9 9 ) , 0 . 2 4 一 7 . 6 8 卜g ( r = 0 . 9 9 9 9 ) , 0 . 3 8 一 12 . 0 2 林g ( r = 0 . 9 9 9 9 ) , 0 . 0 5
一 1 . 6 6 林g ( r = 0
.
9 9 9 9 )
, r e s p e e t i v e l y
.
T h e a v e
r a g e er e o v e ir e s w e r e 9 9
.
7 3%
,
9 8
`
13%
,
9 8
.
4 5% a n d 9 6
.
2 2%
, r e -
s p e e ti v e l y
.
C o n e l u s i o n s
: T h e e o n t e n ts o f fo u
r iir d o id g ly e o s i d e s i n e u l ti
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v e er a e h e d o
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e e e d e d t h o s e i n th e w i ld o n e
.
T h e
r e fo
r e , i t 15 P r e l i m i n a
r i l y fe a s i b l e fo r t h e e u l t i
v a t e d G
.
s t r a m i砚 a u s e d a s a h e r b a l
n 一e d i e i n e to r e p l a e e ht e w il d o n e
.
K e y w o r d s : H P LC ; eC
n t i a n a s t ar m ine a ; g e n t i o pi e or s id e ; l o g a n i e a e i d ; s w e rt i a m a ir n ; s w e r o s id e ; w i l d ; e u l ti v a t e d
麻花芜 ( 晓nt ia 、 st ar m ine a M ax im . ) 为龙胆科 昔类川 ,对该类成分的分离鉴定 、 药理 、 分析等方面
( eG nt ian ac ae
e )龙胆属 多年生草本植物 , 其 以根人 已有大量的研究工作 〔’ 一 6 〕 , 近年来的研究主要集 中
药 ,为常用的上品藏药 , 是藏药中重要的解吉类植物 于其有效成分的定量分析 〔7 , 8 」。 但是有关野生与栽
药物之一 〔`〕 , 2 005 年版中国药典中将其列人 4 种人 培麻花芜中 4 种苦昔类成分 , 即龙胆苦昔 ( g en it 叩 i-
药的秦芫类药物 。 麻花芫根中的有效成分主要为苦 er os i d e ) 、落干酸 ( lgo an ic ac 记 ) 、 樟牙菜苦昔 ( sw er -
* 国家中西部专项 ( 2 0 01 B 9A 0l 4A 7) 与中国科学院知识创新工程领域前沿项 目 ( CX LY 一 20 02 一 0 8) 共同资助
* * 通讯作者 T el : ( 09 7 1 ) 6 14 3 9X() ; E 一 m ia ] :只 e h e h e n @ n w ip b . a e e n
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2006. 10. 010
3 7 1 4药物分析杂志 C hin Jh Pr m aAn 2 l a06 0
,
26 ( 10 )
t i a m a r i n )
、璋牙菜昔 ( s w e or s id e ) 含量测定的研究尚
未见报道 。 同时 , 由于近年来用药量的需求增大 ,加
之多年的过度采挖 ,造成野生麻花芫资源量的锐减 。
对麻花芫进行人工引种栽培以扩大其资源量已成为
一个函待解决的问题 。 因此 , 本实验通过紫外检测
的 H PL C 法建立 了测定野生与栽培麻花芜中 4 种苦
昔类成分含量的方法 ,为合理开发利用麻花芫资源 ,
确保其品质以及栽培措施的可行性提供科学依据 。
1 仪器 、试剂与材料
A ig le nt 1 10 0 型高效液相色谱仪 : 四元梯度泵 ,
D AD 检测器 , 10 0 位 自动进样器 , E e h p s e X D B 一 C S
色谱柱 ( 4 . 6 m , n x 15 0 m m , 5 卜m ) 。 K Q 一 2 0 0 B 型数
控超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有 限公司 ) , M il i
一
Q 超纯水系统 (美国 M i l l i p o r e 公司 ) 。
色谱纯乙睛 (德 国 M er ck 公司 ) ; 分析纯甲醇 、
甲酸 ( 山东莱阳化工厂 ) 。
龙胆苦昔 、 璋牙菜苦昔对照 品购 自中国药品生
物制 品 检定 所 ( 批 号 分 别 为 1 10 7 70 一 2 0 0 308 ,
1 10 7 8 5 一 2 0 0 2 0 3 )
,落干酸 、 嶂牙菜昔对照品 由中国
科学院西北高原生物研究所李玉林副研究员提供
(经 H P L C 峰面积归一化法测定 ,纯度大于 98 % ) 。
本实验中野生麻花芫根部材料 于 2 004 年 9 月
底分别取 自四川西北部若尔盖草原 、 青海果洛和青
海刚察 ,栽培麻花芫根部材料同期分别采 于青海西
宁 、青海徨 中县和青海廿里铺地区实验栽培 基地 。
上述样品由中国科学院西北高原生物研究所陈桂深
研究员鉴定为麻花芫 (晓 nt ian a st ar m ine a) ,样品经
阴干 、粉碎后 ,过 80 目筛 , 冷藏保存 。
2 溶液制备
2
.
1 混合对照品溶液 分别精密称取对照 品龙胆
苦昔 、 落干酸 、 璋牙菜苦昔和璋牙菜昔 ,用 甲醇溶解
后配成龙胆苦昔 1 . 9 m g · m L 一 ’ 、 落干酸 0 . 8 m g ·
m L
一 ’ 、 璋牙菜苦营 1 . 2 m g · m L 一 ` 、璋牙菜昔 0 . 2 m g
·
, n L
一 ’ 的混合对照品溶液 。
2
.
2 供试品溶液 精密称取样品粉末 0 . 2 9 , 加 甲
醇 10 m L , 于 6 0 ℃ 超声 30 m i n ;放冷至室温后过滤 ,
滤液置于 25 m L 量瓶中 ,用 甲醇定容 ,摇匀 。
3 色谱条件
色谱柱 : A g i le n t 公 司 E e l i p s e X D B 一 C S 柱 ( 4 . 6
m m x 15 0 m m
,
5 林m ) 。 流动相 : A 为 9 5% 乙睛水溶
液 , B 为 5% 乙睛 (含 10 m m ol · L 一 `的甲酸 )水溶液 ,
A 在 O 一 2 0 m in 内 , 比例由 0一 or o % 进行线性洗脱 。
流速 1 . 0 m L · im n 一 ’ , 检测 波长 2 4 0 n m , 进样量 10
卜L , 柱温 30 ℃ 。 在该色谱条件下落干酸 、 璋牙菜苦
昔 、 龙胆苦昔 、璋牙菜昔 4 种成分均被洗脱并达到基
线分离 (图 1 ) 。
18 亡m/ i n
图 1 对照品 ( A ) 、青海果洛野生样品 ( )B 和青海西宁栽培样品 ( C )
的色谱图
F ig 1 H P L C e h
r o m a t o 『a m s o f r e fe , n e e s t a n dadr s ( A )
, w i ld
s a n l p l
e
ofr m G
u o l u
o ,
Qi n g h
a i ( B )
a n d e u l t i
v a t e d s a m p l e fro m X i
n i n g , Qi n gh
a i
( C )
1
. 落十酸 ( l o g a n i e a e id ) 2 . 璋牙菜苦脊 ( s w e rt i a m o n ) 3 . 龙胆苦昔
( g
e n t i o P i e or
s i d
e
) 4
. 璋牙菜葺 ( s w e or s i (l e )
4 线性关系考察
取 “ 2 . 1 ” 项下 的混合对照品溶液 , 逐级稀释 1
倍 , 每次进样 10 林L , 以峰面积定量 ,分别得到 4 种
苦昔类成分的回归方程及线性范围 ,见表 l 。
表 1 4 种苦普类成分的回归方程及线性范围
T a b 1 L i n e a r e q u a t io n a n d li n e a
r
ar n g o f
fo u r i r id o id g ly e o s id e s
成分
(
e o n s t i t u e n rs )
线性范围
( 1i
n e
ar ar
n g ) / 卜g
线性方程
( 1i
n e ar e q u a ti o n )
龙胆苦背
( g
e n [ i o Pi e or 、 i d e )
落干酸
( l
o g a n ie a e i d )
璋牙菜苦昔
(
s w e rt iam o
n
)
0
.
60 一 19
.
2 0 Y = 6 0 ] 6 x 10 3 X + l肠 . 4 7 0 . 99 99
0
.
24
一 7
.
68 于二 6 . 3 84 只 1 0 3X + 40
.
12 0
.
99 99
0
.
3 8 一 12
.
0 2 Y 二 6
.
0 58 x 10 3X + 5 5
.
73 0
.
99 99
樟牙菜背
(
、 , e m s i d e )
0
.
0 5 一 l
.
66 y = 6
.
5 36 x ] 0 3X + 1 0
.
8 2 0
.
999 9
5 精密度实验
取 “ 2 . 1 ” 项下的混合对照 品溶液 , 在选定 的色
谱条件下进样 ,重复 5 次 ,测得龙胆苦昔 、 落干酸 、璋
牙菜苦昔和璋牙菜昔峰面积的 R s D 分别为 1 . 0% ,
药物分析杂志C h i nJp hm r aA nl a200 6
,
2 6 ( 10 ) 一 1 3 7 5 一
1
.
6 %
,
1
.
9%
,
2
.
2%
。 在 2 4 h 内比较稳定 。
6 重复性实验 8 加样回收率实验
精密称取青海果洛产野生麻花芫样品粉末 5 取已知含量的青海西宁栽培药材适量 ( 0 . 2 9 ) ,
份 , 每份 0 . 2 9 , 按 “ 2 . 2 ” 项下 平行制备供试品溶 加人一定量的对照 品混合溶液 , 按照样品处理方法
液 ,再按 “ 3 ” 项下 色谱条件进样 测定 , 得龙胆苦普 、 操作并进样 or 林L 。 重复上述操作 5 次 , 计算各成
落干酸 、 璋牙菜苦昔 、璋牙菜昔 的平均含量分别为 分的加样回收率 , 得到龙胆苦昔 、 落干酸 、璋牙菜苦
1
.
65 %
,
1
.
48 %
,
0
.
64 %
,
0
.
2 % ;
.
R s D 分 别 为 昔 和 璋牙 菜昔 的 平均 回 收率分 别 为 9 . 73 % ,
1
.
9 %
,
2
.
3%
,
2
.
1%
,
2
.
9%
。
9 8
.
13%
,
9 8
.
4 5%
,
9 6
.
2 2% ; R SD 分 别 为 1 . 3% ,
7 稳定性实验 1 . 8% , 2 . 1% , 2 . 3% 。
取 “ 2 . 2 ” 项下青海西宁栽培供试品溶液 1 份 , 9 样品测定
分别于 0 , 4 , 8 , 12 , 16 , 24 h 依次测定 ,得龙胆苦昔 、 精密吸取供试品溶液 10 林L ,分别进样 5 次 ,用
落干酸 、璋牙菜苦普和璋牙菜昔峰面积 R SD 分别为 外标法计算 4 种苦昔类成分的含量 ,结果见表 2 。
1
.
1%
,
1
.
2%
,
1
.
6%
,
1
.
9 %
。 结果表 明供试品溶液
表 2 野生与栽培麻花芜中苦普类成分的含量 ( % , n = 5)
T a b 2 C o n et n st o f fo u
r
i ir d o i d gl y e o s id e s i n 们 ld a n d e u lt iv a t e d G e n血 n a s t r a m in ae
样品类型
(
s a m p le t y伴 s )
采集地
(
e o ll e e t i n 拜 l o e a t i o n )
苦昔类成分 ( i石d o l d g l y e o s id e s )
野生 ( w i l.」) 四川若而盖 ( R u o ’。 asr i , S i o ll u a n )
青海果洛 ( G u 《 , l u . , , Q i n g h苗 )
青海刚察 ( ( ; a n邵11 a , Qi n g h a , )
平均值 ( : 1 1o a : 1 )
青海西宁 ( X l n i n g , Q i n g h a i )
青海煌中 ( H u an g z l: 、川 g , Qi n `11 a i )
青海廿里铺 ( N i a n l甲比 Qi n g }, a i )
平均值 ( n 、。 a n )
龙胆苦背
( g
e n t , o p , e or s i、 Ie )
10
.
30 5 土 0
. 《H拼
1 1
.
7 2 7 士 0
.
0 12
6
.
5 90 士 0
.
t洲沁
落 于酸
( l
o g al l i e a e id )
1
.
8 26 土 0
.
(X】4
1
.
5 43 土 0
.
0 10
1
.
0 2 3 士 0
.
(洲)3
1
.
4 64 士 0
.
2 35
1
.
3 5 1 土 0
.
(X卫户
0
.
7 14 土 0
.
0 10
1
.
3 92 士 0
_
0 1 1
1
.
1 52 士 0
.
2 1 9
樟牙菜苦什
(
S w e rt l a m a ir n )
0
.
7 82 土 0
.
(叉)礴
0
.
6 63 土 0
. 《减) 5
0
.
4 82 士 0 (洲) 7
0
.
64 2 土 0
.
0 87
0
.
4 56 土 0
.
0 10
0
.
5 95 士 0
.
0 08
0 7 33 士 0
.
{卫 )6
0 5 95 土 0 0 80
瘴牙菜昔
(
s w e or s i d e )
0
.
2 2 1 土 0
. 叩7
0
.
2 38 土 0
.
0 11
0
.
30 1 士 0
, 以抖
总和
( t
o回 )
13
.
13 4
14
.
17 1
8
.
39 6
9
.
54 ] 士 1
.
53 1 0
.
25 3 士 0
.
0 24
栽培 ( e d 一i v a t e d ) 6 . 4 56 土 0 . 0 1 7 0 . 204 士 0 . X() 6 8 . 4 6 7
7
.
109 土 0
.
0 ] 0 0
.
19 9 士 0
.
0() 7 8
.
6 1 7
1 5 3 士 0
.
0 ] 0 0
.
2 34 土 0 朋8 10 . 5 1 2
7
.
239 t o
`
4 94 0
.
2 12 士 0
_
0 1 1
注 : 表中数值取自平均值与标准误差 ( n 二 5)
入o t e : V al u e s 二 “ : , , e a : 15 士 5 . E . M ( n 二 5 )
1 0 结果与分析
对采 自野生与栽培麻花芫种群 中龙胆苦昔 、 落
干酸 、 樟牙菜苦昔与璋牙菜昔 4 种苦昔类成分的含
量进行了分析 。 2 005 年版 中国药典中规定 ,麻花芫
药材中龙胆苦昔 的含量应该 ) 2% 。 实验结果显示 ,
不论是野生种还是栽培品种 , 其龙胆苦昔的含量 已
经达到并超过药典中规定 , 均可 以人药 。 4 种苦昔
类成分中 , 龙胆苦昔的含量远远高于其他 3 种成分 。
这说明 ,麻花芫苦昔类成分中龙胆苦昔的高含量对
开发利用 以龙胆苦昔为主的新药源有一定的启示意
义 。 药典中将其作为秦芫类植物人药的关键指标也
是具有一定科学依据 的 。 本 实验中 , 野生种群 中 4
种苦昔类成分的平均含量基本上都大于栽培种群 ,
其总和野生种群的含量也高于栽培的 。 虽然栽培品
种从龙胆苦昔含量方面而言 已经可以人药 , 但是如
何保持栽培品种与野生 品种在品质方面的稳定性 、
延续性 、 一致性以及有效控制药用植物资源 中有效
活性成分的含量是人工引种栽培实验成功与否的关
键因素之一 [ 9 。 药用植物有效成分的含量不仅与
植物的基因型有关 , 与生态环境也有着密不可分的
联系 〔` “ 」。 因此 ,对于药用植物 (不论野生品种还是
栽培品种 ) 而言 , 有效活性成分与生态环境 以 及其
周围生物因子之间的内在关联值得进一步的探讨 。
本实验采用 H P LC 法首 次同时测定 了野生与栽
培麻花芙根中 4 种苦昔类有效成分 ,精密度高 ,重复
性好 。 并采用 和对照 品中各组分的相对保留时间
( RT )及紫外光谱 ( UV ) 相结合的比较方法确定 了样
品色谱图中各组分的位置 (见图 2 ) ,结果准确 、 可靠 。
实验结果表明 ,栽培与野生麻花芜中 4 种苦昔类成分
分布基本一致 。 因此 ,采用人工引种栽培麻花芫的方
法 ,不仅可以解决野生麻花芫资源量的供给问题 ,也
可为栽培品的广泛应用提供可靠的科学依据 。
一1 3 7 6一 药物分析杂志C hi nJh Pr m aA nl aZ《X) 6, 2 6 ( 10 )
0六Un201
2031
2 0 2团 3 0 3 50 创刃 2印 3叨 3的 2田 2团 3 (幻 3功 入而口
2叨 2 5 0 3阅 3 50 2阅 2 50 3田 3印 2叨 2 5 0 3加 3 50 2戒刀 2 50 3侧 ) 3印 入 /腼
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图 2 对照品 ( A )
r ig 2 U V 印 e c tr a
1
. 落干酸 ( l o g a n i e
、野生样品 ( B ) 、 栽培样品 ( )C 紫外光谱图
o f
r e丘 r e n e e s u b s tan e e s ( A ) , w i ld s a哪 l e ( B ) an d e u l t i v a t e d s a m p l e ( C )
a e i d ) 2
. 璋牙菜苦背 ( s w e rt i a m a ir n ) 3 . 龙胆苦昔 ( g e n t i o p i e ro s i d e ) 4 . 璋牙菜昔 ( s w e r o s id e )
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(本文于 20 05 年 6 月 27 日收到 )