全 文 ：甜杨葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶基因的电子克隆及其功能预测
林元震 1, 2 , 张志毅 2 , 林善枝 2　
(1.华南农业大学林学院 ,广东广州 510642;2.北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室 ,北京 100083)
摘要　 [目的]对甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)进行克隆及功能预测。 [方法]采用电子克隆和 RT-PCR相结合的方法首次从甜
杨中分离了 G6PDH基因 ,通过Blast和其他生物信息学软件进行功能预测。 [结果] 甜杨G6PDH基因的 cDNA长 1 697 bp,可编码 510
个氨基酸 , cDNA序列及其推导的氨基酸序列均与其他植物G6PDH存在着较高的同源性 ,说明所获得的 cDNA是甜杨 G6PDH基因
(PsG6PDH, AY445917)。同时 ,运用 PCR扩增技术获得了甜杨G6PDH基因组序列 ,测序结果表明 ,基因组DNA长度为 5 040bp,含有 15
个外显子和 14个内含子。Southern杂交结果表明 , G6PDH基因在甜杨的基因组中可能是单拷贝或者低拷贝。通过网络服务器平台进
行 PsG6DH的功能预测 ,结果显示 , PsG6PDH为 G6PDH的成员之一 ,含有 NADP结合区和G6P结合区 2个保守功能域 ,具有多个磷酸化
位点和跨膜区域 ,但不含有信号肽 ,表明PsG6DH可能作为膜受体而起作用。另外 , G6PDH的电子表达谱分析结果发现 , G6PDH在多种
组织和不同发育过程均表达 ,并涉及各种逆境胁迫应答反应 ,这也说明了 G6PDH在植物生长反育中的重要地位。 [结论]可为下一步研
究 PsG6PDH基因的分子功能提供参考。
关键词　甜杨;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶;电子克隆
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)29-14054-05
InSilicoCloningandFunctionPredictionofaGlucose-6-phosphateDehydrogenaseGenefromPopulussuaveolens
LINYuan-zhenetal　(ColegeofForestry, SouthChinaAgriculturalUniversity, Guangzhou, Guangdong510642)
Abstract　[ Objection] Insilicocloningandfunctionpredictionofglucose-6-phosphatedehydrogenasegene(G6PDH)wasresearchedinthe
paper.[ Method] TheG6PDHgenewasclonedfromP.suaveolensbyelectronicPCRandRT-PCR, andfunctionpredictionwascarriedoutby
Blastandotherbioinformaticssofts.[ Result] ThefulllengthPsG6PDHwas1 697 bpandencoded510aminoacids.cDNAandaminoacid
sequencesshowedhighidentitywithotherplantG6PDHgenes.P.suaveolens(fragrantpoplar)G6PDHgenomicDNAwasisolatedbyPCR
anditssequencecontained15exonsand14introns.Inaddition, SouthernanalysisrevealedthatPsG6PDHissingleorlowcopiesinthefra-
grantpoplargenome.FunctionpredictionshowedthatPsG6PDHwasanewmemberofplantG6PDHfamily, containingNADP-bindingdomain
andG6P-bindingdomain, withsomephosphorylationsites.Ithadnosignalpeptide, butonetrasmembranedomaininNterminal, indicating
thatPsG6PDHwasactedasareceptorinmembrane.Moreover, electronicexpressionprofilesrevealedthatG6PDHexpressedinwholeplants
andvarieddevelopmentstage, andinvolvedindiferentabioticstresses, suggestingthatG6PDHplayedanimportantroleinthegrowthandde-
velopmentofplants.[ Conclusion] ThereportprovidedimportantinformationforthefurthermolecularfunctionresearchofPsG6PDH.
Keywords　Populussuaveolens;Glucose-6-phosphatedehydrogenase;Insilicocloning
基金项目　国家自然科学基金项目资助课题(30271093, 30771759)。
作者简介　林元震(1979 -),男 ,福建仙游人 ,博士 ,讲师 ,从事林木抗
逆分子遗传与生物信息学研究。
收稿日期　2009-06-03
　　电子克隆(insilicocloning)是近年来伴随着基因组计划
和 EST计划而发展起来的基因克隆新方法 [ 1] ,主要原理是利
用日益发展的生物信息学技术 ,借助电子计算机的巨大运算
能力 ,通过 EST或基因组的序列组装和拼接 ,进一步利用
RT-PCR的方法快速克隆功能基因 。近年来 ,已有很多学者
利用电子克隆的方法相继克隆了人和鱼的功能基因 ILF2、水
稻 G6PDH基因 、老鼠 Muc5ac基因 、稻瘟菌Ⅰ型烯醇化酶基
因 [ 1 -3] 。由于受到序列资料的限制 ,植物领域的基因克隆仍
以常规的试验方法为主 。 2003年底杨树基因组序列资料的
公布以及丰富的杨树 EST数据库 ,使得利用生物信息学技术
进行杨树功能基因的电子克隆已经成为可能 [ 4 -5] 。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键性调控限
速酶 ,主要功能是为脂肪酸合成 、氮还原和谷胱甘肽等生物
分子合成提供 NADPH还原力 ,也为核酸合成提供戊糖 ,此
外 ,还参加非生物逆境胁迫应答反应 ,因此 ,对植物的生长发
育起着非常重要的作用 [ 6 -8] 。笔者的前期研究结果发现 ,低
温胁迫下胞质 G6PDH的活性提高 ,进而增强 OPPP代谢途
径 ,其中间产物 NADPH,可用于激活一些 NADPH依赖的抗
氧化酶的活性 ,促进了许多重要的酶催化反应 ,进而保护了
细胞膜的稳定 ,达到提高植物抗寒冻性的作用 [ 9] 。但关于
G6PDH活性与植物抗寒冻性之间关系的分子机理尚未清
楚 ,在分子水平上 ,低温胁迫下 G6PDH怎样被激活 , G6PDH
互作信号是什么 , G6PDH如何发挥代谢调控作用 ,进而提高
植物抗寒冻性。要解答这些问题 ,首先得分离出甜杨
G6PDH的基因 。
笔者采用电子克隆的方法 ,以拟南芥胞质 G6PDHcDNA
为信息探针 ,从 GenBank的杨树核酸库中找到与之高度同源
的杨树 EST序列 ,通过人工序列拼接得到杨树 G6PDH的全
长 cDNA序列 ,结合毛果杨基因组和杨树 EST序列信息 ,进
一步采用 RT-PCR的方法克隆了甜杨 G6PDH基因。在此基
础上 ,还分离了甜杨 G6PDH基因组 DNA和进行 Southern杂
交分析了甜杨 G6PDH基因的拷贝数 ,并采用生物信息学方
法预测了甜杨 G6PDH基因的功能 ,为下一步研究其功能奠
定基础。
1　材料与方法
1.1　材料　采取北京林业大学苗圃的多年生甜杨(P.
suaveolens)幼苗的嫩枝条作为外植体 ,消毒后接种到启动培
养基(改良 MS+BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L)上 ,培养温
度(25±2)℃,光照 16 h/d,光照强度 2 200 lx。等启动培养
基的芽萌动并长出 1 ～ 2片小叶 ,这时将芽转接到增殖培养
基(改良 MS+BA0.3 mg/L+NAA0.1 mg/L+GA0.1
mg/L)快繁 ,然后接到生根培养基(1/4改良 MS+IBA0.1
mg/L+NAA0.1 mg/L)上进行生根 [ 10] 。生根无菌苗作为提
取 RNA的试材。
1.2　方法
1.2.1　甜杨总 RNA的提取 。取 3 g甜杨组培苗 , 4 ℃处理
责任编辑　罗芸　责任校对　况玲玲安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(29):14054-14058, 14097
24 h后 ,加 10%PVPP,用液氮研磨成细末 ,加入 15 ml65 ℃
预热的 CTAB提取液 [ 2% CTAB, 3% PVP- 40, 25 mmol/L
EDTA, 2 mol/LNaCl, 100 mmol/LTris-HCl(pH8.0), 3%
β-巯基乙醇 ] ,振荡 1min, 65 ℃继续水浴 5min。向上述混合
液中加入等体积氯仿抽提 2次 ,每次振荡 10 min, 18 ℃
12 000×g离心 20min。取上相 ,加 1/3体积 8 mol/LLiCl,混
匀 , 4 ℃沉淀过夜。 12 000×g4 ℃离心 20 min,用 800 μl
0.5% SDS溶解沉淀 ,加等体积的氯仿抽提 2次。取上清 ,加
2倍体积 -20℃预冷的 100%乙醇 , -20 ℃放置 2 h。 12 000
×g4 ℃离心 20min, 70%漂洗沉淀 2 ～ 3次后 ,晾干沉淀 ,用
适量 DEPC处理后的无菌水溶解(改良 CTAB法)[ 11] 。
1.2.2　杨树葡萄糖 -6-磷酸脱氢酶全长基因的电子克隆。
从 TAIR数据库(htp://www.arabidopsis.org/)获得拟南芥
G6PDH基因的全长 cDNA序列为信息探针 ,运用 Blastn2.0
程序搜索杨树 ESTs数据库 PopolusDB(htp://mycor.nancy.
inra.fr/poplardb/),选择相似性得分最高的 EST序列 ,将此
EST序列作为原始种子序列 ,再运行 Blastn2.0程序搜索 NC-
BI的 EST-others数据库 (htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
dbEST/index.html),下载所获得的杨树 ESTs序列运用 DNA-
MAN进行装配 ,保存装配后产生的新序列 ,即是假定的杨树
G6PDH基因。以 DNAMAN预测其蛋白编码框 ,验证该基因
是否为全长基因。根据电子克隆到的杨树 G6PDH全长基因
为模板 , Blastn搜索毛果杨基因组匹配序列(htp://genome.
jgi-psf.org/Poptr1/Poptr1.home.html)和 NCBI的杨树 ESTs,
用 ClustalW 1.83多序列比对寻找高度保守区域设计引物 ,
进行甜杨 G6PDH基因的扩增。
1.2.3　甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的全长 cDNA扩增 、
克隆及其鉴定。以甜杨组培苗 4 ℃处理 24h的总 RNA为模
板 ,采用 AccessOne-StepRT-PCR(Promega)试剂盒进行 RT-
PCR。上游引物 PFLt01:5′-GGTTACAGGACCTCTGA-GAAA-
CAA-3′;下游引物 PFLt02:5′-CAGGCTACATTTCTACAATG-
TAGGAGG-3′。扩增程序:第一链 cDNA合成 48 ℃ 45 min;
PCR二次扩增 , 94 ℃预变性 4 min, 94℃变性 30 s、57℃退
火 1 min、68 ℃延伸 2 min, 30次循环 , 68 ℃最后延伸 10
min。获得的 cDNA片段采用 WinzardPCRPrepsDNAPurifi-
cationSystem试剂盒回收 ,然后克隆至 pGEM-TEasy载体。
挑取阳性克隆交由上海基康生物技术有限公司测序 , cDNA
序列用 DNAMAN和 GenBank的 Blast软件进行分析 。
1.2.4　甜杨 G6PDH基因组 DNA的分离和 Southern分析。
根据甜杨 cDNA在毛果杨基因组 Blast结果显示 ,杨树
G6PDH基因组序列大概有 6 kb左右 ,为了便于 PCR、克隆和
测序 ,将甜杨 G6PDH基因组分成两部分(gG1、gG2)进行克
隆 ,这样设计了 2对引物 , gG1的上游引物 PsgG1u:5′-GGT-
TACAGGACCTCTGAGAAACAA-3′, 下 游引 物 PsgG1d:5′-
AAG-TACAAGGCTGAGCTATTTCGA-3′, gG2的上游引物 Ps-
gG2u:5′-AATCAAGAAGTCACAAGCAGTAACC-3′,下游引物
PsgG2d:5′-TTATACATATTCCGAGTGGAGACTG-3′。用 BamH I、
EcoRI、HindII和 XbaI限制性内切酶对甜杨 G6PDH基因
组进行过夜酶切 ,以甜杨 G6PDH基因组序列为目的片段 ,按
Roche提供的试剂盒进行探针制备和杂交检测。
1.2.5　甜杨 G6PDH蛋白序列的系统发育树构建。在进行
NCBI网站初步 Blast后 ,选择与甜杨 G6PDH同源性较高的
其他植物 G6PDH基因从蛋白水平进行 N-J聚类分析 ,对蛋
白序列用 ClustalW 1.83进行多重比对并生成系统发育
树 [ 12] ,图形用 TREEVIEW 3.2生成。
1.2.6　甜杨 G6PDH基因的功能预测。
1.2.6.1　新蛋白 motif、Prosite分析。在 ProfileScan服务器进
行结构位点(Prosite)、膜体(Motif)分析 。
1.2.6.2　新基因的电子表达谱分析。以目的基因序列检索
NCBI数据库 ,获得待分析序列的 UniGene编号后 ,就可通过
参与形成 UniGeneCluster序列的组织 /细胞来源间接地分析
序列在何种组织中表达 。
2　结果与分析
2.1　甜杨 G6PDH基因全长 cDNA的获得　根据上述设计
的引物 PFLt01和 PFLt02,以合成的第一链 cDNA为模板进行
PCR扩增 ,获得一条 1.7 kb左右特异的预期 cDNA片段(图
1),通过克隆 、筛选 、测序 ,对测序结果用 DNAMAN分析 ,表
明目的基因 cDNA长 1 697 bp,具有一个最大完整编码框 ,可
编码 510个氨基酸 ,分子量为 58.4 kD,等电点 pI为 6.17(图
2)。编码的氨基酸序列中 , Leu含量最高 ,达 10.59%, Glu含
量其次(为 8.43%), Gly含量居第三(7.25%),含量最低的
是 Trp和 Cys(都为 1.18%);进一步分析发现 ,非极性(疏
水)氨基酸含量为 39.8%,极性 (亲水)氨基酸含量为
60.2%,极性(亲水)氨基酸含量明显高于非极性的 ,由此可
见 ,所编码的蛋白为亲水性蛋白 ,这与冷调节蛋白(coldregu-
latedproteins, CORPs)的氨基酸组成相似(康国章等 , 2002)。
另外 , PsG6PDH编码的氨基酸序列中含有 6个 Cys,分别位
于第 32、155、160、161、276和 378位氨基酸(图 2),说明
PsG6PDH编码产物中可能含有二硫键 ,这也许对维持其结构
稳定及功能行使具有重要意义。
注:M.DNA标准分子量;1.全长 G6PDH扩增产物。
Note:M, 2 kbDNAladder;1, FullengthcDNAofG6PDHfromP.
suaveolensbyPCR.
图 1　甜杨 G6PDH基因全长cDNA的 PCR电泳检测
Fig.1　PCRelectrophoresisoffullengthcDNAofG6PDHfrom
P.suaveolens
　　Blast结果表明 ,甜杨 cDNA序列与苜蓿(Medicagosati-
va, U18238)、马铃薯(S.tuberosum, DQ252509)、烟草(N.taba-
cum, AJ001769)、石松(Lycopersiconesculentum, BT013545)、石
芹 (Petroselinum crispum, AF012862)、小 麦 (T.aestivum,
AB029454)、水稻(O.sativa, AY078072)、松叶菊(Mesembryan-
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注:G6PDH的起始子和终止子用下划线表示。
Note:ThepromoterandterminatorofG6PDHareunderlined.
图 2　甜杨 PsG6PDH基因的cDNA和编码蛋白序列
Fig.2　 cDNAsequenceanditscodingaminoacidsequenceofPsG6PDHgeneinP.suaveolens
themumcrystalinum, AF097663)和拟 南芥 (A.thaliana,
AJ010971)等植物 G6PDH基因的同源性分别为 82%、82%、
82%、82%、80%、80%、80%、80%和 80%。甜杨 cDNA序列
所编码的氨基酸序列与拟南芥(A.thaliana, AJ010971)、马铃
薯(S.tuberosum, X74421)、烟草(N.tabacum, AJ001769)、松叶
菊(M.crystalinum, AF097663)、石芹(P.crispum, AF012862)、
小麦(T.aestivum, AB029454)和水稻(O.sativa, AY078072)等
同源性分别为 82%、84%、83%、79%、79%、77%和 80%。此
外 ,甜杨 cDNA序列编码的蛋白两端分别有 G6PD N和
G6PD C的保守区域 ,并存在 G6PDH的两个典型结构域 ,分
别为底物结合位点(substrate-bindingsite, IDHYLG)和 NADP
结合位点(NADP-bindingsite, NEFVIRLQP),与已有植物胞
质 G6PDH基因相似 ,而且在 cDNA5′端缺少一段信号肽序列
(为质体 G6PDH所特有),这表明所得到的 cDNA序列可能
是甜杨胞质 G6PDH基因 ,命名为 PsG6PDH,基因登记号为
AY445917。由上可知 , cDNA序列与蛋白序列的 Blast结果
虽然存在一定差异 ,但两者 Blast同源性都高达 80%,说明植
物 G6PDH不管在核酸序列上还是蛋白序列上 ,都是一个比
较保守的基因家族 。
2.2　甜杨 G6PDH基因组 DNA的克隆和 Southern杂交分
析　在获得全长 cDNA后 ,对甜杨 G6PDH基因组 DNA进行
了克隆。根据设计的引物 ,分别获得了 2.9 kb和 2.4 kb的
预期片段(图 3),经克隆 、测序 、分析以及拼接后 ,得到甜杨
G6PDH全长基因组序列 ,为 5 040 bp,命名为 PsgG6PDH。在
SoftBery上对 PsgG6PDH进行基因结构分析 ,结果发现 ,
注:M.DNA标准分子量;1, 2.G6PDHPCR扩增产物。
Note:M, 15kbDNAladder;1and2, G6PDHgenomicDNAfragment
fromP.suaveolensbyPCR.
图 3　甜杨 G6PDH基因组 DNA的PCR扩增
Fig.3　PCR amplificationofG6PDH genomicDNAfrom P.
suaveolens
PsgG6PDH编码区全长为 4 748bp,含有 15个外显子 , 14个内
含子 ,以及 1个 polyA区域。在甜杨基因组 DNA序列中含有
BamHI、HindII、PstI各 3个酶切位点 , 2个 XbaI、EcoRV酶
14056 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
切位点 , SacI、SacI、NcoI位点各 1个(图 4)。另外 ,酶切完
全后的基因组 DNA经转膜 、固定 、杂交 ,结果如图 5B,
BamHI、EcoRI、HindII和 XbaI酶切后的基因组 DNA,均呈
现出 2 ～ 4条不等的杂交信号 ,其中 , HindII酶切泳道的杂
交条带最多 ,并处于 1 ～ 5kb之间 , BamHI和 EcoRI酶切泳
道杂交信号均出现 3条 ,其中信号最强的是 BamHI酶切泳
道 ,大概 5 kb处 ,中间一条比较弱。而 XbaI酶切泳道 ,仅出
现 2条。根据 PsgG6PDH基因的酶切图谱 ,酶切完全后 , Hind
II应产生 4条带 , BamHI、XbaI均为 3条带 , EcoRI可能为
1条带。BamHI和 HindII杂交条带信号与酶切结果相符 ,
而 XbaI和 EcoRI杂交信号与酶切结果不一致。上述杂交
结果表明 , G6PDH基因在甜杨的基因组中可能是单拷贝或
者低拷贝 ,这也与甜杨 G6PDHcDNA和毛果杨基因组 Blast
的结果相符合。
2.3　 PsG6PDH蛋白的系统进化树分析　在 BLASTp分析
的基础上 ,选择与其同源性较高的蛋白质序列(表 1)做 N-J
聚类分析 ,以期对 PsG6PDH蛋白的功能和进化做进一步分
析 。用 ClustalX1.83程序先进行多重序列比对 ,然后用
TreeView生成系统发生树。N-J聚类分析(图 6)表明 ,所建
立的系统进化树分出了 2个大分支 ,一为质体 G6PDH,一为
胞质 G6PDH。其中 Nt2、Nt3、St2、st3、Pc1、At2、At3、Os1、Os2
聚类成 P1形式 G6PDH;Nt1、St1、So、At1、Os3聚类成 P2形式
G6PDH;At4单独为一个质体 G6PDH;Nt4、Nt5、St4、Pc2、Pc3、
Ps、Pt1、Pt2、At5、At6聚类成双子叶胞质 G6PDH;Os4、Os5 、
Os6、Ta1、Ta2聚类成单子叶胞质 G6PDH。从中可以看出 ,该
研究所克隆的 PsG6PDH蛋白属于胞质 G6PDH,而且与毛果
杨假想 G6PDH聚在一起 ,另外 , PsG6PDH蛋白与毛果杨假想
G6PDHPt2、Pt1的同源性分别为 97%、94%,说明杨树的
G6PDH在进化上比较保守 ,且可能具有较高的亲缘关系。
上述结果表明 ,不同的胞质 G6PDH源自同一个祖先 ,但它们
出现的时间不同 ,进而它们的功能也可能不同。
图 4　 PsgG6PDH基因的核酸限制性内切酶图谱
Fig.4　 RestrictionenzymepatternsofPsgG6PDHgene
注:A.甜杨基因组 DNA酶切电泳检测;B.甜杨 G6PDH基因的
Southern杂交。M.15kb+2 kbDNAladder;1, 2, 3, 4.P.suave-
olensgenomicDNAdigestedbyBamH I, EcoRI, HindIIand
XbaI.
Note:A, RestrictionelectrophoresisdetectionofgenomicDNAinP.
suaveolens;B, SouthernblotingresultsofG6PDHgeneinP.
suaveolens.M:15kb+2 kbDNAladder;1, 2, 3, 4:P.suaveolens
genomicDNAdigestedbyBamHI, EcoRI, HindIIandXbaI.
图 5　甜杨 G6PDH基因的 Southern杂交分析
Fig.5　SouthernblotanalysisofP.suaveolensG6PDHgene
2.4　PsG6PDH蛋白 motif、Prosite分析　在 ProfileScan服
务器进行结构位点(Prosite)、膜体(Motif)分析。结果显示
PsG6PDH中存在 7种结构位点:5个 N-糖基化位点(N-glyco-
sylationsite), 1个依赖 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸化位
点(cAMP-andcGMP-dependentproteinkinasephosphorylation
site), 6个蛋白激酶 C磷酸化位点(ProteinkinaseCphospho-
rylationsite), 6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(CaseinkinaseⅡ
phosphor-rylationsite), 3个 N-十四酰化位点(N-myristoylation
site), 1个细胞附着序列(Celatachmentsequence), 1个葡萄
糖 -6-磷酸活性位点(Glucose-6-phosphatedehydrogenaseactive
site)。由上可知 ,蛋白激酶磷酸化位点最多 ,总共有 13个 ,
蛋白激酶磷酸化位点的存在 ,表明 PsG6PDH行使功能前可
能需要磷酸化活化。
2.5　 PsG6PDH基因的电子表达谱　利用 UniGene数据库
进行电子表达谱和染色体定位分析。选择 NCBI的 Blastn程
序 ,用 PsG6PDH检索 UniGene,通过 UniGene进行 G6PDH的
表达分析 ,结果显示 , G6PDH在所能检索到的植物中 ,如拟
南芥(A.thaliana)、玉米(Zeamays)、水稻(O.sativa)、小麦
(T.aestivum)、马铃薯(S.tuberosum)和石芹(L.esculentum),
几乎都是整株表达 ,在根 、叶 、茎 、花 、种子(萌发 ,休眠)以及
愈伤组织等多种组织和细胞中表达 ,而且在不同的发育时期
以及在各种逆境胁迫(盐 、低温 、干旱 、病原侵染 、水分胁迫 ,
紫外线照射等)下也表达。另外 ,还检索到一个杨树(Populus
tremula× P.tremuloides)EST的 UniGenePtp.2628,发现
G6PDH也涉及杨树的木材形成过程。上述结果充分说明了
G6PDH对植物的生长反应具有非常重要的作用 。
3　结论与讨论
戊糖磷酸途径是植物中重要的代谢途径 , G6PDH是其
关键性调控限速酶 ,在植物的生长发育中起着非常重要的作
用 ,不仅为生物合成提供还原力 NADPH,为核酸的合成提供
五碳糖 ,还涉及到多种环境胁迫引起的植物应答反应 ,如与
一些金属离子(如 Al3+)的胁迫 [ 13] 、水分胁迫 [ 14] 、盐胁迫 [ 15] 、
低温胁迫 [ 9] 、病原菌侵染 [ 16]等有关;也有报道指出 , G6PDH
还可以抑制 H2O2诱导的细胞死亡 [ 17] 。植物 G6PDH存在 2
种形式 ,一种存在于胞质中 ,另一种存在于质体的基质中。
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笔者克隆的 PsG6PDH编码的氨基酸序列与植物胞质
G6PDH、烟草质体 G6PDH的氨基酸一致率分别为 80%和
40%左右 ,而且质体 G6PDH氨基酸的 N端显著长于胞质
G6PDH, 编码一个转运肽 (transitpeptide)序列 [ 18] , 但
PsG6PDH编码蛋白序列没有转运肽 ,因此笔者认为 ,该文克
隆的 PsG6PDH编码的 G6PDH为胞质 G6PDH。另外 ,笔者进
行了系统发生树分析 ,发现 PsG6PDH与毛果杨假想 G6PDH
PtGP1和PtGp2聚在一起 ,并隶属于胞质G6PDH家族 ,而且
注:箭头表示 PsG6PDH在系统进化树中的位置。 Mt:Monocotyledon;Dt:Dicotyledon;P:plastidic;Cy:cytosolic。
Note:ThearrowindicatedthePsG6PDHpositioninphylogencytree.Mt:Monocotyledon;Dt:Dicotyledon;P:plastidic;Cy:cytosolic.
图 6　 PsG6PDH蛋白的系统进化树分析
Fig.6　 PhylogeneticanalysisofG6PDHprotein
表 1　用于构建 G6PDH系统发生树的其他蛋白
Table1　 OtherproteinsfromotherconstructingthephylogenetictreeofG6PDH
物种Species 基因 Gene 代码 Code 蛋白类型 Proteintype 物种 Species 基因 Gene 代码 Code 蛋白类型 Proteintype
Arabdopsisthaliana AtG6PD1 At1 P2 O.sativa OsG6PD5 Os5 Cy
A.thaliana AtG6PD2 At2 P1 O.sativa OsG6PD6 Os6 Cy
A.thaliana AtG6PD3 At3 P1 Petroselinumcrispum PsG6PD1 Pc1 P1
A.thaliana AtG6PD4 At4 P P.crispum PsG6PD2 Pc2 Cy
A.thaliana AtG6PD5 At5 Cy P.crispum PsG6PD3 Pc3 Cy
A.thaliana AtG6PD6 At6 Cy Solanumtuberosum StG6PD1 St1 P1
Medicagosativa MsG6PD Ms Cy S.tuberosum StG6PD2 St2 P1
Nicotianatabacum NtG6PD1 Nt1 P2 S.tuberosum StG6PD3 St3 P2
N.tabacum NtG6PD2 Nt2 P1 S.tuberosum StG6PD4 St4 Cy
N.tabacum NtG6PD3 Nt3 P1 Spinaciaoleracea SoG6PD So P2
N.tabacum NtG6PD4 Nt4 Cy Triticumaestivum TaG6PD1 Ta1 Cy
N.tabacum NtG6PD5 Nt5 Cy T.aestivum TaG6PD2 Ta2 Cy
Oryzasativa OsG6PD1 Os1 P1 Populussuaveolens PsG6PD Ps Cy
O.sativa OsG6PD2 Os2 P1 P.trichocarpa PtG6PD1 Pt1 Cy
O.sativa OsG6PD3 Os3 P2 P.trichocarpa PtG6PD2 Pt2 Cy
O.sativa OsG6PD4 Os4 Cy
在氨基酸水平上 ,杨树 G6PDH的同源性非常高 ,在 94%以
上 ,另外 ,与拟南芥 、马铃薯 、水稻 、小麦等植物的胞质 G6PDH
同源性也在 80%以上 ,这说明胞质 G6PDH在植物界里都是
比较保守的 ,可能预示着胞质 G6PDH在植物的生长发育中
起着重要作用。功能预测的结果显示 , PsG6PDH没有信号肽
结构 ,因此它可能不是分泌型蛋白 ,不被分泌到细胞外;但其
蛋白序列含有跨膜区 ,表明它可能作为膜受体起作用 ,也可
能是定位于膜上的锚定蛋白。进一步分析发现 , PsG6PDH具
有多个磷酸化位点 ,并具有 G6PDH家族的结构功能域及
G6PDH蛋白的活性中心。这些证据都表明 , PsG6PDH是植
物 G6PDH蛋白家族的一个新成员 。电子表达谱分析表明 ,
G6PDH在植物中几乎整株表达 ,而且在多种组织和不同发育
过程中均表达 ,并涉及到逆境胁迫应答反应 ,同时 , Southern
杂交结果显示 , PsG6PDH可能是单拷贝或者低拷贝 ,这也充
分表明了 G6PDH在植物生长发育中的重要地位 。上述结果
(下转第 14097页)
14058 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年
表 2　 2008年油菜品种六 020327A和六 020327B(H16-1)的抗逆性表现
Table2　 TheresistanceperformanceofrapevarietiesLiu020327AandLiu020327B(H16-1)in2008 %
材料Materials
抗倒性Lodgingresistance
抗寒性 Coldresistance
受冻率Freezingrate 冻寒指数Freezingindex
病毒病 Virusdisease
发病率Incidencerate 病情指数Diseaseindex
菌核病 Sclerotiniarot
发病率Incidencerate 病情指数Diseaseindex
六 020327A 强 52.50 16.50 0.83 0.21 7.50 4.17
六 020327B 强 57.50 18.80 2.50 0.83 8.60 3.35
皖油 14(CK) 强 60.70 21.10 2.50 1.04 10.70 4.46
2.4　不育系配置组合的杂种优势表现　 2006、2007年用引
进的恢复系和安徽省六安市农业科学研究所选育的恢复系
进行杂交配组 ,六 020327A具有很强的配合力 ,所配组合六
0601、六 0608、六 0703、六 0715性状表现稳定 ,产量水平较高。
2008 ～ 2009年度进行比较试验 ,均比对照皖油 14增产 ,增产
幅度在 6.00%～ 18.20%(表 3)。
表 3　六 020327A所配组合在比较试验中的表现
Table3　 TheperformanceofLiu020327Acombinationsinthecomparisontest
组合Combin-ations
株高cmPlantheight
分枝高度cmBranchheight
一次有效分枝数∥个Thenumberofthefirstefectivebranches
单株有效角果数∥个Efectivesiliquenumberperplant
每角粒数∥个Grainnumberpersilique
千粒重∥g
1 000-grainweight
产量kg/hm2Yield
比CK增产∥%IncreasedyieldthanCK
六 0601 168.30 45.80 9.60 487.30 21.50 3.79 2 941.50 6.10
六 0608 174.80 56.20 10.10 497.50 21.20 4.01 3 019.50 8.90
六 0703 165.20 35.60 10.60 507.30 20.00 4.29 3 277.50 18.20
六 0715 170.80 54.30 9.20 468.20 19.50 3.95 2 938.50 6.00
皖油 14(CK) 164.20 41.50 10.00 473.80 18.20 3.69 2 772.00 -
3　讨论
在众多胞质雄性不育系的研究报道中 ,一致认为微粉是
胞质雄性不育类型中存在的普遍现象 ,多受环境因子的影响
较大。不育系六 020327A为细胞质雄性不育类型 ,虽败育程
度高 ,但在初花期遇较强低温 ,个别花序仍有少量微粉现象 ,
影响制度纯度 ,需进一步研究不育株的育性转化温度和适宜
制度环境 。对其雄性不育性的遗传控制原理以及微粉在单
株间存在差异的原因 ,也还需要进一步的研究探讨。
参考文献
[ 1] 傅廷栋.油菜杂种优势研究利用的现状与思考[ J] .中国油料作物学报 ,
2008(30):1-5.
[ 2] 董振生,刘绚霞 ,董军刚 ,等.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系 212A的选
育与研究[ J].中国油料作物学报, 2003, 25(4):31-34.
[ 3] 傅廷栋.杂交油菜的育种与利用 [ M].武汉:湖北科学技术出版社 ,
1995.
(上接第 14058页)
可为下一步研究 PsG6PDH基因的分子功能提供参考。
参考文献
[ 1] GILLRW, SANSEAUP.Rapidinsilicocloningofgenesusingexpressed
sequencetags(ESTs)[J].BiotechnolAnnuRev, 2000, 5:25-44.
[ 2] OBRIENKP,TAPIA-PAEZL, STAHLE-BACKDAHLM, etal.Character-
izationoffivenovelhumangenesinlq13-q22region[J].BiochemBiophys
ResCommun, 2000, 273:90-94.
[ 3] 黄骥,王建飞,张红生 ,等.水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA的电子克隆 [ J].遗传学报 , 2002, 29(11):1012-1016.
[ 4] 林元震.甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因克隆及结构分析与功能鉴定
[ D].北京:北京林业大学 , 2006:44 -66.
[ 5] 林元震 ,张志毅 ,林善枝 ,等.运用基因组和EST数据库进行电子克隆
分离杨树功能基因的策略 [ J].分子植物育种, 2007, 5(4):583-587.
[ 6] COPELANDL,TURNERJF.Theregulationofglycolysisandthepentose-
phosphatepathway[M] //STUMPTPK, CONNEE.Thebiochemistryof
plants,Volume11.NewYork:AcademicPress, 1987:107-125.
[ 7] GRAEVEK, VONSCHAEWENA,SCHEIBER.Purification,characteriza-
tionandcDNAsequenceofglucose-6-phosphatedehydrogenasefrompotato(SolanumtuberosumL.)[J].PlantJ, 1994, 5:353-361.
[ 8] DENNISDT, HUANGY, NEGMFB.Glycolysis, thepentosephosphate
pathwayandanaerobicrespiration[M] //DENNISDT.Plantmetabolism.
Harlow:Longman, 1997:105-123.
[ 9] LINSZ, ZHANGZY, LIUWF, etal.Roleofglucose-6-phosphatedehy-
drogenaseinfreezing-inducedfreezingresistanceofPopulussuaveolens
[ J].JPlantPhysiolMolBiol, 2005, 31(1):34-40.
[ 10] 林元震 ,林善枝 ,张志毅 ,等.甜杨的组织培养和快速繁殖 [ J] .植物生
理学通讯, 2004, 40(4):463.
[ 11] LINYZ, LINSZ, ZHANGZY, etal.Onerapidandeficientmethodfor
isolationoftotalRNAfromshootsregeneratedinvitroofPopulussuaveo-
lens[ J].ForestryStudiesinChina, 2004, 6(1):18-21.
[ 12] THOMPSONJD, GIBSONTJ, PLEWNIAKF, etal.TheCLUSTAL Xwindowsinterface:flexiblestrategiesformultiplesequencealignmentai-
dedbyquality[J].NucleicAcidsRes, 1997, 25(24):4876-4882.
[ 13] SLASKIJJ, ZHANGG, BASUU, etal.Aluminumresistanceinwheat
(TriticumaestivumL.)isassociatedwithrapid, Al-inducedchangesin
activitiesofglucose-6-phosphatedehydrogenaseand6-phosphogluconate
dehydrogenaseinrootapices[J] .PhysiolPlant, 1996, 98:477-484.
[ 14] 彭克勤 ,夏石头 ,李阳生.涝害对早中稻生理特性及产量的影响 [ J].
湖南农业大学学报, 2001, 27(3):173-176.
[ 15] NEMOTOY, SASAKUMAT.Specificexpressionofglucose-6-phosphate
dehydrogenase(G6PDH)genebysaltstressinwheat(TriticumaestivumL.)[J] .PlantSci, 2000, 158(1/2):53-60.
[ 16] LUDEKSM, LENKAB.Changesinactivityofglucose-6-phosphateand
6-phosphogluconatedehydrogenaseisozymesuponpotatovirusYinfection
intobaccoleaftissuesandprotoplasts[J] .PlantPhysiolBiochem, 1999,
37:195-201.
[ 17] TIANW N, BRAUNSTEINLD, APSEK, etal.Importanceofglucose-6-
phosphatedehydrogenaseactivityinceldeath[ J] .AmJPhysiol, 1999,
276:1121-1131.
[ 18] WAKAOS, BENNINGC.Genome-wideanalysisofglucose-6-phosphate
dehydrogenasesinArabidopsis[J].PlantJ, 2005, 41:243-256.
1409737卷 29期　　　　　　　　　　　　　　　　王 斌等　甘蓝型油菜细胞质雄性不育系六 020327A的选育