全 文 ：第 32 卷 第 4 期 农 业 工 程 学 报 Vol.32 No.4
302 2016年 2月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Feb. 2016

小叶女贞果实花青素组分鉴定及色谱纯化技术
王二雷 1，陈晶晶 1，赵叶辉 2，刘静波 1※
（1. 吉林大学食品科学与工程学院营养与功能食品研究室，长春 130062；
2.吉林亚泰生物药业股份有限公司，长春 130031）

摘 要：为提高小叶女贞果实的食用、药用价值，该文系统研究了果实中花青素种类构成及提取物的制备技术。试验采
用紫外可见光谱法、高效液相色谱-质谱串联法、酸水解制备苷元等技术对小叶女贞果实花青素含量、单体种类进行了测
定，并借助提取、萃取、柱层析等技术研究了花青素提取物的分离纯化过程。研究结果如下：测得每 100 g 小叶女贞果
实中含花青素总量为（499±18.42）mg，从中鉴定出 2 种花青素单体，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和牵牛花色素-3-O-
葡萄糖苷，并以后者为主要存在形式；获得了纯天然、简单易行的花青素提取物制备技术，主要包括酸化乙醇提取、乙
酸乙脂萃取、Amberlite XAD-7HP 大孔树脂层析分离步骤，最终制得的花青素提取物纯度为 35%、得率为 0.6%。该研究
为后期制备高纯度牵牛花素-3-O-葡萄糖苷单体提供了良好原料基础，为深入研究小叶女贞果实花青素功能活性及其在食
品、药品领域潜在应用提供了参考。
关键词：提取；萃取；柱层析；小叶女贞；花青素
doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.04.043
中图分类号：TS253.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2016)-04-0302-07
王二雷，陈晶晶，赵叶辉，刘静波. 小叶女贞果实花青素组分鉴定及色谱纯化技术[J]. 农业工程学报，2016，32(4)：
302－308. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.04.043 http://www.tcsae.org
Wang Erlei, Chen Jingjing, Zhao Yehui, Liu Jingbo. Identification of anthocyanins in Ligustrum quihoui Carr and
chromatographic separation techniques[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the
CSAE), 2016, 32(4): 302－308. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2016.04.043 http://www.tcsae.org

0 引 言
小叶女贞（Ligustrum quihoui Carr.）又名小白蜡，为
木犀科（Oleaceae）女贞属（Ligustrum）植物，在中国华
北、华中和西南各省广泛分布，是一种非常重要的园林
绿化植物。长期以来，国内外对小叶女贞植物开展的研
究主要体现在植物资源调查、栽培技术、观赏价值、抗
大气污染[1]等方面，对小叶女贞植物化学成分、保健作用、
药用价值方面尚未有系统、完整的研究报道。
近些年来，国内已有相关研究表明小叶女贞的果实、
叶片、花、皮中含有大量的三萜类化合物、裂环烯醚萜
类、黄酮类、多糖类、氨基酸类、苯乙醇苷类化合物，
并发现小叶女贞具有多种生理活性，如清热解毒、止血、
抑菌、提高机体免疫力、抗氧化、清除自由基；治疗肝
炎、止咳平喘等多种功效[2]。李晓蒙等[3]采用柱层析、波
谱分析等手段从小叶女贞枝叶中分离并鉴定出 4 种化合
物：β-谷甾醇、齐墩果酸、熊果酸及苷露醇。倪建成等[4]
对小叶女贞叶片提取物进行了药用活性研究，证实叶片

收稿日期：2015-09-23 修订日期：2015-12-29
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31271907）
作者简介：王二雷，男，实验师，研究方向为营养与功能食品。长春 吉林
大学食品科学与工程学院营养与功能食品研究室，130062。
Email：wel@jlu.edu.cn
※通信作者：刘静波，女，教授，博士生导师．研究方向为营养与功能食品。
长春 吉林大学食品科学与工程学院营养与功能食品研究室，130062。
Email：ljb168@sohu.com
提取物具有抗菌、抗肿瘤及抗氧化作用。宋致远等[5]利用
萃取、柱层析等手段从小叶女贞果实中分离出 30 个化合
物，并采用高分辨液质、气质联用仪、核磁共振等手段
鉴定出其中的 22 个化合物，包括长链酯类、单糖类、苯
乙醇苷类、甾醇类、三萜类、黄酮类等化合物。邱世翠
等[6]从免疫学方面研究了小叶女贞果实对小鼠骨髓细胞
增殖影响和对白细胞介素 1L-1 的分泌程度，研究结果表
明，小叶女贞可促进小鼠骨髓细胞的增殖和 1L-1 的分泌。
除以上针对小叶女贞化学成分及功能活性方面的报道之
外，国内外未见更多关于小叶女贞的相关研究文献。考
虑到现阶段对小叶女贞植物中化学成分的研究并不充
分，还有待于进行系统研究，探明更多未知化学成分，
并研究其构效、量效关系。
小叶女贞和女贞子属同科同属，传统上女贞子常被
用于治疗肝肾阴虚、目暗不明、视力减退等疾病。《本
草纲目》中也提到女贞子能“强阴，健腰膝，明目”。
受女贞子药理作用的启示，笔者推测小叶女贞果实也具
有明目作用等相似功能活性。由于已有众多研究报道[7-8]
表明，植物果实中花青素类物质具有较好明目作用，因
此，笔者初步判断小叶女贞果实中含有丰富的花青素类
物质。由于迄今为止国内外尚未有对小叶女贞果实中花
青素的相关研究报道，探明小叶女贞果实中花青素含量、
单体种类构成等将具有很大的研究空间。该文拟利用紫
外-可见光谱法、高效液相色谱－质谱串联法对小叶女贞
果实中花青素的含量、单体种类进行鉴定，采用组合提
第 4 期 王二雷等：小叶女贞果实花青素组分鉴定及色谱纯化技术

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取技术、萃取技术、柱色谱技术对花青素纯化工艺进行
研究，希望通过本研究，能够推动更多学者对小叶女贞
果实的研究兴趣，深入探索其潜在的食用或药用价值，
促进小叶女贞果实的综合开发利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验原料：于 2013 年 11 月在吉林大学校园采摘成
熟小叶女贞果实，在−20 ℃环境中冻存，备用。野生蓝
莓果实对照采自于吉林省二道白河镇，采收季节 8～9 月，
果实采摘后，立即于−20 ℃冷冻保藏备用。
标 准 品 ： 矢 车 菊 素 -3-O- 葡 萄 糖 苷 氯 化 物
（Cyanidin-3-O-glucoside chloride，分子量 484.84 Da，纯
度>98%）：美国 Sigma-Aldrich 公司。
无水甲醇、无水乙醇、浓盐酸、氯化钾、乙酸钠均
为分析纯试剂，均由沈阳东兴化工厂生产。Amberlite
XAD-7HP 大孔树脂（粒径范围：20～60 目）购于美国
Sigma-Aldrich 公司。试验过程中配制试剂用水均为去离
子水。高效液相色谱试验中：流动相用水为超纯水，色
谱级甲醇购于德国 Merk 公司。
1.2 仪器与设备
UV-2550 紫外可见光分光光度计：日本岛津公司。
RE-501 旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司。
CXG-1 电脑恒温层析柜（配备 HL-2 型恒流泵，BS-16A
自动部分收集器等设备），上海青浦沪西仪器厂。
FD-1A-50 真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公
司。LC-1020A 高效液相色谱仪（high-performance liquid
chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）：日本岛
津公司，色谱柱:岛津 Shimpack VP-ODS（4.6 mm× 250 mm，
5 μm）。高效液相色谱-串联质谱仪（high-performance liquid
chromatography-diode array detector-electrospray ionization-
tandem mass spectrometry, HPLC-DAD-ESI-MS/MS）由
Waters 2695-996 高效液相色谱仪（美国 Waters 公司）及
LCQ 离子阱质谱仪（美国 Finnigan 公司）构成。
1.3 试验方法
1.3.1 小叶女贞果实花青素的组合纯化方法
小叶女贞果实中花青素的纯化步骤主要包括：提
取、萃取、层析等步骤，通过一系列的纯化方法，使花
青素粗提物的纯度满足不同应用的需求，纯化工艺流程
见图 1。

图 1 小叶女贞果实中花青素的纯化工艺流程
Fig.1 Purification process of anthocyanins in Ligustrum quihoui Carr

1）小叶女贞果实中花青素提取方法：传统的从植物
中提取花青素的方法常用到甲醇、丙酮、三氟乙酸等试
剂[9]，考虑到小叶女贞果实花青素的后期应用主要在食
品、药品领域，对花青素的安全性要求比较高，所用的
有机溶剂要求安全无毒，且能较好地促进花青素类物质
溶出。基于前期试验基础[10]，首先配制 1 L 提取剂，提取
剂构成为体积分数70 %的乙醇与0.1 mol/L的盐酸按体积
比 9∶1 混合。称取 100 g 冻果，解冻前用研钵捣碎后，
加入提取剂 0.5 L，搅拌 30 min 后，在室温条件下闭光反
应 4 h 后，取出过滤，将滤液倒入锥形瓶中，将滤渣再用
0.5 L 提取剂进行提取，重复第一次的提取过程，4 h 后，
将 2 次提取液过滤，合并 2 次提取液，闭光保存，备用。
将提取液在旋转蒸发仪上浓缩，温度不超过 50 ℃，使终
体积控制在 200 mL 左右，冷却后，闭光保存备用。
2）小叶女贞果实中花青素的萃取方法：小叶女贞果
实中含有大量非花青素的黄酮类、挥发油性物质[5]，这些
物质易溶于脂溶性溶剂，但在水中溶解度不高，基于已
有花青素萃取技术报道[11]，试验采用乙酸乙脂对花青素
粗提液进行了萃取分离。将浓缩后的小叶女贞果实花青
素粗提液（约 200 mL），注入分液漏斗，再缓缓倒入等
体积的乙酸乙脂，摇匀，于室温 25 ℃下静置 4 h，收集
下方水层部分，而乙酸乙脂层则从上方出口倒出；将水
层部分取出后与等体积的乙酸乙脂混合后再次进行萃
取，共萃取 3 次，以充分除去非花青素类杂质，收集下
方水层部分，最后制得小叶女贞果实花青素萃取液。
3）小叶女贞果实花青素的层析纯化方法：经过萃取
后的花青素粗提液中虽然已经除去了大量脂溶性成分，
但还含有一定量水溶性的还原糖类、蛋白类及其他黄酮
类等物质[12]，利用常规的过滤、离心、萃取步骤均无法
除去此类物质，而这部分物质会干扰花青素的纯度，因
此采用 Amberlite XAD-7HP 大孔树脂柱（2.6 cm×50 cm）
进行除杂。将新树脂装柱后，首先进行预处理操作，先
用 500 mL 的体积分数为 95%的乙醇以 1 mL/ min 的速度
过柱，再用去离子水以 1 mL/ min 的流速淋洗至流出液无
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混浊或无明显乙醇气味为止，树脂表面保持 10 mL 液体，
将 50 mL 小叶女贞果实花青素萃取液上柱，先用 1 L 去
离子水（含体积分数为 0.01% HCl）以 1 mL/ min 的流速
进行洗脱，除去大部分的还原糖类及蛋白类杂质，再用
600 mL 体积分数为 40%的乙醇（含体积分数为 0.01%
HCl,）以 1.5 mL/ min 的流速进行洗脱，采用自动部分收
集器收集花青素洗脱液，每 10 mL 收集一管，利用紫外
可见光谱法（Ultraviolet–visible spectroscopy，UV-vis）在
530 nm 检测花青素类物质吸光度值，根据吸光度变化曲
线来判断花青素类物质的出峰时间。花青素洗脱液收集
完全后，采用体积分数为 80%乙醇洗脱层析柱上残留部
分，再用去离子水（含体积分数为 0.01% HCl）以 1 mL/min
流速淋洗至流出液无混浊或无明显乙醇气味为止，再次
上样，重复层析纯化花青素的步骤，直到将花青素萃取
液全部过柱分离。将收集到的花青素洗脱液合并，进行
旋转蒸发浓缩（温度不超过 50 ℃），得到花青素浓缩液，
经真空冷冻干燥（温度：−45～−50 ℃，真空度：10～40 Pa）
制得小叶女贞果实花青素提取物。
1.3.2 小叶女贞果实及提取物中花青素检测方法
1）花青素的 UV-vis 光谱鉴定方法：首先利用 UV-vis
光谱法对小叶女贞果实中花青素进行初步定性分析[13]。
取 0.2 mL 小叶女贞果实花青素提取液，用体积分数为 2%
的盐酸甲醇溶液定容到 5 mL，利用紫外-可见光分光度计
在 200～700 nm 之间分别对小叶女贞果实样品及花青素
标准品溶液进行光谱扫描，根据光谱扫描结果初步判断
花青素类物质的存在与否，空白为 2%的盐酸甲醇溶液。
2）花青素质量分数或纯度测定方法：小叶女贞果实
或提取物中花青素的质量分数测定采用 pH 值差示法
[14-15]。分别量取 5 mL 的花青素样品液，用 0.025 mol/L
的氯化钾缓冲溶液（pH 值=1.0）和 0.4 mol/L 的乙酸钠缓
冲溶液（pH 值=4.5）稀释到 50 mL，在暗处反应 20 min
后，用紫外-可见光分光光度计分别在 510 及 700 nm 下检
测其吸光度值，根据如下公式[16]计算出样品中花青素的
质量分数或纯度。
A=(A510–A700)pH1.0–(A510–A700)pH 4.5， （1）
C(g/L)=A·MW·DF/(ε·l)， （2）
花青素质量分数(mg/(100 g))=C·1 000·V·100/M， （3）
花青素纯度（%）=花青素质量分数/1 000。 （4）
式中：A 为吸光度值；C 为花青素质量浓度，g/L；MW
为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷分子量，449.2 g/mol；DF 为稀
释因子，此处为 10；ε 为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷摩尔消
光系数，26 900 L/(mol·cm)；l 为光程，1 cm；V 为花青素
样品液总体积，L；M 为样品初始质量，g。
3）花青素单体种类鉴定方法：反相高效液相色谱法
（reversed phase high-performance liquid chromatography，
RP-HPLC）测定小叶女贞果实中花青素单体结构要比纸
层析法、薄层层析法测得的数据可信度更高、重现性更
好。量取 500 μL 花青素粗提液或苷元水解液，分别用体
积分数为 3%的甲酸稀释 5 倍，再用 0.45 μm 的微孔滤膜
进行过滤，从中取 500 μL 置于 1.5 mL 进样瓶中，得到花
青素检测液，进样体积 10 μL/次。所采用的色谱条件[10]
如下：流动相 A 为色谱级甲醇，流动相 B 为 3%甲酸水
溶液。梯度洗脱程序：B：85%，0～5 min；80%，>5～
10 min；75%，>10～25 min；75%，>25～30 min；30%，
>30～46 min；30%，>46～52 min；85%，>52～65 min，
流速 0.5 mL/min；波长：530 nm；柱温：25℃；时间：
65 min。
采用高效液相色谱－质谱联用技术（HPLC-DAD-
ESI-MS/MS）能够对小叶女贞果实中花青素单体的质荷
比（m/z）进行检测，通过分析一级质谱离子峰（MS1）
和二级离子峰（MS2）来分析花青素的化学结构。运用全
扫描模式寻找花青素的特征离子，并通过母离子、子离
子扫描来获得更多的花青素的结构信息。所用的液相条
件同上，质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源（ESI）；
扫描模式：正离子模式；检测扫描范围 m/z 200～1 000；
毛细管温度 250 ℃；喷雾电压 4.5 kV；壳气流速 18 L/min；
辅助气流速 3 L/min；雾化器压力 206.9 kPa。
4）花青素苷元单体种类鉴定方法：将花青素糖苷水
解成苷元形式，通过比较苷元在高效液相色谱上的保留
时间能快速鉴定出小叶女贞果实中花青素苷元的种类构
成。采用酸水解法制备花青素苷元的过程如下[17-18]：量
取小叶女贞果实花青素提取液 10 mL，与 50 mL 2.5 mol/L
的盐酸混合，放于 150 mL 三角瓶中，顶部用保鲜膜密封，
100℃水浴下反应 60 min，取出迅速冷却，闭光备用。用
0.45 μm 的微孔滤膜进行过滤，得到小叶女贞果实花青素
苷元溶液，再用体积分数为 3%的甲酸进行稀释，得到花
青素检测液，利用 RP-HPLC-DAD 对花青素苷元的种类
进行鉴定。由于蓝莓花青素苷元水解液中含有 5 种基本
的苷元[10,19]，分别为飞燕草素（De）、矢车菊素（Cy）、
牵牛花色素（Pt）、芍药色素（Pn）和锦葵色素（Mv），
因此试验采用蓝莓花青素苷元水解液作为对照品。
1.4 数据统计分析
所有数据均采用 SPSS 19.0 软件进行统计分析，数据
为平行测定 3 次取平均值，表示为：平均值±标准差形式。
2 结果与分析
2.1 小叶女贞果实中花青素提取工艺结果
分别采用 UV-vis 光谱法、RP-HPLC、HPLC-DAD-
ESI-MS/MS 及酸水解等技术对小叶女贞果实花青素粗提
液中的花青素含量、单体种类构成、苷元种类构成进行
了分析与鉴定。
2.1.1 花青素粗提液的 UV-vis 光谱检测结果
利用 UV-vis 光谱法对纯化前的小叶女贞果实花青素
粗提液进行光谱扫描的结果见图 2，其中图 2a 为矢车菊
素-3-O-葡萄糖苷标准品的光谱扫描结果，图 2b 为小叶女
贞果实花青素粗提液的光谱扫描结果。样品粗提液中的
花青素与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品的光谱曲线相
比，在紫外区 280 nm 及可见光区 520 nm 左右均有最大
吸收波长，由于花青素类物质在 280 及 520 nm 附近均有
较强吸收峰[20]，由此可推断出小叶女贞果实中存在一定
第 4 期 王二雷等：小叶女贞果实花青素组分鉴定及色谱纯化技术

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量的花青素类物质。但标准品与样品相比，标准品在
280 nm 的吸收峰比其在 520 nm 处要弱很多，而样品在
280 nm 处的吸收峰明显强于其在 520 nm 处的吸收峰，
可初步推断样品中的部分杂质在 280 nm 处也存在一定
吸收值。由于非花青素的黄酮类或蛋白类物质在
280 nm 处也存在较强的吸收峰[21]，初步推断小叶女贞
果实中还含有大量的其他黄酮类或蛋白类物质，此部分
的结果还有待于利用 HPLC 或 HPLC-DAD-ESI-MS/MS
手段进行鉴定。

图 2 花青素标准品与小叶女贞果实中花青素光谱比较结果
Fig.2 Comparison of UV-vis spectrum between anthocyanin
standard and Ligustrum quihoui Carr. samples

2.1.2 花青素粗提液中总花青素含量测定结果
首先利用 pH 值差示法对小叶女贞果实花青素粗提
液的浓度进行检测，并折合成每 100 g 鲜果所含花青素的
量，通过计算，得出小叶女贞果实中花青素质量分数为
499±18.42 mg/(100 g)。通常认为蓝莓果实中花青素质量
分数比较高[22]，约在 100～400 mg/(100 g)，相比之下，
小叶女贞果实中的花青素含量要高于大部分蓝莓品种中
花青素的含量，从而为后期利用小叶女贞果实制备高纯
度花青素提取物提供了良好原料来源，也为深入研究小
叶女贞果实花青素特有功能活性提供参考。
2.1.3 花青素粗提液中单体鉴定结果
采用RP-HPLC对小叶女贞果实中花青素粗提液单体
峰进行分析的结果见图 3，小叶女贞果实样品（图 3a）中花
青素色谱峰有 2 个，保留时间分别为 20.528 和 24.655 min，
花青素标准品（图 3b）的出峰时间为 19.936 min。通过
对比保留时间，二者在时出峰时间上较为接近，可推断
出小叶女贞果实中出峰时间在 20.528 min 的单体为矢车
菊素-3-O-葡萄糖苷[23]。此外，保留时间为 24.655 min 的
单体峰，由于和标准品的保留时间差别较大，需进一步
对其结构进行鉴定。为准确鉴定小叶女贞果实中 2 种花
青素的成分，采用 HPLC-DAD-ESI-MS/MS 对花青素质谱
碎片离子进行分析，得出图 3a 中 Rt=20.528 min 的色谱
峰对应质谱图上的 MS(m/z)＝448 和 MS/MS (m/z)＝287，
这与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品的特征峰保持一致；
图 3a 中 Rt=24.655 min 的色谱峰与质谱图（图 4）上的
MS(m/z)＝478.93 和 MS/MS (m/z)＝316.81 相对应，这与
牵牛花素-3-O-葡萄糖苷的特征峰保持一致，可以判定其
为牵牛花素-3-O-葡萄糖苷。

图 3 小叶女贞果实花青素与标准品的 RP-HPLC 色谱图比较结果
Fig.3 Comparison of RP-HPLC chromatogram between Ligustrum quihoui Carr. sample and anthocyanin standard

图 4 液相图 3a 中 Rt=24.655 min 色谱峰的质谱检测结果
Fig.4 Mass spectrum of HPLC chromatogram peak at 24.655 min in Fig.3a

2.1.4 花青素粗提液中苷元种类鉴定结果
为充分鉴定小叶女贞果实中花青素的单体结构，可将
花青素的糖苷形式水解成苷元形式。花青素苷元水解液的
RP-HPLC 检测结果如图 5 所示。图 5a 为女贞果实花青素苷
元水解液的色谱图，其主峰的保留时间为 41.453 min，矢车
菊素-3-O-葡萄糖苷的苷元峰未能检测出来，可能由于其浓
度偏低，使其不能达到检测限；图 5b 显示了蓝莓花青素 5
种苷元峰的出峰时间（De: 35.306 min，Cy: 40.198 min，Pt
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41.236 min，Pn: 42.868 min，Mv: 43.166 min）。通过比
较，得出图 5a 中的主峰保留时间与蓝莓果实中牵牛花色
素（Pt）保持一致，则进一步表明小叶女贞果实中的主要
存在的花青素单体为牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷。

注：飞燕草素（De）、矢车菊素(Cy)、牵牛花素(Pt)、芍药色素(Pn)和锦葵色素(Mv)。
Notes: Delphinidin (De), Cyanidin (Cy), Petunidin (Pt), Peonidin (Pn) and Malvidin (Mv).

图 5 小叶女贞果实与蓝莓果实中花青素苷元单体构成 HPLC 图谱比较结果
Fig.5 Comparison of anthocyanin aglycones HPLC chromatogram between Ligustrum quihoui Carr. sample and blueberry sample

本试验采用高效液相色谱法结合酸水解法，从小叶女
贞果实中共鉴定出 2 种花青素单体，分别为矢车菊素-3-O-
葡萄糖苷和牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷。通过比较这 2 种
花青素单体的峰面积比例（图 3a），得出，这 2 种单体
分别占已检出花青素总峰面积的 5.5%和 94.5%。且由二
者峰面积差别可知，牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷在小叶女
贞果实中是大量存在的，是小叶女贞果实中主要的花色
素类物质。另外，由于小叶女贞果实中花青素含量丰富，
且种类较单一，比较适用于后期从其果实中分离纯化牵
牛花色素-3-O-葡萄糖苷的单体物质。
2.2 小叶女贞果实中花青素萃取工艺结果
本试验中采用乙酸乙脂对小叶女贞果实中花青素粗
提液进行了萃取工艺研究[24]，以便去除花青素提取物中
的非花青素的黄酮类或挥发油类等杂质。由于乙酸乙脂
能溶解极性较弱的化合物，小叶女贞果实中花青素以牵
牛花色素-3-O-葡萄糖苷存在形式为主，矢车菊素-3-O-葡
萄糖苷为辅，牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷的极性小于矢车
菊素-3-O-葡萄糖苷的极性，则牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷
在乙酸乙脂中的溶解度会高于矢车菊素-3-O-葡萄糖苷，
因此在开展萃取试验时应注意乙酸乙脂与花青素提取液
比例，还要尽量缩短萃取时间和萃取次数，以便做到既
能最大限度地去除非花青素类的杂质，又不会造成花青
素类物质的损失。
2.3 小叶女贞果实花青素的层析工艺结果
采用自动部分收集器收集 Amberlite XAD-7HP 大孔
树脂纯化后的花青素洗脱液，按 10 mL 收集一管，并通
过 UV-vis 光谱来判断花青素类物质的出峰时间，试验选
择性地收集了 32 管花青素洗脱液，共计 320 mL。将花青
素洗脱液进行低温浓缩，再进行冷冻干燥，制得了小叶
女贞果实花青素提取物干粉，共计 0.6 g。取 5 mg 花青素
提取物，用体积分数为 3%甲酸水溶液定容到 50 mL，从
中吸取 10 mL 花青素样品液，利用 pH 值差示法对其纯度
进行分析，测得小叶女贞果实花青素提取物纯度为 35%，
测得产品得率为 0.6%（即：利用 100 g 小叶女贞果实原
料制得 0.6 g 纯度为 35%的花青素提取物）。由于每 100 g
小叶女贞果实原料中所合花青素质量为（499±18.42）mg，
即纯化前纯度为 0.49%。相比之下，经过提取、萃取、大
孔树脂富集后制得的花青素提取物在纯度上有了近 70 倍
的提高，由此表明了该纯化工艺的有效性，此外，纯度
提高后的花青素提取物较之果实原料，在后期功能活性
评价上更易于发挥作用。
考虑到 Amberlite XAD-7HP 大孔树脂对弱极性化合
物均具有较好吸附性能，由此推断小叶女贞花青素提取
物中尚存在一定量与花青素极性相近的有机酸类、其他
黄酮类杂质，有待于后期采用 Sephadex LH-20 凝胶色谱、
高速逆流色谱、高效液相色谱等技术进一步提高花青素
纯度。
3 应用前景
中国小叶女贞植物分布广泛，目前以绿化应用为主，
其果实产量巨大，但利用率并不高。通过本研究，获得
了从小叶女贞果实中制备花青素提取物的工艺路线，此
工艺的优点主要有：选用原料的来源丰富、选用试剂均
安全环保、工艺步骤简单易行、反应条件温和、工艺成
本低、较易于实现工业化等。在工业化进程中，工艺成
本主要体现在原料成本及生产成本上，其中原料成本主
要包括：采摘成本、收购成本；生产成本主要包括：有
机溶剂及大孔树脂购买及有机溶剂回收、加热浓缩、冷
冻干燥等能耗成本。本试验制得的花青素提取物纯度为
35%，生产周期约为 7 d/批，产品得率为 0.6%。
鉴于国外一般纯度大于 25%的花青素样品已经大量
应用于医药领域[25]，本试验制备出的纯度为 35%的花青
素提取物在保健食品或药品领域有着更大的应用空间。
此外，考虑到小叶女贞果实花青素提取物中花青素种类
较为单一，比较适用于后期深入分离高纯度牵牛花素
-3-O-葡萄糖苷单体，为开发花青素标准品类物质提供了
良好原料基础。
4 结 论
本文对小叶女贞果实中花青素成分进行了定性定量
分析，并对其纯化工艺进行了系统研究，得出以下结论：
1）本文运用紫外可见光谱法证实了小叶女贞果实中
花青素类物质的存在，借助 pH 值差示法测得果实中花青
素质量分数为(499±18.42) mg/(100 g)，结果表明小叶女贞
第 4 期 王二雷等：小叶女贞果实花青素组分鉴定及色谱纯化技术

307
果实中花青素含量丰富，能够为后期工业化生产提供必
备原料基础。
2）采用反相高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质
谱法、酸水解制备苷元等技术从小叶女贞果实中鉴定出 2
种花青素单体，分别为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和牵牛花
色素-3-O-葡萄糖苷，且以后者为主要存在形式。
3）利用纯天然提取、萃取、柱层析工艺等对小叶女
贞果实中花青素提取物进行了分离制备，制得纯度为
35%的花青素提取物，此提取物在食品或药品领域有着极
大应用空间；但尚需深入研究纯化工艺来提高纯度，以
拓展其应用领域及价值。
[参 考 文 献]
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Identification of anthocyanins in Ligustrum quihoui Carr and
chromatographic separation techniques

Wang Erlei1, Chen Jingjing1, Zhao Yehui2, Liu Jingbo1※
(1. Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Food Science and Engineering, Jilin University, Changchun 130062, China;
2. Jilin Yatai Biological Pharmacy Co., Ltd., Changchun 130031, China)

Abstract: As one kind of important hedge materials, Ligustrum quihoui Carr. has been widely used in landscaping. Currently,
a number of researchers are engaged in the identification of the chemical structure for the leaves of Ligustrum quihoui Carr..
However, the chemical ingredients in the fruits have not been well studied up till now, especially the study on the anthocyanins
is rare. In order to promote the application of Ligustrum quihoui Carr. on food and medicine fields, the present research
focuses on the determination of anthocyanin content and monomer composition of Ligustrum quihoui Carr. fruits. The study
adopted the combined techniques of ultraviolet-visible spectroscopy spectrum (UV-vis), reversed phase high-performance
liquid chromatography (RP-HPLC), high-performance liquid chromatography - diode array detector - electrospray ionization -
tandem mass spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS) and acid hydrolysis, as well as the preparation process of anthocyanin
extracts using extraction, concentration, partition, column chromatography and freeze-drying technologies. The UV-vis
spectrum results verified the existence of anthocyanins in the fruit part, and the total anthocyanin content was 499±18.42 mg
per 100 g fresh fruits, which was determined by the pH differential method. Two glycosylated anthocyanin monomers
(cyanidin-3-O-glucoside and petunidin-3-O-glucoside) were successfully identified from the fruits of Ligustrum quihoui Carr.
by means of RP-HPLC, HPLC-DAD-ESI-MS/MS technologies, and then testified through the identification of anthocyanin
aglycones prepared by acid hydrolysis of anthocyanin glycosides. We also found that, petunidin-3-O-glucoside was the
dominating form in the fruits of Ligustrum quihoui Carr., which could become a new focus of our further research. A natural
and simple preparation process of anthocyanin extracts was obtained by the combined chromatographic separation techniques.
A kind of safe and cheap extractant was employed to extract anthcoyanin glycosides instead of the use of harmful methanol,
acetone, trifluoroacetic acid etc., which was composed of 70% ethanol (v/v) and 0.1 mol/L HCl with a mixing proportion of
9:1 (v/v). After the anthocyanin extracts were filtered and concentrated, ethyl acetate was used to remove fat-soluble impurities
from the anthocyanin extracts in the partition process, and the extraction was carried out for 3 times. Because of the existence
of lots of water-soluble impurities (reducing sugars, proteins and polar flavonoids) in anthocyanin extracts, the aqueous
anthocyanin extracts were loaded onto a column (2.6 cm × 50 cm) of cation-exchange resin (Amberlite XAD-7HP, particle
size: 20-60 meshes), washed by deionized water (containing 0.01% HCl, v/v) to remove water-soluble ingredients, and then
eluted by 40% aqueous ethanol (containing 0.01% HCl, v/v) to collect anthocyanin eluents, concentrated and freeze-dried;
finally the extract was obtained with a purity of 35% and a yield of 0.6%. In view of the current purity of anthocyanin extracts,
it was estimated that there were still many impurities mixed with the anthocyanin extracts, which needed a further separation
using gel chromatography, high-speed countercurrent chromatography, preparative-HPLC etc. Because of the simplicity of
anthocyanin profiles and high content of petunidin-3-O-glucoside monomer in Ligustrum quihoui Carr. fruit, it was promising
to separate high-purity petunidin-3-O-glucoside monomer from the anthocyanin extracts using the combined purification
techniques in our next experiments. The present research can promote the comprehensive development of the Ligustrum
quihoui Carr. fruit, and meanwhile lay a foundation for further research on the bio-activity of anthocyanins in Ligustrum
quihoui Carr. fruit and its potential application in food and medicine fields.
Keywords: extraction; partitions; column chromatography; Ligustrum quihoui Carr; anthocyanins