全 文 ：收稿日期:2007-10-25;　修订日期:2008-01-18
作者简介:沈诗军(1980-),男(汉族),重庆垫江人 ,现为四川农业大学动
物基础医学专业在读硕士研究生 ,主要从事动物生理 、药理学研究工作.
＊通讯作者简介:周定刚(1939-), 男(汉族),重庆人 ,现为四川农业大学
动物科技学院教授 ,博士研究生导师 ,学士学位 ,主要从事动物生理学研
究工作.
走马胎提取液体内抗血栓作用研究
沈诗军 , 周定刚＊ , 黎德兵
(四川农业大学动物科技学院 ,四川 雅安　625014)
摘要:目的 观察走马胎提取液对血栓病理模型 SD大鼠体内凝血系统和血液流变学的影响 , 以初探其抗血栓的作用机
制。方法 利用 0.01%AD复制血栓模型 ,测定 SD大鼠的 PT, TT, APTT, RT, Fg, 全血黏度和血液生理指标。结果 与正常
组相比较 , 病理模型组 SD大鼠体内 PT, APTT显著缩短(P<0.05),血浆 Fg含量明显升高(P<0.05),全血低切率(6 r/
min和 12r/min)黏度显著上升(P<0.01或P<0.05);与病理模型组相比较 ,高剂量组 SD大鼠体内PT, TT和 APTT显著
延长(P<0.05), 血浆 Fg含量极显著降低(P<0.01), 高 、中 、低剂量组全血低中切率(6, 12 r/min和 30 r/min)黏度显著
下降(P<0.01, P<0.05)。结论 走马胎提取液能有效地延长血栓模型大鼠体内 PT, TT和 APTT以及降低全血黏度及血
浆 Fg含量 ,影响机体内 、外源性凝血系统从而发挥其抗凝血作用。
关键词:走马胎提取液;　血液流变学;　病理模型;　血栓
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)09-2224-03
StudiesontheAnti-thrombosisEffectsofArdisiagigantifoliaStapfExtractinVivo
SHENShi-jun,ZHOUDing-gang＊ ,LIDe-bing(ColegeofAnimalScience＆Technology, SichuanAgriculturalUniversity, Yaan, Sichuan625014, China)
Abstract:ObjectiveToobservetheeffectsofArdisiagigantifoliaStapfextractonbloodclottingsystemandhemorrheologyand
itsmechanism.MethodsThemodelofthrombuswasinducedby0.01%ADstimulationandPT, TT, APTT, Fg, bloodviscosityand
bloodphysiologic.ResultsComparedwith0.9%NaClcontrolgroup, pathologicalmodelcontrolgroupcouldsignificantlyshorten
PTandAPTT(P<0.05), increasethecontentofFgandbloodlowshearingrate(6 r/minand12r/min)viscosity(P<0.01, P<
0.05);Comparedwithpathologicalmodelcontrolgroup, highdosegroupscouldsignificantlyprolongPT, TTandAPTT(P<
0.05), significantlydecreasethecontentofFgandbloodhighmiddlelowshearingrate(6, 12 r/minand30 r/min)viscosity(P
<0.01, P<0.05).ConclusionArdisiagigantifoliaStapfextractcanprolongPT, TT, andAPTT, andalsodecreasebloodviscosi-
tyandthecontentofFg, furtherlyaffectedintrinsicandextrinsiccoagulationsystemtopreventfromthrombosis.
Keywords:ArdisiagigantifoliaStapfextract;　Hemorrheology;　Pathologicalmodel;　Thrombus
　　走马胎又名大叶紫金牛 [ 1] 、走马风 [ 2] 、豆收 [ 3] , 学名 Ardisia
gigantifoliaStapf, 为紫金牛科紫金牛属植物 ,全株具有活血化淤 、
祛风湿壮筋骨 、止血生肌等功效 [ 4] , 为民间常用的跌打伤科药。
尽管临床上已使用 , 但对该科属植物的研究报道很少 ,目前有关
走马胎的抗血栓药理作用研究国内外尚未见报道。据此 ,本实验
应用小剂量肾上腺素连续多次给药 ,模拟长期疼痛紧张焦虑应激
反应导致机体内血栓形成 [ 5] , 初步探讨走马胎提取液对 SD大鼠
体内血栓形成的影响 。
1　材料与仪器
1.1　药品与试剂 走马胎(产地:四川), 购于德仁堂药业有限公
司;血塞通片(PanaxnotoginsengSaponins, PNS)主要成分三七总
皂苷 , 维和制药有限公司 , 批号:20060523;盐酸肾上腺素(adren-
alin, AD)注射液 , 重庆迪康长江制药有限公司 , 批号:051102;凝
血酶 , 三九集团昆明白马制药有限公司 , 批号:041201;牛纤维蛋
白原(fibrinogen, Fg),中国药品生物制品检定所;白陶土 , 成都博
瑞克生物技术;兔脑粉(凝血活酶)和脑磷脂自制。
1.2　动物 清洁级 SD大鼠 , ♀♂各半 ,体重(260±20)g,购于上
海斯莱克实验动物有限公司。实验动物自由采食 、饮水(自来
水),投喂标准颗粒大鼠饲料。
1.3　仪器 Universal320R冷冻离心机 , Hetich生产;UV-2000
紫外分光光度计 , Unico生产;CA620全自动血细胞分析仪 , Me-
donic生产;NXE-1B型椎板粘度计 , 成都仪器厂生产;电热恒温
水浴箱 , 北京中兴伟业仪器厂生产;旋转蒸发仪 ,巩义市英峪高科
仪器厂生产。
2　方法
2.1　药品制备方法 每次取干燥走马胎 100 g,先用 60%乙醇室
温浸泡 24h后 , 第一次加 10倍量 60%乙醇回流 2.5 h, 第二次 8
倍量 60%乙醇回流 2 h, 合并提取液 , 旋转蒸发浓缩至 10 ml, 置
4 ℃保存备用。临用前用生理盐水配制成不同浓度溶液。
2.2　模型复制及给药 [ 5] 取 SD大鼠 36只 , 随机分为正常 、模
型 、PNS药物对照组 ,同时设走马胎提取液高 、中 、低剂量组(分别
为 10g生药 /kg, 5g生药 /kg, 2.5g生药 /kg;简称高剂量组 、中剂
量组和低剂量组。下同)。除正常组外 , 将其它各组大鼠分别用
0.015%AD, 按 0.08 mg/kg皮下注射 , 1次 /d, 连续 12 d(正常对
照组注射相同体积的生理盐水)复制血栓病理生理模型 。最后 1
天造模 8 h后 ,分别灌胃给药 , 1次 /d, 连续 12 d, 给药容积 1 ml/
100 g,正常和模型组给予等体积的生理盐水。
2.3 　大鼠体内凝血酶原时间(prothrombintime, PT)的测定 [ 6]
分别对各组大鼠进行断头采血 7.2 ml,加入相应盛有 0.109 mol/
L枸橼酸钠溶液 0.8 ml的离心管内混匀 , 取抗凝血 4.5 ml, 以
3 000r/min离心 10 min, 分离乏血小板血浆 ,分装后放入 -70 ℃
备用。取内径 1cm的试管 3支 , 每管加入凝血活酶和血浆各 0.1
ml, 混匀 ,置 37℃水浴中温育 30 s, 然后加入 0.025 mol/LCaCl2
溶液 0.1 ml,混匀后立即开始计时。每隔 2 ～ 3 s倾斜试管 1次 ,
记录试管内出现凝胶状纤维蛋白 , 液面不动所需时间 , 并求出 3
支试管的均值。
2.4 　大鼠体内凝血酶时间(thrombintime, TT)的测定 [ 6] 取内
径 1 cm的试管 3支 , 分别加入乏血小板血浆和 Tris-HCl缓冲
液各 0.1 ml,混匀后置 37℃育温 2 min, 再加入 50 U/ml凝血酶
0.1 ml, 混匀。同时启动秒表 , 记录凝固时间 , 求出 3支试管的
均值。
2.5　大鼠体内活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthrombo-
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.9　
plastintime, APTT)的测定 [ 6] 取内径 1cm试管 3支 ,分别加入乏
血小板血浆和白陶土脑磷脂的混悬液各 0.1 ml,混匀 , 置 37℃水
浴温育 3 min(其间轻轻摇荡数次)。 加入 0.025 mol/LCaCl2溶
液 0.1 ml,立刻启动秒表 , 轻轻倾斜并观察出现纤维蛋白丝的时
间 , 求出 3支试管均值。
2.6　大鼠体内血浆复钙时间(recalcificationtime, RT)的测定 [ 6]
取上述抗凝血 1 ml, 混匀后 , 以 1 000 r/min离心 10 min, 分离富
含血小板血浆 , 放入 -70 ℃备用。取内径 1 cm试管 3支 , 分别
加入血浆和生理盐水各 0.1ml, 置于 37℃水浴中 1min, 加 0.025
mol/LCaCl2溶液 0.1 ml, 混匀 , 同时启动秒表 , 1 min后每隔 5 s
缓慢倾斜试管 1次 , 记录加入钙至纤维蛋白丝出现 , 液体不流动
所需时间 , 求出 3支试管平均值。
2.7　大鼠体内 Fg含量的测定 [ 6]
2.7.1　纤维蛋白制备 取 3支 10 ml的离心管 , 分别标记为 B
管 、S管和 U管 , 然后向 U管加入待测血浆和 12.5%Na2SO3溶液
各 0.5 ml, 混匀后 ,置 37 ℃水浴中 10min后 ,再以 3 000r/min离
心 30min,倒掉上清液。 取沉淀物 , 再加 12.5% Na
2
SO
3
溶液 5
ml, 捣碎沉淀物 , 再次离心 , 倒掉上清液 ,将离心管内沉淀物倒置
在滤纸上吸干。
2.7.2　纤维蛋白含量测定 取上述标记管并向 S管加入 0.05%
Fg标准液 0.05ml, 然后向各管加入生理盐水 1ml和双缩脲试剂
4ml, 充分混匀后 ,置 37℃水浴中 15 min。在波长 540nm下紫外
分光光度计比色 , B管校正零点 , 读取 S管和 U管数值。计算公
式:血浆 Fg含量(g/ml)=U×0.05×10/S。
2.8　大鼠血液黏度指标的测定 取上述抗凝血 1.5 ml, 用 NXE
-1B型椎板黏度计测定在不同切速下的全血比黏度。用液体石
蜡校正仪器 ,检测温度 25 ℃, 所有样品在 3h内检测完。
2.9　大鼠血液生理指标的测定 大鼠断头时取 0.2ml血加入经
肝素处理的采血管中混匀后 , 采用毛细管进样测血常规参数 , 包
括红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血小板计数(PLT)、
红细胞平均体积(MCV)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、
平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度
(MCHC)、血小板平均体积 (MPV)、 RDW%、淋巴细胞比率
(LYM%)、中值细胞比率(MID%)、中性粒细胞比率(GRAN%)、
红细胞分布宽度(RDWa)、血小板分布宽度(PDW)、血小板占全
血血小板数的百分比(LPCR)和血小板压积(PCT)。
2.10　大鼠肾上腺重量 大鼠断头取血后 , 立即采取大鼠两侧肾
上腺(adrenalgland, AG),并称其重量。
2.11　统计方法 数据处理采用 SPSS11.5统计软件 , 多组间比
较采用 One-WayANOVA方差分析 , 两两比较采用 LSD法。 各
组测定值以 x±s方法表示。
3　结果与分析
3.1　走马胎提取液对大鼠体内 PT, TT, APTT, RT和 AG的影响
表 1结果表明 ,与生理盐水对照组相比较 , 病理模型组 SD大鼠
体内 PT, APTT显著缩短(P<0.05);与病理模型组相比较 , PNS
药物对照组和高剂量组 SD大鼠体内 PT, TT和 APTT都极显著
或显著延长(P<0.01或 P<0.05), 中剂量组 SD大鼠体内
APTT显著延长(P<0.05);与 PNS药物对照组相比较 , 低剂量
组 SD大鼠体内 PT, TT, APTT和 RT差异显著(P<0.01或 P<
0.05)。
表 1　走马胎提取液对大鼠体内 PT, TT, APTT, RT和 AG的影响( x±s)
组别 PT/s TT/s APTT/s RT/s AG/mg· 100 g-1
正常 21.06±2.66 19.69±5.57 39.60±4.82 80.55±7.31 13.95±2.59
模型 15.97±2.621) 15.53±3.35 31.49±3.151) 77.25±7.48 18.27±2.29
PNS 24.04±3.474) 22.33±3.273) 47.21±6.094) 84.44±8.67 14.90±3.67
低剂量 18.85±3.655) 14.47±3.315) 30.15±7.771)6) 73.14±3.985) 16.00±4.50
中剂量 20.39±4.71 17.79±6.13 42.77±8.563) 79.83±6.81 16.77±4.08
高剂量 21.00±4.983) 21.89±8.003) 40.36±8.423) 82.11±8.76 16.38±5.07
　　与正常组比较 , 1)P<0.05, 2)P<0.01;与模型组比较 , 3)P<0.05, 4)P<0.01;与 PNS组比较 , 5)P<0.05, 6)P<0.01;n=6
3.2 　走马胎提取液对大鼠全血黏度和血浆 Fg含量的影响 表
2结果表明 ,与生理盐水对照组相比较 ,病理模型组 SD大鼠血浆
Fg含量 、全血低切率(6 r/min和 12 r/min)黏度显著升高(P<
0.01, P<0.05);与病理模型组相比较 , PNS药物对照组和高剂量
组 SD大鼠血浆 Fg含量显著降低(P<0.01或 P<0.05), PNS药
物对照组和高中低剂量组 SD大鼠全血低 、中切率(6 r/min、 12 r/
min和 30r/min)黏度都显著下降(P<0.01或 P<0.05), PNS药
物对照组高切率(60 r/min)黏度显著降低(P<0.05), 其他差异
均不显著。
表 2　走马胎提取液对大鼠全血黏度和血浆 Fg含量的影响( x±s)
组别 6r/min 12r/min 30r/min 60r/min Fg/g· L-1
正常 12.79±6.11 10.40±5.42 8.63±3.03 6.84±1.85 1.51±0.14
模型 21.12±7.942) 13.67±2.571) 9.70±3.40 6.88±2.22 1.68±0.151)
PNS 8.07±4.824) 6.35±2.771)4) 5.29±1.252)4) 4.65±0.791)3) 1.52±0.043)
低剂量 9.38±4.344) 7.96±3.474) 6.86±3.233) 6.22±2.05 1.62±0.15
中剂量 10.23±4.934) 7.31±2.584) 5.95±2.283) 6.05±2.10 1.58±0.18
高剂量 9.55±5.454) 7.50±4.034) 6.07±2.491)4) 6.04±2.10 1.43±0.084)
　　与正常组比较 , 1)P<0.05, 2)P<0.01;与模型组比较 , 3)P<0.05, 4)P<0.01;与 PNS组比较 , 5)P<0.05, 6)P<0.01;n=6
3.3　走马胎提取液对大鼠血液生理指标的影响 表 3结果表
明 , 与生理盐水对照组相比 , 病理模型组 SD大鼠的 RBC, WBC,
PLT, MCV, HGB, HCT, MCH, MCHC, MPV, RDW%, LYM%,
GRAN%, RDWa, LPCR, PCT血液生理指标都有所升高 ,但差异不
显著;与病理模型组相比较 , 低剂量组 SD大鼠 RDWa差异显著
(P<0.05), 其余各组 SD大鼠生理指标有所改善 , 但差异不
显著。
4　讨论
4.1　模拟疼痛紧张应激复制慢性动物血栓模型 血栓形成是一
复杂的过程 , 其发生和发展与凝血系统 、纤溶系统 、血液流变学 、
血管内皮细胞 、血小板聚集性等多种因素密切相关。随着社会竞
争日益激烈 , 与应激有关的血栓性心血管疾病逐渐增多 , 因此治
疗和预防血栓性疾病是一项艰巨而重要的任务。本文通过给大
鼠皮下连续多次注射外源性小剂量肾上腺素 , 使动物机体长期
处于疼痛紧张刺激状态 , 模拟由于长期疼痛紧张应激反应所致机
体内血栓形成。
本实验结果表明 , 与生理盐水对照组相比较 , 病理模型组 SD
大鼠凝血系统中 PT和 APTT都显著缩短 , 全血低切黏度和血浆
Fg含量显著增高。这说明了实验动物长期处于疼痛紧张应激条
件下 ,最终导致止血机制中的凝血因子过度激活 , 血液流变性异
常的一种病理性结局。应激反应会刺激交感神经 , 导致儿茶酚胺
类物质的大量释放 , 血小板容易发生粘附和聚集 , 有发展为血栓
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.9 时珍国医国药 2008年第 19卷第 9期
的可能。此外 , 交感神经长期兴奋 , 以致较高的血压会持续地压
迫血管 , 引起血管壁机械性损伤 , 胶原暴露。当血管呈持续压迫
状态时 ,血管的内侧壁会产生血小板活性因子 ,损伤血管内皮细
胞 ,激活凝血系统。这都为机体血栓形成提供了有利条件。
表 3　走马胎提取液对大鼠血液生理指标的影响( x±s)
组别 RBC/×1012· L-1
WBC
/×109· L-1
PLT
/×109· L-1
MCV
/fL
HGB
/g· L-1
HCT
(%)
MCH
/pg
MCHC
/g· L-1
正常 8.30±0.49 4.82±2.21 80.67±43.65 48.25±2.18 155.17±15.46 43.57±5.95 17.30±1.51 358.83±26.38
模型 8.88±0.76 6.57±2.44 111.20±80.67 50.08±4.52 161.50±16.68 44.42±4.81 18.22±1.79 364.00±16.92
PNS 8.25±0.77 3.87±1.27 76.33±48.77 49.70±2.81 148.17±9.83 40.17±2.48 18.00±1.38 369.17±10.53
低剂量 8.76±0.49 2.55±0.421) 84.83±71.96 46.85±1.86 156.17±12.89 41.05±2.71 17.80±0.91 370.60±11.44
中剂量 8.71±0.64 3.52±1.83 105.00±49.99 48.30±3.17 151.25±10.14 42.00±3.05 17.40±0.80 360.75±11.00
高剂量 8.68±0.64 5.62±3.32 73.67±48.71 48.52±1.82 152.83±13.96 42.13±3.58 17.58±0.92 362.50±6.09
组别 MPV/fL
RDW%
(%)
LYM%
(%)
MID
(%)
GRAN
(%)
RDWa
/fL
PDW
/fL
LPCR
(%)
PCT
(%)
正常 6.37±0.93 23.90±3.51 51.88±6.89 16.35±1.94 38.13±15.01 40.53±5.15 9.93±0.42 12.18±1.82 0.07±0.02
模型 6.70±0.43 24.65±3.46 60.40±21.28 15.04±2.34 42.82±30.64 43.08±8.54 9.42±0.84 13.90±0.95 0.08±0.57PNS 6.92±0.73 24.40±4.31 59.82±17.86 12.70±3.831) 43.40±24.54 41.57±7.34 10.25±1.33 16.76±3.06 0.07±0.39
低剂量 7.30±0.14 22.47±3.47 52.90±9.10 15.35±2.69 45.02±23.88 35.82±1.553) 10.60±0.28 15.45±0.92 0.11±0.64
中剂量 7.10±0.50 21.55±2.10 42.90±13.72 14.07±3.77 67.94±30.97 37.70±4.75 10.32±0.74 15.17±4.07 0.07±0.46
高剂量 6.62±0.59 23.23±1.71 57.38±7.18 14.15±0.96 35.13±22.94 39.62±3.14 9.57±1.16 13.37±3.17 0.06±0.41
　　与正常组比较 , 1)P<0.05, 2)P<0.01;与模型组比较 , 3)P<0.05, 4)P<0.01 ;与 PNS组比较, 5)P<0.05, 6)P<0.01;n=6
4.2　走马胎提取液对动物凝血系统的作用 在机体凝血机制的
检测中 , APTT和 TT用于检测机体内源性凝血系统的功能 , 其与
凝血因子Ⅱ , Ⅴ , Ⅹ , Ⅺ, ≫等浓度有关;而 PT则是测定外源性凝
血系统功能最常用的方法 , 与凝血因子Ⅰ , Ⅱ , Ⅴ , Ⅶ , Ⅹ 的浓度及
抗凝物质的存在有关 [ 7] 。 所以临床上分别测定 APTT, TT和 PT
来反映机体内 、外源性凝血途径的状况 , 并通过 APTT, TT和 PT
初步判断抗血栓药物的疗效。
本实验结果表明 ,与病理模型组相比 , 高剂量组 SD大鼠体内
PT, TT和 APTT都显著延长 ,并呈现剂量 -效应依赖关系(表 1)。
说明该物质对内源性和外源性凝血系统均有作用 ,其作用环节可
能是抑制凝血酶原转变成凝血酶 ,进而抑制纤维蛋白原转变成纤
维蛋白 , 影响凝血系统而发挥抗凝血作用。走马胎提取液高剂量
组 SD大鼠血浆中 Fg的含量极显著降低 ,提示走马胎提取液可能
有直接或 /和间接降解血栓的作用。然而 , 走马胎提取液究竟作
用于凝血系统的哪一个环节 , 作用于哪些凝血因子 , 通过何种方
式降解血栓 , 其抗凝血药理作用机制如何 , 目前仍不清楚 , 尚需作
进一步研究。
4.3　走马胎提取液对动物血液流变学的作用 全血黏滞性主要
是由红细胞聚集性和变形性等因素所决定。红细胞聚集性越大 ,
全血低切黏度越大;红细胞变形能力越差 , 全血高切黏度越大。
本实验结果表明 , 与病理模型组相比 , 走马胎提取液高 、中 、低剂
量组全血低切率(6 r/min和 12r/min)黏度极显著降低(见表 2),
全血中高切率黏度和血液生理指标都有所改善 , 但差异不显著
(见表 2 ～ 3)。说明走马胎提取液有降低全血低 、中 、高切率黏度
的作用 , 且对低切率黏度的降低明显强于高切率黏度 , 这可能与
走马胎提取液主要是通过降低红细胞的聚集性和增强红细胞的
变形能力以降低全血黏度 , 而不是通过改变血液生理指标来改善
血液流变性有关。
Fg是由肝脏合成的一种可溶性血浆糖蛋白 , 是血浆和血液
黏稠度的主要决定因素 , 也是机体重要的凝血因子之一。一方
面 , Fg在凝血酶的作用下转化成不可溶的纤维蛋白沉积于血管
壁 , 同时还能特异性的与血小板微粒中血小板膜糖蛋白(glyco-
protein, Gp)Ⅱb/Ⅲ a复合体相结合 , 从而激活 GpⅡ b/Ⅲ a复合
体;活化的 GpⅡb-Ⅲa复合体可通过膜受体(GpⅡb-Ⅲa)-连
接蛋白(Fg)-调节蛋白(血小板反应素或者是 Fg和血管性假性
血友病因子)-膜受体(GpⅡb-Ⅲa)桥联方式使血小板发生黏
附聚集 ,并结合可溶性和不溶性 Fg, 从而产生强烈的促凝血作
用 [ 8] 。大分子 Fg及纤维蛋白的桥联作用提高血液黏性 , 进一步
增加了血栓形成的危险性 [ 9] 。另一方面 , 增多的 Fg还能够掩盖
红细胞表面电荷 ,使红细胞膜表面电荷减弱 , 静电排斥力降低 , 促
使红细胞互相之间发生凝集 ,从而增加了全血黏滞性;Fg黏附特
性也可能促进红细胞变形性的下降 [ 10] 。本实验结果表明 , 与病
理模型组相比较 ,走马胎提取液高剂量组 SD大鼠血浆 Fg含量显
著降低。说明走马胎提取液可通过降解 Fg, 减少血小板发生黏
附聚集 ,使血液黏稠度降低。
综上所述 ,走马胎提取液具有活血化淤 , 改善血液流变学特
性 , 抑制血栓形成的作用 , 这为临床预防及治疗血栓性心血管疾
病提供了药理学理论基础。因此 ,走马胎抗血栓作用机制值得进
一步研究。
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时珍国医国药 2008年第 19卷第 9期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2008VOL.19NO.9