全 文 ：书·论著·
角花胡颓子提取物对肿瘤细胞凋亡的相关检测
陈　磊　王　琪　隋学斌　魏　娜　官　杰　许惠玉　陈绍仁　罗晓庆　王　慧　蒋瑞雪
【摘要】　目的　探讨角花胡颓子提取物（ＪＨＴ）对肿瘤细胞凋亡的作用，为其开发应用提供实验依
据。方法　运用二苯胺法检测各组肿瘤细胞ＤＮＡ断裂率，透射电镜观察肿瘤细胞的超微结构。结果
　ＪＨＴ抑瘤率为３９．０２％。与模型组比较，ＪＨＴ组、ＣＹ组ＤＮＡ断裂率升高，差异有统计学意义 （Ｐ＜
０．０５）。透射电镜观察到ＪＨＴ组肿瘤细胞典型的凋亡现象。结论　角花胡颓子提取物可抑制肿瘤生
长，其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。
【关键词】　角花胡颓子　肿瘤细胞凋亡
　　角花胡颓子Ｅｌａｅａｇｎｕｓ　ｇｏｎｙａｎｔｈｅｓ　Ｂｅｎｔｈ．，别名假甜酸，
是黎族地区常用药之一。文献报道［１］该科植物中主要含有挥
发油、生物碱、黄酮等类型化合物，具有一定的抑癌、抗癌功
效。但对其抑瘤机理的研究国内外罕见报道。本研究拟观察
角花胡颓子提取物诱导肿瘤细胞的抑瘤机制，为其临床应用
开发提供理论和实验依据。
１　材料与方法
１．１　主要仪器和试剂　ＨＩＴＡＣＨＩ－Ｈ５００型透射电镜（德国
菲利蒲公司）ＨＩＭＡＳ－２０００多媒体彩色病理图文分析系统
（同济医大）。ＥＤＴＡ、三氯乙酸（ＴＣＡ）、冰乙酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、
二苯胺等试剂。角花胡颓子提取物由海南医学院热带药用植
物研究开发实验室提供。环磷酰胺（Ｃｙｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ，ＣＹ），
天津金世制药有限公司，批准文号：国药准字 Ｈ１２０２１００６。
１．２　实验动物与瘤株　４０只昆明小鼠，体重（２０±２）ｇ，雌雄
各半，齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。小鼠Ｓ１８０瘤株，
黑龙江省肿瘤研究所提供。
１．３　动物分组及给药方法　造模后将荷瘤鼠随机分为三组，
每组１０只，分别为模型组、ＪＨＴ组、ＣＹ组，另取１０只未荷瘤
小鼠作为正常对照。模型组（Ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ）：生理盐水灌胃０．
２ｍｌ／１０ｇ／ｄ；ＪＨＴ组（ｇｒｏｕｐ）：角花胡颓子提取物灌胃 ０．２
ｍｌ／１０ｇ／ｄ；环磷酰胺组（ＣＹ　ｇｒｏｕｐ）：腹腔注射ＣＹ　２０ｍｇ／ｋｇ／
ｄ。接种后次日给药，各组每天给药一次，连续１０天。
１．４　角花胡颓子提取物对Ｓ１８０小鼠瘤重的影响　停药后次
日称取小鼠体重，脱椎处死小鼠，取瘤块称重，计算抑瘤率。
１．５　ＤＮＡ断裂率［２］　给药１０ｄ后，小鼠脱颈处死，取肿瘤
组织１００ｍｇ，加０．９ｍｌ裂解液（１０ｍｍｏｌ／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｌｍｍｏｌ／ｌ
ＥＤＴＡ，ｐＨ　７．５，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）制成１０％匀浆、反复冻
融后１３　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清液。沉淀溶于１．５ｍｌ
ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｌｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ，ｐＨ　８．０）中。上清液
和沉淀中分别加入１．５ｍｌ　１０％ＴＣＡ，４℃过夜１３　０００ｒ／ｍｉｎ，离心
１５ｍｉｎ弃上清，取沉淀加入０．５ｍｌ　５％ＴＣＡ。１００℃水浴１５ｍｉｎ冷
却后４００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ收集上清液加入二倍体积二苯胺溶
：黑龙江省教育厅面上项目课题（１１５５１５５６）资助
作者单位：齐齐哈尔医学院２００９级检验本科（陈磊）
齐齐哈尔医学院医学技术学院（王琪、官杰、许惠玉、陈绍仁、
罗晓庆、王慧、蒋瑞雪）
齐齐哈尔中医医院（隋学斌）
海南医学院药学系（魏娜）
通讯作者：王琪
邮　　编　１６１００６　　收稿日期　２０１２－１１－１９
液３０℃反应１６ｈ～１８ｈ，用分光光度计于６００ｎｍ处测定吸光
值（Ａ值）。ＤＮＡ断裂率（％）＝上清 Ａ值（上清 Ａ值＋沉淀
Ａ值）。
１．６　透射电镜观察形态学改变　每组随机取两块瘤组织，将
瘤组织快速投入２．５％戊二醛固定液固定２小时以上，磷酸
缓冲液漂洗，１％锇酸后固定１～２小时，缓冲液漂洗２０分钟，
丙酮梯度脱水，浸透、包埋、制备超薄切片，醛酸双氧铀和柠檬
酸铅染色，电镜观察并拍片。
１．７　统计学分析　计数资料以 （ｘ±ｓ）表示，Ｐ＜０．０５有统
计学意义。
２　实验结果
２．１　抑瘤率　和模型组相比，ＪＨＴ组、ＣＹ组瘤重显著低于
模型组瘤重，差异有统计学意义 （Ｐ＜０．０５）。ＪＨＴ组和ＣＹ
组比较，差异没有统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。ＪＨＴ组抑瘤率为
３９．０２％。见表１。
２．２　ＤＮＡ断裂率　和模型组比较，ＪＨＴ组、ＣＹ 组ＤＮＡ断
裂率升高，差异有统计学意义 （Ｐ＜０．０５）。而ＪＨＴ组和ＣＹ
组比较，差异没有统计学意义 （Ｐ＞０．０５）。见表２。
２．３　透射电镜观察结果　模型组瘤细胞的核浆比例增大，双
层核膜清晰，细胞核异形性明显，肿瘤细胞表面有大量微绒
毛，细胞质内线粒体轻度肿胀，核周可见幼稚高尔基复合体及
内质网，游离核蛋白体丰富，有少量的淋巴细胞侵润。ＪＨＴ
组镜下肿瘤细胞呈现典型凋亡变化。肿瘤细胞体积明显变
小，细胞表面微绒毛减少，内膜结构完好，核膜清晰，细胞核固
缩，染色质团块状散布核内或边集核膜下，并可见凋亡小体。
游离核蛋白体大量减少，线粒体嵴断裂，空泡变性，胞质内有
大量的脂肪堆积；同时可见大量粒细胞侵润并伴有坏死。环
磷酰胺组镜下可见大面积坏死。
表１　ＪＨＴ对Ｓ１８０荷瘤小鼠瘤重与抑瘤率的影响　（ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
组别 瘤重（ｇ） 抑瘤率（％）
模型组　　 １．４８±０．６５０７
中药组　　 ０．９９±０．４９１２＊ ３９．０２
环磷酰胺组 ０．５８±０．１５６６＊ ６０．０５
　　注：Ｐ＜０．０５ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ。
表２　各组肿瘤细胞ＤＮＡ断裂率变化　 （ｘ±ｓ，ｎ＝１０）
组别 例数 ＤＮＡ断裂率（％）
模型组　　 １０　 ０．２３±０．０４
中药组　　 １０　 ０．４９±０．０３＊
环磷酰胺组 １０　 ０．５５±０．０２＊
　　注：Ｐ＜０．０５ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｍｏｄｅｌ　ｇｒｏｕｐ。
·７７１３·齐齐哈尔医学院学报２０１２年第３３卷第２３期
Ｐ１６在增生性瘢痕中的表达及意义
纪　亮　陈佩煜　李永涛　沙　峰　沈　雷　陈永春　李公启　侯金才　李静平
【摘要】　目的　观察增生性瘢痕中成纤维细胞中Ｐ１６的表达，探讨其与正常皮肤组织之间的差异
关联性。方法　实验组为增生性瘢痕，以正常皮肤组织作为对照组，通过ＳＰ免疫组化检测两组中Ｐ１６
的表达。结果　Ｐ１６在增生性瘢痕的阳性表达率为７８．９％，显著高于对照组 （Ｐ＜０．０５）。与表达部位、
性别无明显联系。结论　在瘢痕的形成过程中，Ｐ１６作为细胞周期的负调控因子表达失衡是参与瘢痕
转归重要的机制。
【关键词】　增生性瘢痕　成纤维细胞　Ｐ１６
Ｐ１６　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｓｃａｒｓ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ＊　ＪＩ　Ｌｉａｎｇ，ｅｔ　ａｌ．　 （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎａｔｏ－
ｍｙ，Ｑｉｑｉｈａｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｑｉｑｉｈａｒ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　１６１００６，Ｃｈｉｎａ．）
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｓｃａｒ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　Ｐ１６ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ
ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｓｋｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｇｒｏｕｐ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ
ｓｃａｒ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｓｋｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ａｓ　ａ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　Ｐ１６ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＳＰ　ｉｍｍｕ－
ｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐ１６ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｉｎ　ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｓｃａｒｓ　７８．９％，ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈ－
ｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０５）．Ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｇｅｎｄｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｉｔｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ
ｓｃａｒ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｐ１６ａｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｍｂａｌａｎｃｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｍｅｃｈａ－
ｎｉｓｍ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｃａｒ　ｏｕｔｃｏｍｅ．
【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ　ｓｃａｒ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　Ｐ１６
　　增生性瘢痕是由于其成纤维细胞的增殖和活性增强而产
生大量的胶原蛋白在组织中大量沉积所致［１－２］。增生性瘢痕
的成纤维细胞正常增殖依赖于细胞周期中各种调节因子的平
衡，整个周期中任何调节因子发生紊乱，都将导致细胞增殖异
常。人细胞周期蛋白Ｐ１６是重要的细胞周期调节因子。Ｐ１６
作为负调控因子主要调控细胞能否通过 Ｇ１期到Ｓ期［３］，本
试验通过免疫组织化学的方法，探索Ｐ１６在增生性瘢痕的形
成过程中的可能作用。
１　材料和方法
１．１　标本　取材自２０１０年８月～２０１１年１２月期间，经齐齐
哈尔医学院第三附属医院整形美容科确诊的来源于耳垂、胸
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术面上项目（Ｎｏ：１１５５１５４８）
作者单位：齐齐哈尔医学院
通讯作者：李静平，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｊｐ６８６８４４６＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
邮　　编　１６１００６　　收稿日期　２０１２－１１－１２
部、四肢等部位增生性瘢痕患者１９例为实验组，年龄１８～３４
岁，其中男１１例、女８例。术中切取患者全层瘢痕组织标本；
同例标本瘢痕周围附带的少量正常皮肤组织为对照组，各标
本均无合并皮肤病，结缔组织病和其他重要脏器疾病；所有标
本患者术前均未行放疗及免疫治疗。所有患者均填写知情同
意书，并同意用于科学研究。
１．２　主要试剂　兔抗人Ｐ１６单克隆抗体，ＳＰ试剂盒，ＤＡＢ
显色剂均购自武汉博士得生物技术有限公司。
１．３　免疫组化　标本经４％多聚甲醛固定，４μｍ 冰冻切片，
０．０１ＭＰＢＳ冲洗３×５ｍｉｎ；３％Ｈ２Ｏ２ 浸泡１０ｍｉｎ，０．０１Ｍ
ＰＢＳ冲洗３×５ｍｉｎ；山羊血清封闭，滴加Ｐ１６一抗（１∶３００），４
℃，过夜，０．０１ＭＰＢＳ冲洗３×５ｍｉｎ；生物素化羊抗兔二抗１５
ｍｉｎ；０．０１ＭＰＢＳ冲洗３×５ｍｉｎ；滴加辣根过氧化物酶，ＤＡＢ
显色，自来水冲洗；苏木素复染，脱水，封片。
１．４　结果判断　Ｐ１６以细胞核伴有胞浆出现棕黄色颗粒作
为阳性细胞，只有胞浆阳性视为非特异染色。每张切片周围
３　讨论
中草药的使用在我国源远流长，中医药在抗肿瘤方面疗
效确切且副作用小，因此，深入研究植物提取物的抗肿瘤特性
为筛选新的安全有效的抗癌药提供了契机。细胞凋亡是机体
免疫自稳和免疫监视功能的重要组成部分，通过应用各种不
同的药物影响信号传导途径，触发或重建整个死亡程序，使处
于关闭状态的凋亡信号传导各效应环节迅速连通，诱导程序
化细胞死亡，目前已成为肿瘤治疗策略之一［３］。本实验结果
表明，角花胡颓子提取物对小鼠体内Ｓ１８０肉瘤具有一定的抑
制作用，抑瘤率为３９．０２％。采用二苯胺法测定 ＤＮＡ断裂
率，和模型组比较，ＪＨＴ组ＤＮＡ断裂率升高，差异有统计学
意义 （Ｐ＜０．０５）。透射电镜观察中药组瘤细胞以凋亡变化为
主。瘤细胞体积明显变小，细胞表面微绒毛减少，内膜结构完
好，核膜清晰，细胞核固缩，染色质团块状散布核内或边集核
膜下，并可见典型的凋亡小体。结果显示，角花胡颓子提取物
能够诱导肿瘤细胞凋亡。提示角花胡颓子提取物的抗肿瘤作
用机理和诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。
参　考　文　献
［１］　蒋德锡，陈文芝，贾建静，等．分光光度法测定角花胡颓子中的总
黄酮［Ｊ］．华西药学杂志，２０１１，２６（１）：８１－８２
［２］　石学魁，王亚贤，潘玉辉．大鼠急性脑梗死后大脑皮质 ＤＮＡ断
裂率和细胞形态学变化及活脑康作用研究［Ｊ］．中西医结合心脑
血管病杂志，２００５，３（４）：３２７－３２８
［３］　Ｍａｒｓｔｏｎ　ＡＬ，Ａｍｏｎ　Ａ．Ｍｅｉｏｓｉｓ：ｃｅｌ－ｃｙｃｌｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｓｈｕｆｆｌｅ　ａｎｄ
ｄｅａｌ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｍｏｌ　ｃｅｌ　Ｂｉｏｌ，２００４，５：９　８３０－９　８５４
·８７１３· Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｑｉｑｉｈａｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．２３