全 文 ：生态科学2004年8月第23卷 第3期 ECOLOGICSCIENCEAug，2004，23(3)：200～203
碳酸钙胁迫对枳壳愈伤组织生理特性的影响
吉前华(肇庆学院生物系，广东肇庆526061)
【摘要】 石灰性土壤上富含碳酸钙是导致柑桔缺铁黄化的主要因素。碳酸钙胁迫对枳壳愈伤组织生理影响的研究结
果表明：除全Fe含量外，CaC0，浓度与POD活性、s0D活性、CAT活性、活性Fe含量、可溶性蛋白质含量、愈伤
组织增殖均呈显著或极显著负相关，与培养液pH值呈显著相关，随着培养天数的增加，POD活性、活性Fe含量、可
溶性蛋白质含量、愈伤组织增殖呈降低趋势，SOD、CAT活性先升后降，全Fe含量在25日出现沉积，高浓度CaCO，
下培养液pH值仅在20日左右略有降低。
关键词：枳壳；愈伤组织；碳酸钙；生理；胁迫
中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：l008．8873(2004)03．200．04
R髂ponsesofcallusesofj啊以c讥临乃咖觑lmtoc2lcareousstr鹤 ／JIQian-Hua(却口一埘P甩fD厂曰fD，9蹦z矗∞g拥g己肺fw坶砂，
ZhaoqingGuangdong52606l，China)
Abstract尸D疗ci胁sf嘲白，胁纪，animportantroo stockofcitllJscrops，su饪bredfbmchlorosisinCaC01．richsoil，whichisone
ofthedi伍cult．to．tacklepmb emsinthecinusindustryinChin扎Experimentswerco ductedontheresponsesofcaIlusesof
PD甩cfⅢsf“庙，f口缸tocalcareousstress．V撕ousstre slevelsweremadebyadding0，0．1％，0．4％，0，7％，a11d1．0％CaC03in
MTmedium．TheresultsshowedthatthewholeCaC01stresscausedpoorabilityofH+exudationjldl wprolifbration，
weakenedactivityofperoxidese(POD)anddecreasedcontentsofactiveironandsolubleprotein．CaC0，stressenhacedthe
activitiesofsuperoxidedismutase(SOD)柚dcatalase(CA：T)duringtheinitialcultureperiodandweakeneditaftenⅣards．，锄d
enrichedtotalironfor25daysculture．ThenegativecorrelationbetweenCaC03concentrationandheacti讥tiesofPOD，SOD，
C觚thecontentofactiveiron，thecontentofsolubleproteinandcallusgro、ⅣthissignicantattheO．OlorO．05Ievel．The
Dositivecorrelationbe“)l，eenCaC01concen仃ationndmediumpHissi霉rnicantatthe0．0l level．
Kevwords：，)D行cf州sf，f加矗口纪；callus；CaC01stress；responses
地球上石灰性土壤在南纬10度到40度和北纬10
度到40度之问的地区广泛存在。石灰诱导失绿症是石
灰性土壤上作物最主要的营养失调综合症¨引。柑桔是
受害较重的植物之一，也是我国柑桔生产中的严重问
题，尤以四川最为突出，土壤碳酸钙含量高，一般为
5％～10％，pH7．5～8．5，严重影响植株的生长和产量，
有些植株减产30％～40％，有些根本无收益，特别是
综合性状良好的柑桔当家砧木一枳壳(PoncillJs
trifoliata(L．)Raf)砧柑桔园表现尤为严重，因此筛
选和培育抗性材料成为目前和今后解决缺铁失绿问题
的根本出路，同时通过逆境反应及可能机理选择用于
早期、快速、准确、简便、有效的诊断缺铁黄化及筛
选柑桔铁高效基因型指标是非常重要的心。。细胞工程
很早就应用于植物抗盐性的研究，但有关抗碱性机理
的研究较少，枳壳未见有相关报道¨引。本文旨在研究
在碳酸钙胁迫条件下枳壳愈伤组织的某些生理生化反
应，为通过愈伤组织变异和驯化的途径培育抗碱性土
壤优良枳砧新材料提供一定的理论基础。
1材料与方法
1．1试验材料
供试材料取自枳壳六年生实生树嫩梢离体培养获
得的绿色瘤状愈伤组织
1．2试验方法
采用培养25d的绿色瘤状愈伤组织进行液体滤纸
桥静置培养，基本培养基为MT培养基(蔗糖3％，
pH5．8)，添加O．O％，O．1％，0．4％，O．7％，l％的碳
酸钙进行胁迫培养，接种前称愈伤组织鲜重，测定培
养液pH值，接种后取培养5d、10d、15d、20d、
25d的愈伤组织及培养液进行测定。重复3次。培养
条件：光照16h，温度24℃。
全铁含量测定参照翁才浩Ⅲ高氯酸、浓硝酸消
化法，活性铁含量测定参照杨玉爱旧1HCl浸提法。
可溶性蛋白质(Pr)含量的测定参照文树基№’考马
斯亮蓝G．250法。过氧化物酶(POD)活性的测定参
照刘祖祺¨。愈创木酚法，以每分钟OD470增加O．01
为一个酶活单位(u)。过氧化氢酶(CAT)活性的测
定参照蒋传葵b。过氧化氢法，以240nm处OD值每
分钟减少O．01为一个酶活单位(u)。超氧化物歧化酶
作者简介：吉前华(1972．)，女，博士，副教授，从事植物遗传及生理
学研究。E_mail：qhgee@163．com．
2004．06．14收稿，2004．08-20接受
万方数据
3期 吉前华：碳酸钙胁迫对枳壳愈伤组织生理特性的影响 20l
表1 培养25天各因素问相关分析结果
1’able1cor代latjOnanalVsisOfallfactorsfor25daysculture
CaC01 POD SOD CAT pH ActiveFe 1’otalFe Pm Fw
POD 1．000 0．967” O．998” ．0．937+ 0．887’ ．0．707 0．877 0．988”
SOD 1．000 0．955‘ ．0．965” 0．931‘ ．0．592 0．838 0．984”
CAT 1．000 一0．932‘ 0．875 ．0．735 O．879’ 0．985”
DH 1．000 ．0．835 0．560 ．O．726 ．0．978一
activeF 1．000 -O．703 O．939’ 0．892。
totalFe 1．000 -0．867 一O．669
Pr 1．000 0．839
Fw 1．000
·Correlationiss g ic锄tatthe0．05leVel幸牛Con．elationissignicantatthe0．O1 leVel；
—-◆一c8c03O．o％
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5 10 15 20 25 5 10 15 20 25
培养天数
Daysafterinoculation
1％
4％
7％
o％
图l碳酸钙胁迫下愈伤组织过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(cAT)、超氧化物歧化酶(s0D)活性变化
Fig1Changoftheactivitiesofp roxidase(PoD)、superoxidedi mutase(SoD)andcatalase(CAT)inca¨usunderCaC03stress
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15 20 25 5
培养天数
Dayafterinoculation
图2碳酸钙胁迫下愈伤组织活性铁、全铁含量变化
Fjg2ChangofcontentsofotalironandactiVeironincaIlusunderCaC(bstress
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培养天数
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图3碳酸钙胁迫下愈伤组织增殖
Fig3ChangofcalIusgrowthunderCaC03st¨塔s
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5 10 15 20 25
培养天数
Daysafterinoculation
图4碳酸钙胁迫下愈伤组织可溶性蛋白质含量变化
Fig4ChangofsolubIeprOteinco皿tentincaUusnderCaC03stress
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万方数据
202 生态科学 23卷
警暑
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培养天数
Daysafterinoculation
图5碳酸钙胁迫下培养液pH值变化
Fig5ChangofmediumpHunderCaC03stress
fSOD)活性的测定参照刘祖祺¨。氮兰四唑法，测定反
应液OD650，以抑制NBT光化还原50％作为一个酶
活单位(u)。愈伤组织增重Fw(g)=收获愈伤组织
鲜重一接种愈伤组织鲜重。培养液pH用PHS．10A数字
酸度／离子计测定。
1．3数据统计分析：实验数据采用SPSSforWindows
软件包进行回归分析，曲线拟合，相关分析等。
2结果与分析
愈伤组织培养25d时各因素间相关分析结果(表
1)表明：除全Fe含量外，CaC03浓度与各因素间均
呈显著或极显著负相关，与培养液pH值呈显著相关，
说明CaC03浓度在枳壳愈伤组织培养过程中显著或
极显著的影响到愈伤组织各项生理指标。POD、SOD、
CAT三种酶之间也呈现两两显著或极显著正相关关
系。pH值、活性Fe含量显著或极显著的影响POD、
SOD、CAT三种酶的酶活性。愈伤组织增殖与三种酶
呈极显著正相关关系，与CaCO，浓度、pH值呈极显
著负相关，与活性Fe含量呈显著相关关系。但全Fe
含量与各因素间均未达到显著性相关关系。
在各培养条件下，POD活性随培养天数的增加均
有上升趋势(图1)，无胁迫培养POD活性在第5、25
天出现两个高峰，但胁迫培养条件下POD活性均不如
无胁迫培养的高，且随CaCO，浓度增加而明显下降。
CAT活性在无胁迫培养时呈上升趋势，胁迫培养第5
天较无胁迫培养有所升高，随后呈降低趋势，并随
CaC03浓度增加而降低。在各培养条件下，SOD活性
均呈下降趋势，不同CaCO，浓度之间SOD活性变化
趋势与CAT相同。
无胁迫培养条件下，每克愈伤组织活性铁含量随
培养天数增加而略有增加，全铁含量基本稳定(图2)。
胁迫培养条件下，第5d愈伤组织活性铁含量随CaC03
浓度增加而增加，且均高于无胁迫培养条件下活性铁
含量，但随后均呈降低趋势，随CaCO，浓度增加而降
低加快，且均低于无胁迫培养。0．I％～1．0％CaC03
胁迫培养，第5d愈伤组织全铁含量变化与活性铁变
化趋势一致，0．1％～0．4％CaC03胁迫培养随后呈降低
趋势，O．7％～1．0％CaC03胁迫培养在5～20d呈降低
趋势，第25d迅速回升，出现异常富集。
胁迫培养的愈伤组织增殖(图3)，第10d后出现
明显下降的趋势。无胁迫培养条件下，每克愈伤组织
的可溶性蛋白质含量在5、15d出现两个高峰(图4)，
在0．1％～1．O％碳酸钙胁迫培养下均比无胁迫培养含
量低，并随CaCO，浓度增加而明显下降，各碳酸钙浓
度下均只出现一个峰值。
图5表明无CaC03液体培养，培养液pH一直保
持最适水平(pH5．8)，含0．1％CaC03培养液pH随培养
天数的增加而略微降低，基本达最适水平，含0．4％、
0．7％、1％CaCO，培养液pH值在第5d至第15d中无
明显变化，而第15d至第20d略微下降，20d后又有
回升。
3讨论
培养初期CAT、SOD活性同时增加是十分重要
的，SOD在清除自由基时产生H202，CAT活性提高
可以更有效的清除H202，与SOD协同完善保护膜免
受自由基伤害，其他作物在植株水平、试管苗及愈伤
组织、悬浮细胞系均有研究随，11,ll伽，。尽管如此，从
总体上看，随培养天数的增加，碳酸钙胁迫不同程度
上抑制了枳壳POD、CAT、SOD的活性，并与碳酸钙
浓度呈极显著负相关，因此碳酸钙胁迫下保护酶系统
活性下降与枳壳愈伤组织不耐盐碱性有关，同时CAT、
POD属于含铁酶，细胞内活性铁的含量降低，可能使
CAT、POD活性降低，因而表现CaC03胁迫培养条件
下的降低趋势。
随培养液pH的增高，全铁、活性铁含量均降低，
这可能与枳壳愈伤组织在胁迫下活化和吸收铁的能力
差有关。由相关性分析结果可知活性铁含量能作为胁
迫反应的指标，而全铁则不能，这一结果与植株水平
研究相同L12J。
有实验证明耐盐愈伤组织在愈伤组织生长量恢
复、保护酶活性提高、调节某些可溶性蛋白质的合成
或降解而增强耐盐性，而不耐盐愈伤组织与之相反b。。
本实验结果恰好证明了这一点(图1—5)。这些结果说
明， 愈伤组织生长量、质子分泌能力、活性铁含量、
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0㈣㈣善|舢|耄|薹|㈣薹|撇垂|
7
7
6
6
6
6
6：0
5
万方数据
万方数据
碳酸钙胁迫对枳壳愈伤组织生理特性的影响
作者： 吉前华
作者单位： 肇庆学院生物系,广东,肇庆,526061
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2004,23(3)
被引用次数： 1次

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