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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):130-134
制片技术是生物学工作者常用的一门实验技术，
它是从事动植物生物技术、细胞生物学、结构植物学、
植物生殖生物学、植物发育生物学等研究的必要技
术基础，在生物科学领域占有重要地位。
石蜡切片法是组织学、发育生物学研究最常
用的制片技术之一，广泛运用于临床病理诊断、教
学和科研工作中。常规的石蜡切片制作过程是：取
材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→染色
收稿日期：2015-09-25
基金项目：国家自然科学基金项目（31070284）
作者简介：涂磊，女，硕士研究生，研究方向：发育生物学；E-mail ：1013773409@qq.com
通讯作者：张丽瑶，女，副教授，研究方向：被子植物生殖生物学；E-mail ：lyzhang26@whu.edu.cn
正庚烷代替二甲苯在拟南芥花药石蜡切片中的应用
涂磊 张丽瑶
（武汉大学生命科学学院，武汉 430000）
摘 要 ： 二甲苯是应用最广的一种透明剂，常用于石蜡切片中的脱蜡和透明，但由于其对人体危害大，广大科研工作者一
直在探寻更加安全的二甲苯代替物。以不同时期的拟南芥花药为试材，脱蜡和透明均由正庚烷代替二甲苯完成，其余步骤与常规
石蜡切片相同。结果显示，正庚烷透明力强而迅速，既能与乙醇、封藏树胶混合，又能溶解石蜡，可作为合适的透明剂和脱蜡剂；
组织经正庚烷处理后物理性质良好，浸蜡充分，切片时软硬适中，容易连续切片，而且厚薄均匀，摊片时能在 42℃水中自然展开，
平整而无皱褶；经甲苯胺蓝染色，细胞着色好，核质分明，结构清晰，组织形态保持完好，与二甲苯作透明剂的切片效果无明显区别。
因此，正庚烷可以作为一种新的、相对安全有效的二甲苯替代物，应用于植物组织切片中。
关键词 ： 正庚烷 ；二甲苯 ；石蜡切片 ；透明剂
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.018
Replacing Xylene with n-heptane for Paraffin Section of Arabidopsis
thaliana Anther
TU Lei ZHANG Li-yao
（College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430000）
Abstract: Xylene is widely used as clearing agent for dewaxing and clearing in paraffin section. However，due to its severe harm
to human health，researchers have been seeking adequate substitutes. In this study，Arabidopsis thaliana anthers in various periods were
processed with n-heptane replacing xylene as a novel clearing and deparaffinizing agent in paraffin section，and the rest of steps were the same
as the conventional paraffin section. The results showed that n-heptane with strong and rapid transparency was able to be mixed with ethanol
and gum and dissolve paraffin，thus could be utilized as clearing and dewaxing agent. The tissues processed with n-heptane was in fine physic-
chemical property and saturated with paraffin ；due to the proper hardness of the section，continuously slicing was easy and slice thickness
was uniform，moreover，the section was expanded naturally in the water of 42℃ and was flat and no folds. In addition，the cells stained with
toluidine blue were in fine quality of staining，and had a clear definition of the nucleus and the cytoplasm，as well as the morphology and
structure of the cells were maintained well，meaning that there were no significant differences from the section with xylene as clearing agent. In
conclusion，n-heptane is a novel，safe and efficient substitute replacing xylene in the histological techniques for plants.
Key words: n-heptane ；xylene ；paraffin section ；clearing agent
2016,32(6) 131涂磊等：正庚烷代替二甲苯在拟南芥花药石蜡切片中的应用
→脱蜡→封片。传统使用的透明剂和脱蜡剂是二甲
苯［1，2］，二甲苯是一种有芳香气味的刺激性、易挥
发液体，有毒性，主要对中枢神经和植物神经有麻
痹和黏膜刺激作用，是一种潜在的致癌物质。大量
的动物实验研究表明，过多接触二甲苯会引起神经
系统、肝脏、肺、皮肤等多个组织的毒性反应［3-7］。
二甲苯的细胞学毒性主要体现在诱导线粒体解偶联
和氧化应激反应［8］。接触和使用化学试剂的安全性
可以从 http://www.proscitech.com/ 网站上查询物质安
全资料表（MSDS）得到。
由于二甲苯对人体危害大，广大科研工作者一
直致力于寻找更加安全的二甲苯代替物。1978 年，
Maxwell 曾提出可使用三氯乙烷作为透明剂，此后便
有越来越多的技术人员使用该替代物［9］，但由于三
氯乙烷的蒸气仍然有毒，因此在实验过程中必须保
持良好的通风状态［10］。此后，多种二甲苯替代物，
例如：植物油［11］、葵酸丁酯［12］、异丙醇［13］、异丙
醇 - 矿 物 油 混 合 物［14］、 丙 二 醇 甲 酯［15］、 辛
烷［16，17］、硬脂酸［18］、松节油［19］、环保透明剂［20］、
Y透明剂［21］、甲基环己烷［22］等被相继使用。
正庚烷是一种脂肪族烃化合物，无色易挥发液
体，不溶于水，溶于醇，可混溶于乙醚、氯仿，熔
点 -90.5℃，沸点 98.5℃，易燃，为汽油的组成成分
之一，主要用作测定辛烷值的标准物［23］。此前，已
有研究者将正庚烷作为二甲苯的替代物，用于动物
组织切片的透明和脱蜡过程，并取得良好效果［24］。
但正庚烷是否同样适用于植物组织切片，尚无人研
究。本实验室多年来一直致力于被子植物受精与胚
胎发生的研究，组织切片是本实验室研究的必要基
础技术。本研究以拟南芥不同发育时期的花药切片
为例，探究正庚烷替代二甲苯用于植物组织切片的
可能性，拟为植物研究工作者提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 野生型拟南芥（COL）温室种植
（22℃，16 h 光照 /8 h 黑暗）长至开花期，取新鲜花
序进行后续实验。
1.1.2 试剂 FAA 固定液（福尔马林 5 mL，乙酸 5
mL，50% 乙醇 90 mL），现配现用；无水乙醇，配
成不同浓度备用；正庚烷（国药）；石蜡（Sigma）；
多聚赖氨酸：粉末购自 Sigma 公司，称取 20 mg 多
聚赖氨酸粉末溶于 20 mL 去离子水中，配成 10×母
液，-20℃保存；甲苯胺蓝染色液：粉末购自 Sigma
公司，称取 1 g 甲苯胺蓝粉末，溶于 100 mL 70% 乙
醇中，4℃保存，使用时以双蒸水 100 倍稀释；加拿
大树胶（Sigma）。
1.1.3 主要仪器 石蜡切片机（AO），恒温加热仪
（瑞华），磨刀机（Leica SP9000），光学显微镜（OL-
YMPUS IX71）。
1.2 方法
1.2.1 处理载玻片 用 1%-2% 盐酸乙醇（95% 医
用乙醇 100 mL 中加入浓盐酸 1-2 mL）浸泡过夜→
流水冲洗（放在塑料篮中）→取出后放入 95%（医用）
乙醇中备用。使用前擦干载玻片，均匀涂抹多聚赖
氨酸水溶液，置于 60℃烘箱烘 1-2 h 干燥。
1.2.2 固定 取新鲜的拟南芥花序，放入 20 mL 小
瓶中，加满 FAA 固定液，抽真空辅助固定 20-30
min，更换固定液后，4℃冰箱放置过夜。
1.2.3 脱水 50% 乙醇→ 70% 乙醇→ 85% 乙醇
→ 95% 乙醇→ 100% 乙醇→ 100% 乙醇逐级脱水，
材料在无水乙醇中脱水 30 min，其他各级分别脱水
1 h，最后一级脱水需更换 2次无水乙醇。
1.2.4 透明 1/2 无水乙醇＋ 1/2 正庚烷→纯正庚烷
→纯正庚烷逐级浸泡材料，每级放置 1.5 h。
1.2.5 浸蜡 提前融石蜡，弃上一级正庚烷，配置
体积比为 1∶1的正庚烷 / 纯石蜡混合液，于 58℃恒
温台浸泡材料过夜，之后使用纯石蜡替换上一级溶
液，每隔 12 h 换一次纯石蜡溶液，共替换 6次。
1.2.6 包埋 将充分浸蜡的材料倒入已叠整齐的纸
盒中，石蜡凝固前摆正材料方向，待石蜡凝固后放
入 4℃冰箱保存备用。
1.2.7 切片 切片前磨刀→分割、修整蜡块呈梯形
→固定蜡块→固定切片刀，调节刀的角度到 15°→调
节切片厚度使其为 10 μm→调节刀口与蜡块的距离、
蜡块的位置→切片。
1.2.8 展片、粘片 将蜡带置于多聚赖氨酸处理过
的载玻片上，加蒸馏水展平蜡带后于 42℃展片台上
烤干。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6132
1.2.9 染色 将玻片放入染缸，再将甲苯胺蓝染液
加入染缸至淹没玻片，染色 10 min，再用双蒸水清
洗玻片，42℃烘箱中烘干。
1.2.10 脱蜡及封片 正庚烷浸泡玻片 2 次，每次
10 min，取出玻片滴加加拿大树胶，盖上盖玻片封片。
2 结果
2.1 正庚烷代替二甲苯作透明剂
材料经固定及各级乙醇脱水后，再用正庚烷逐
步透明。结果（图 1，图 2）显示，处理后的组织呈
半透明状态，且能保持平整，无收缩、变形现象；
浸蜡后切片，容易连续切片而且厚薄均匀，摊片时
能在 42℃水中自然展开，平整而无皱褶，说明以正
庚烷作透明剂，不仅能与脱水剂充分混合，又能被
2.3 光学显微镜下花药形态的观察
脱蜡后的组织经封藏剂封藏后，便可以长期保
存，显微镜下观察切片，结果（图 4）显示，甲苯
胺蓝染色颜色鲜亮，细胞着色好，核质分明，结构
清晰，组织形态保持完好，能达到以二甲苯作透明
剂的石蜡切片效果。
3 讨论
在组织制片实验中，透明和脱蜡是两个十分重
要的步骤，透明是脱水与浸蜡、脱水与封藏之间的
桥梁，而切片后需要用脱蜡剂溶去组织和细胞内外
的石蜡，才能使细胞、组织更加透明清晰，便于观察。
传统使用的透明和脱蜡试剂是二甲苯，二甲苯是含
苯环的芳香族化合物，毒性高，虽然已有各种二甲
苯替代物被开发使用，但是却未普及：或因效果不
稳定，或因价格较高［25］，因此，新的、更加安全有
效的二甲苯替代物亟待研发。
A
50 μm
B
50 μm
A ：新鲜花序；B：透明后花序
图 1 正庚烷透明拟南芥花序
A
B
C
50 μm
50 μm
A ：新鲜的花；B：透明后的花；C：连续切片
图 2 正庚烷透明拟南芥不同时期的花
A
B
A ：脱蜡前的切片；B：脱蜡后的切片
图 3 正庚烷脱蜡效果
石蜡完全取代，透明效果好，是一种合适的透明剂。
2.2 正庚烷代替二甲苯作脱蜡剂
展片、烘片、染色以后，用正庚烷浸泡玻片 2次，
每次 10 min。结果（图 3）显示，仅剩下植物组织
仍保持在原位，用于支撑组织和细胞的石蜡已被完
全溶解，组织、细胞更加透明清晰，便于观察；用
正庚烷溶去组织内外的石蜡只需要 20 min，脱蜡快
而干净，表明正庚烷是一种合适的脱蜡剂。
2016,32(6) 133涂磊等：正庚烷代替二甲苯在拟南芥花药石蜡切片中的应用
二甲苯具有慢性毒性，经常或反复侵入人体后
会引起神经衰弱、植物神经紊乱或皮肤黏膜刺激等
症状，具体如头痛、头晕、乏力、睡眠障碍、血压降低、
轻度贫血、皮炎等表现［26］。对妊娠期妇女还会导致
妊娠贫血、妊娠高血压综合征、自然流产等症状，
对月经机能、生殖机能和子代发育有一定的影响和
损害［27］。另有文献报道，苯类化合物在一定程度上
会引发牙周组织疾病［28］。而正庚烷只是对直接接触
的皮肤有轻度刺激性，并具有麻醉作用。国家标准
职业性接触毒物危害程度分级，将二甲苯定为 III 级
（中度危害），溶剂汽油（正庚烷为其组成成分之一）
为 IV 级（轻度危害）［29］。
正庚烷是短链脂肪烃化合物，相比于芳香烃二
甲苯，正庚烷与石蜡结构更为相似，溶解石蜡也更
加迅速。常规二甲苯脱蜡时间为每次 20 min，正庚
烷脱蜡时间为每次 10 min，脱蜡快而干净。以正庚
烷为透明剂，透明效果好，处理后的材料呈半透明状，
后续浸蜡充分，容易连续切片，不脱片，摊片时能
在 42℃水中自然展开，平整而无皱褶。本实验研究
发现，经正庚烷处理后的组织染色效果好，甲苯胺
蓝染色 10 min 即可，颜色鲜亮，核质分明，结构清
晰，解决了植物油等二甲苯替代物染色不佳的问题。
在实验中，应用正庚烷需要注意的是：正庚烷
易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，应远离
火种，密封、避光保存；有一定的挥发性，用完及
时盖严。为了脱水彻底并使材料减少收缩，透明时
可逐步从纯乙醇过渡到正庚烷，即 1/2 无水乙醇＋
1/2 正庚烷→纯正庚烷→纯正庚烷（正庚烷应更换 2
次，以除尽乙醇）。
正庚烷作为一种新的、相对安全有效的二甲苯
替代物，有望在植物组织切片中普及使用。拟南芥
是植物研究的模式植物之一，花药是植物生殖生物
学的重要研究对象。本研究成功地将正庚烷应用于
拟南芥花药石蜡切片实验，下一步应选取更多种类
的植物材料及更多样化的组织开展实验，以期将正
庚烷普遍应用于植物制片技术，消除二甲苯对制片
人员的危害，改善工作环境。
4 结论
本研究对拟南芥不同时期的花药进行石蜡切片，
通过使用正庚烷作为透明剂和脱蜡剂，消除了传统
透明试剂二甲苯对实验人员的危害。用正庚烷处理
材料，透明效果好，浸蜡充分，容易连续切片，脱
蜡快速且干净，染色佳，组织结构保持完整。因此，
正庚烷可以作为一种新的、相对安全有效的二甲苯
代替物，应用于植物组织切片中。
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A
B
b
c d
e f
g h
10 μm
30 μm 30 μm
30 μm30 μm
10 μm 10 μm
10 μm
a ：花药原基细胞开始分裂；b-d ：四分体花粉的形成过程；e-g ：成熟花粉
的形成过程；h：花粉散出
图 4 发育前期（A）及后期（B）的拟南芥花药
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6134
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（责任编辑 马鑫）