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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):186-193
收稿日期 ：2015-10-13
基金项目 ：教育部平台科技资助项目（fykf201514）
作者简介 ：刘金辉，女，硕士，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：18702279956@163.com
通讯作者 ：姜岩，男，教授，研究方向 ：环境生物技术，E-mail ：yanjiang88@126.com ；王海宽，男，教授，研究方向 ：应用微生物，E-mail ：
hkwang@aliyun.com
施氏假单胞菌 PS59 产脂肪酶发酵条件及脂肪酶洗涤
性能优化
刘金辉1，2  李晓路2  姜岩1  王海宽2
（1. 重庆工商大学废油资源化技术与装备工程研究中心，重庆 400060 ；2. 天津科技大学生物工程学院，天津 300457）
摘 要 ： 旨在对施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）PS59产脂肪酶发酵培养基进行单因子优化及响应面分析，选择出最佳
的碳氮源，并分别对加酶量、洗涤时间、洗涤温度、洗涤 pH和表面活性剂添加量对脂肪酶洗涤效果的影响进行评估，确定各个
因素最佳值。结果表明，实验室培养施氏假单胞菌产脂肪酶的最佳碳氮源分别为蔗糖和大豆蛋白胨。优化发酵培养基配方为（g/L）：
大豆蛋白胨 22.39 g，蔗糖 10 g，K2HPO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，无水 CaCl2 0.05 g，橄榄油 8.1 g，pH 8.1，培养温度 30℃，
培养 36 h获得平均脂肪酶产量为 36.12±1.32 U/mL，相对于起始酶活 15.65±4.81 U/mL，产量提高了 1.3倍。确定最佳洗涤效果加
酶量为 100 U，最佳洗涤温度为 25℃，最佳洗涤时间为 25 min，洗涤 pH对该脂肪酶洗涤效果影响不大。在最佳洗涤条件下，加酶
洗涤液的洗涤效率可以提高 30%-40%。
关键词 ： 施氏假单胞菌；脂肪酶；发酵条件优化；洗涤性能优化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.027
Optimization of Fermentation Conditions of Lipase-producing
Pseudomonas stutzeri PS59 and Washing Performance of the Lipase
LIU Jin-hui1，2 LI Xiao-lu2 JIANG Yan1 WANG Hai-kuan2
（1. Engineering Research Center for Waste Oil Recovery Technology and Equipment，Chongqing Technology and Business University，
Chongqing 400060 ；2. College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457）
Abstract: It is aimed to optimize the fermentation conditions and detergent performance of lipase-producing Pseudomonas stutzeri PS59.
The single-factor experiments and response surface analysis were adopted to select the best carbon and nitrogen sources. The impacts of enzyme
dosage，time，temperature，pH，and adding dose of surface active agent on lipase detergent performance was also primarily evaluated for
determining the optimal value of each factor. The results showed that the optimal carbon and nitrogen sources for producing lipase in laboratory
culturing P. stutzeri for producing lipase were sucrose and soybean peptone. The optimal fermentation medium formula（g/L）were ：soy
peptone 22.39 g，sucrose10 g，K2HPO4·3H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.5g，anhydrous CaCl2 0.05 g，olive oil 8.1 g，pH 8.1，temperature
30℃，and fermentation time 36 h，the average enzyme yield reached 36.12±1.32 U/mL，comparing with the original yield 15.65±4.81
U/mL，it increased by 1.3 times. To achieve the best washing effect，the optimal enzyme dosage was 100 U，the optimal washing time and
temperature were 25 min and 25℃，respectively. Washing pH had little effect on the detergent performance. Under the optimal washing
conditions，the washing performance while adding enzyme improved by 30%-40%.
Key words: Pseudomonas stutzeri ；lipase ；optimization of fermentation conditions ；optimization of washing performance
2016,32(7) 187刘金辉等：施氏假单胞菌 PS59 产脂肪酶发酵条件及脂肪酶洗涤性能优化
脂肪酶（lipase，EC3.1.1.3），是一类广泛存在
于微生物及动植细胞中的特殊酯键水解酶，可以催
化水解甘油三酯生成甘油二酯、单甘酯、甘油及游
离脂肪酸［1］。根据现有文献资料初步统计，细菌有
28 个属，放线菌有 4 个属，酵母菌有 10 个属，其
他真菌有 23 个属，共计达 65 个属的微生物能产生
脂肪酶［2］。由于微生物脂肪酶具有较大的商业潜在
的需求，微生物脂肪酶的相关研究也逐渐增加［3］。
目前碱性脂肪酶主要用于洗涤剂行业，洗涤剂
中添加适量的碱性脂肪酶不仅可以明显提高洗涤剂
的洗涤性能，而且对衣物保养，抗再污染等方面有
显著效果，加脂肪酶洗涤剂可以代替传统化学制剂
应用可以降低自然承受能力，减少环境污染，因此
筛选出高产高洗涤能力的脂肪酶菌株，是现如今迫
切的需求。从微生物资源中筛选一株高洗涤活性脂
肪酶的产生菌株是研究高洗涤活性脂肪酶的前提条
件，对其生长特性和酶学特性进行研究，拓宽高洗
涤活性脂肪酶的应用领域，对其工业化开发具有重
要的意义。而细菌发酵生产脂肪酶受多种条件影响，
这些条件能够促进或抑制脂肪酶的产量。为了达到
最大脂肪酶产量，除 pH、温度、接种时间、接种量、
转速等多种物理因素外［4，5］，各个生化因素也必须
优化。而洗涤剂中酶的洗涤性能也取决于各种因素，
如洗涤剂 pH 值、离子强度、清洗温度、洗涤剂组成、
洗涤程序和洗涤水硬度等［6］。
本实验对施氏假单胞菌产脂肪酶发酵培养基进
行单因子优化，选择出最佳的碳氮源。选用 N=20
的 Plackett-Burman 设计，考察各个因素的主效应和
交互作用。根据 Box-Behnken 的中心组合设计原理，
由 Plackett-Burman 设计确定的 3 个主要影响因素各
取三水平，设计三因素三水平共 17 个试验点的响应
面分析，最终确定最佳培养基配方，并对施氏假单
胞菌 PS59 脂肪酶的洗涤性能进行评估，确定加酶量、
洗涤时间、洗涤温度、洗涤 pH 和表面活性剂添加
量等影响因素的最佳值，旨在为该菌株产脂肪酶的
大规模培养及应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 实验室自筛菌种，经鉴定为施氏假单
胞菌（Pseudomonas stutzeri），编号 PS59。
1.1.2 培养基 初始发酵培养基（g/L）：蛋白胨 20，
蔗 糖 10，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.5， 无
水 CaCl2，0.05，大豆油 5，pH 8.5。
优化发酵培养基（g/L）：大豆蛋白胨 22.39，蔗
糖 10，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.5， 无 水
CaCl2，0.05，橄榄油 8.1，pH8.1。
1.1.3 主要试剂 葡萄糖、糊精、K2HPO4、Tween-
80 购于天津市北方化玻购销中心 ；玉米淀粉、可溶
性淀粉、麦芽糖、大豆蛋白胨尿素购于天津北方天
医化学制剂厂 ；蔗糖、大豆饼粉、干酪素、CaCl2 购
于天津市天大化工实验厂 ；蛋白胨购于天津科瑞思
化学试剂公司 ；酵母浸出粉、MgSO4·7H2O 购于天
津市化学试剂一厂 ；（NH4）2SO4 购于北京光复精细
化工有限公司 ；橄榄油购于西班牙 Moreno 公司 ；乙
酸钠，购于国药集团化学试剂 ；大豆油购于天津市
中英保健食品有限公司。所用试剂均为分析纯。
1.1.4 仪器设备 酶标仪（美国 Thermo 公司）；HH-
B11-420 型电热恒温培养箱（天津市实验仪器厂）；
GL20A 型高速冷冻离心机（湖南湘仪）；TGL-16C 台
式离心机（上海安亭科技仪器厂）；HS-1300-V 型超
净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；AB204-S
型分析天平（梅特勒 - 托利多仪器上海公司）；CHB
型普通光学显微镜、显微镜（日本 OLYMPUS 公司）；
pH 计（梅特勒 - 托利多仪器上海公司）；UV-Vis 分
光光度计（天德科技有限公司）；SP-2012UV 型紫外
可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；HYG-II
型回转式恒温调速摇瓶柜（上海欣蕊自动化设备有
限公司）。
1.2 方法
1.2.1 施氏假单胞菌菌种制备 无菌条件下从斜面
接一环施氏假单胞菌菌体至含 30 mL 种子培养基的
250 mL 三角瓶中，30℃条件下，置于 180 r/min 的恒
温摇床上培养 6 h，作为液体种子备用。
1.2.2 施氏假单胞菌产脂肪酶培养基优化试验
1.2.2.1 最佳碳氮源选择 根据初始培养基选择不
同的碳氮源进行单因子优化，选择出最佳的碳氮源，
碳源如蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、糊精、
玉米淀粉、乙酸钠，氮源如大豆蛋白胨、黄豆饼粉、
干酪素、酵母浸出粉、尿素、硫酸铵、蛋白胨，利
用这些碳氮源代替初始培养基中的碳氮源进行发酵
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7188
培养，测定酶活选择最佳碳氮源。
1.2.2.2 Plackett-Burman（PB） 设 计 根 据 前 期 实
验及相关文献报道，选取影响发酵培养的可能因素，
包 括 大 豆 蛋 白 胨、 蔗 糖、MgSO4、K2HPO4、CaCl2、
橄榄油等 10 个因素进行全面考察，选用 N=20 的
Plackett-Burman 设计，考察各个因素的主效应和交
互作用，确定重要影响因素。
1.2.2.3 响应面分析 根据 Box-Behnken 的中心组合
设计原理，由 Plackett-Burman 设计确定的 3 个主要
影响因素各取三水平，设计三因素三水平共 17 个试
验点的响应面分析。
1.2.3 分光光度法测脂肪酶活力 A 液 ：浓度为 3
mg/mL 棕榈酸对硝基酚酯的异丙醇溶液。B 液 ：1%
TritonX-100 的磷酸缓冲液（100 mmol/L，pH8.0）。
底物溶液（1.9 mL）由 A 液和 B 液按 1∶9 比
例混合，并于 30℃预处理 5 min 后加入 0.1 mL 稀
释到一定浓度的酶液反应 15 min，于 -20℃终止 7
min。之后取 200 μL 反应液加至 96 孔板中，利用酶
标仪在 400 nm 下测定溶液吸光度（以加失活酶的
溶液作为对照）。该法单位酶活定义为每分钟释放 1
μmol/min 对硝基酚所需酶量。
1.2.4 洗涤试验方法 准备 10 × 5 白色棉布若干，
经过沸腾氯仿处理 4 h 确定所有脂质去除。在棉布
两面各加入 0.5 mL 橄榄油丙酮溶液（100 mg/mL）
放置 15 min 晾干。将棉布放入放入装入 100 mL 洗
涤液的 250 mL 三角瓶中，30℃，180 r/min 保温 1 h。
去污力计算公式：去污率 %=（Wb-Wa）/（Wb-
Wc）×100% ，其中，Wa 和 Wb 分别代表棉布滴油
前后重量，Wc 代表油布洗涤完后重量。
2 结果
2.1 不同碳氮源对产酶的影响
在碳氮源单因子实验中，不同类型的碳氮源对
脂肪酶产量的影响不同。从图 1 中可知，有机碳源
对脂肪酶产量的影响要明显高于无机碳源，而有机
碳源蔗糖在培养基中的添加，脂肪酶达到最大产量
为 14.3 U/mL，其次添加麦芽糖时，脂肪酶产量达
12.4 U/mL。图 2 可见，有机氮源大豆蛋白胨能够显
著的刺激脂肪酶达到最大酶活为 18.7 U/mL。最后，
最佳碳氮源选择分别为蔗糖和大豆蛋白胨。
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图 1 不同碳源（10 g/L）对脂肪酶产量的影响
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20
22䞦⍫U·mL-1  ≞Ⓚ
图 2 不同氮源（20 g/L）对脂肪酶产量的影响
2.2 不同底物对产酶的影响
在起始培养基中以不同的油脂替代起始培养基
中的大豆油并进行发酵培养。利用分光光度法测定
酶活，结果（图 3）显示，橄榄油作为诱导剂的培
养基时的酶活达到最佳酶活为 21 U/mL。
2.3 Plackett-Burman（PB）实验设计
选用实验次数 N=20 的 PB 实验设计，对各种培
养基组成和培养条件（表 1）进行评估。根据 PB 实
验设计，各个因素设置两个水平 ：-1 为低水平，+1
为高水平。表 1 详细描述了各影响因素以及其水平
值，响应值为各实验所得脂肪酶酶活。
采用回归分析法去检测各个因素对脂肪酶产量
影响的显著性（P<0.05），实验结果（表 2）显示，
在 20 次实验中，脂肪酶产量有较大的变化（6.07-
19.65 U/mL）。该变化说明了培养基优化获得较高脂
2016,32(7) 189刘金辉等：施氏假单胞菌 PS59 产脂肪酶发酵条件及脂肪酶洗涤性能优化
肪酶产量的重要性。由表 1 中的 t 值和 P 值分析可
知大豆蛋白胨、橄榄油和起始 pH 值对脂肪酶产量
具有最显著性的影响。
2.4 最陡上升法
为了能够快速的达到各因素的最佳水平，表 3
描述了一种最陡上升法，使主要影响因素同时向响
应值增大的方向去接近最大脂肪酶产量区域。针对
PB 实验筛选出的 3 种影响最显著因素进行最陡上升
实验，结果（表 3）显示，1、2、3 号实验时，脂肪
酶产量逐渐增加并达到最大值，而 4 号实验脂肪酶
产量降低。因此 2 号实验中 3 因素实验值接近最大
脂肪酶产量区域。
2.5 响应面分析法
根据上述 PB 实验和最陡上升实验确定了对脂
肪酶产量影响显著因素即大豆蛋白胨（A）、橄榄
油（B）、起始 pH（C）及其相应的相对较优水平值。
然后利用 Box-Behnken 设计的响应面分析法去测定
影响脂肪酶产量的这些因素的最优值。利用 Desigh-
Expert7.0 数理统计软件产生共 17 组实验。所有变量
中间水平值编码为 0，最高水平和最低水平值分别
被编码为 +1 和 -1，全部实验计划及其实际值见表 2-
表4。每组实验的响应值为 3 组平行试验值的平均值。
采用 Box-Behnken 法设计，设计了 3 因素 3 水
平 17 个试验点（在中间点上包括 5 个重复实验）用
于拟合二次响应面，表 4 详细描述了设计模型和相
应的实验数据。通过 Design-Expert 数理统计软件对
实验结果将进行数据方差分析并建立二次响应面回
归模型，二次回归方程如下 ：
Y = 3 4 . 2 3 + 2 . 3 9 × A + 2 . 2 1 × B + 3 . 2 2 × C -
བྷ䉶⋩ йб䞨⭈⋩䞟 ⁴ᾴ⋩ 㣡⭏⋩ ἅᾸ⋩ 㣕ᵛ⋩0510152025䞦⍫U·mL-1  ᓅ⢙
图 3 不同底物（5 mL/L）对脂肪酶产量的影响
表 2 十因素 PB 实验结果
实验次数
脂肪酶产量 /（U·mL-1）
实验值 预测值
1 14.70±3.12 17.20
2 17.37±2.11 18.39
3 6.07±2.27 8.60
4 16.28±2.97 13.47
5 19.06±2.38 20.71
6 6.77±2.36 7.58
7 15.88±2.99 13.53
8 20.15±1.95 20.59
9 15.98±2.68 15.02
10 19.35±1.04 17.33
11 16.88±2.93 16.60
12 16.38±2.19 14.23
13 7.76±0.96 9.24
14 6.07±1.93 6.26
15 13.21±2.42 12.28
16 11.42±2.11 13.33
17 19.65±2.11 21.59
18 19.55±3.15 19.26
19 18.66±1.19 16.16
20 19.16±2.68 18.99
表 1 PB 实验中的各个变量及水平值
编号 因素
水平值
系数 t 值 P 值
-1 +1
X1 大豆蛋白胨 /（g·L
-1） 10 20 1.16 4.07 0.003*
X2 蔗糖 /（g·L
-1） 5 10 -1.38 -1.95 0.083
X3 MgSO4/（g·L
-1） 0.5 2 -6.43 -0.57 0.585
X4 K2HPO4/（g·L
-1） 1 2 2.28 0.40 0.698
X5 CaCl2/（g·L
-1） 0.05 0.1 0.04 0.00 0.997
X6 橄榄油 /% 0.5 1 -42.89 -3.78 0.004*
X7 起始 pH 6 9 11.20 5.92 0.000*
X8 发酵时间 /h 36 48 0.49 1.03 0.329
X9 发酵温度 /℃ 26 30 -3.53 -2.48 0.035
X10 接种量 /% 1 2 -0.095 -0.02 0.987
注 ：* 说明该因素影响结果是显著的
表 3 最陡上升实验及相应的响应值
实验
编号
A 大豆蛋白胨 /
（g·L-1）
B 橄榄
油 /%
C 起始
pH
脂肪酶产量 /
（U·mL-1）
1 18 0.4 7 9.17±1.54
2 20 0.6 7.5 11.53±2.41
3 22 0.8 8 19.41±1.35
4 24 1 8.5 13.39±2.55
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7190
1.95×A×B+0.15×A×C-2.65×B×C-5.72×A2-
6.37×B2-7.57×C2 （式 1）
式中，Y ：脂肪酶产量（U/mL），A ：大豆蛋白
胨（g/L），B ：橄榄油（%），C ：起始 pH。
利 用 Design-Expert 设 计 软 件 进 行 F 检 验 和 方
差分析进而对二次响应面回归方程的统计学显著性
进行评估。由表 5 可知，模型 F 值为 22.22，失拟
度 F 值为 0.23。高 F 值和不显著的失拟度证明该预
测模型拟合度较好。并且模型（0.0002）和失拟度
（0.8718）的 P 值也证明了所获得实验结果与模型预
测也有较好的一致性。该模型的拟合效果也通过决
定系数（R2）来测定。该方程决定系数 R2=0.9662，
说明约有 4.38% 不满足该模型对脂肪酶产量的预测。
该值说明了二次响应面回归模型具有较好的精度和
预测能力。校正决定系数 R2Adj=0.9227 和预测决定
系数 R2Pre=0.8755 也满足于确保该模型的显著性的条
件。因此利用该模型分析响应趋势被认为是合理的。
每个变量由回归分析计算所得模型相关系数见
表 6。该表详细描述了所有单项、平方项和交互项
的回归系数。显著水平设置为 5%。
表 6 用于优化脂肪酶产量的二次多项式模型的回归分析结
果
因素 相关系数 标准误差 F 值 P ＞ F
截距 34.23 0.91 22.22 0.0002
A 2.39 0.72 11.11 0.0125
B 2.21 0.72 9.46 0.0179
C 3.22 0.72 20.10 0.0029
AB -1.95 1.01 3.67 0.0968
AC 0.15 1.01 0.022 0.8867
BC -2.65 1.01 6.82 0.0349
A2 -5.72 0.99 33.41 0.0007
B2 -6.37 0.99 41.44 0.0004
C2 -7.57 0.99 58.53 0.0001
为了更加形象的描述回归模型中响应值和各个
变量不同水平，图 4 展示出了脂肪酶产量的响应面
三维立体图及其响应的等高线图。每个图呈现出两
个因素（其他因素保持在 0 水平）对响应值的影响。
正如响应面三维立体图所示，每对变量都具有较好
的交互作用。
根据典型相关分析，由该模型预测结果显示，
在起始 pH、大豆蛋白胨和橄榄油分别设定为 8.1、
22.39 g/L 和 0.81% 时获得最大脂肪酶产量。脂肪酶
产量最大预测值为 34.89 U/mL。
为了确定优化结果，利用优化后的培养基及培
养条件进行发酵平行 3 次。获得平均脂肪酶产量为
36.12±1.32 U/mL，与该模型的计算值基本相符，因
而该模型预测该菌株发酵生产脂肪酶是较精确和合
理的。并且相对于起始培养基和培养条件所获得的
酶活 15.65±4.81 U/mL，产量提高了 1.3 倍。
2.6 脂肪酶洗涤性能优化
2.6.1 加酶量对去污率的影响 通过改变脂肪酶酶
量的添加，来测定去污率的变化。结果（图 5）表明，
当脂肪酶添加量大于 100 U 时，其去污率几乎保持
表 4 Box-Behnken 优化实验设计及其结果
实验编号 A/ （g·L-1） B/% C
脂肪酶产量 /（U·mL-1）
实测值 预测值
1 20 0.8 8.5 21.22±2.18 20.62
2 22 0.9 7.5 20.91±1.54 22.93
3 22 0.7 7.5 12.28±2.15 11.22
4 20 0.7 8.0 14.97±2.38 15.59
5 22 0.8 8.0 35.33±1.50 34.23
6 22 0.8 8.0 34.76±1.61 34.23
7 24 0.9 8.0 25.42±1.77 24.80
8 20 0.8 7.5 16.04±1.77 15.48
9 22 0.8 8.0 36.47±1.31 34.23
10 20 0.9 8.0 24.36±2.39 23.90
11 22 0.8 8.0 34.58±1.88 34.23
12 22 0.7 8.5 24.97±1.17 23.95
13 22 0.9 8.5 23.00±2.14 23.07
14 22 0.8 8.0 29.99±1.20 34.23
15 24 0.7 8.0 23.81±1.92 24.27
16 24 0.8 7.5 20.36±1.04 19.97
17 24 0.8 7.5 26.14±1.31 26.70
表 5 脂肪酶产量的拟合二次响应面回归模型的方差分析
方差来源 方差总和 自由度 平均方差 F 值 P ＞ F
模型 823.88 9 91.54 22.22 0.0002
失拟度 4.23 3 1.41 0.23 0.8718
纯误差 24.61 4 6.15
总误差 852.72 16
注 ：R2=0.9662，R2Adj=0.9227，R
2
pre=0.8755
2016,32(7) 191刘金辉等：施氏假单胞菌 PS59 产脂肪酶发酵条件及脂肪酶洗涤性能优化
A
B
C
脂
肪
酶
产
量
/U·mL-1 
脂
肪
酶
产
量
/U·mL-1 
脂
肪
酶
产
量
/U·mL-1  脂肪酶产量/U·mL-1
脂肪酶产量/U·mL-1
脂肪酶产量/U·mL-1
A˖བྷ䉶㳻ⲭ㜘/g·mL-1
A˖བྷ䉶㳻ⲭ㜘/g·mL-1
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B˖⁴ᾴ⋩/% B˖⁴ᾴ⋩/%
C˖pH
C˖pH C˖pH
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7.90
7.70
7.50
8.50
8.30
8.10
7.90
7.70
7.50
8.50
8.30
8.10
7.90
7.70
7.50
C
˖pH 8.508.308.10
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7.70
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0.75
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24.00
20.00 21.00 22.00 23.00 24.00
图 4 大豆蛋白胨含量、橄榄油含量和初始 pH 值及其交互作用对脂肪酶产量影响的响应面曲线和等高线图
不变，而加酶量在 25-100 之间，去污率稳定的增加。
起始除油速率增加原因在于疏水甘油酯与脂肪酶的
水溶液的不断增加的界面面积。由于滴加在棉布上
的定量橄榄油表面积可以认为是不变的，因此当脂
肪酶增加到一定的浓度时其受限于油水界面而去油
率保持不变。因此确定 100 U 为 100 mL 洗涤液的最
佳添加量。
2.6.2 洗涤温度对去污率的影响 洗涤温度对加酶
洗涤剂去污率的影响很大。从洗涤温度与去污力的
关系图中（图 6）得知，只含脂肪酶的 BL 洗涤液
最佳洗涤温度为 20℃，其与该脂肪酶水解反应最适
温度一致。而加酶和洗涤剂的 BDL 洗涤液的去污
率在一定的温度范围内随温度的增加而增加。并于
25℃去污率达到最大值。因此确定最佳洗涤温度为
25℃。
2.6.3 洗涤时间对去污率的影响 利用 4 种洗涤液
对污布分别处理 15、20、25 和 30 min。根据去污率
公式计算出污率，并根据去污率与时间关系绘制柱
形图。由图 7 可知，除了仅含缓冲液的 B 洗涤液，
其他 3 种洗涤液去污率都会随时间的增长而稳定的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7192
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a=B ；b=B+D ；c=B+D+L（25 U）；d=B+D+L（50 U）；e=B+D+L（75 U）；
f=B+D+L（100 U）；g=B+D+L（125 U）。其中 B：磷酸缓冲液；D：1%SDS 溶液；
L ：脂肪酶 ；其余补水
图 5 脂肪酶添加量对去污率的影响
增加，而洗涤时间的长短对 B 洗涤液的去污率几乎
没有影响。并且，同时加酶和洗涤剂的洗涤液的去
污率在所有时间都高于其他 3 种洗涤液。洗涤时间
超过 25 min 后，去污率没有明显的提高，确定最佳
洗涤时间为 25 min。
2.6.4 洗涤 pH 对去污率的影响 根据不同洗涤液
去污率随 pH 的变化绘制柱形图，结果（图 8）显示，
只含缓冲液的 B 洗涤液的去污率随着 pH 的升高而
稳定增加。BL 洗涤液去污率在 pH7-9 呈递增趋势
而又在 pH9-11 呈递减趋势，并且在 pH9 时达到最
大去污率。其去污效果与 pH 对脂肪酶活性影响一致。
其在 pH7-9 之间去污率的增长原因在于脂肪酶活性
的增加，而随着 pH 超过 9 脂肪酶活性降低从而导
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100৫⊑⦷/% ⑙ᓖ/ć B BL BD BDL
B ：磷酸缓冲液 ；BL ：磷酸缓冲液 + 脂肪酶（100 U）；BD ：磷酸缓冲液
+1%SDS 溶液 ；BDL ：磷酸缓冲液 +1%SDS 溶液 + 脂肪酶（100 U）
图 6 温度对 4 种不同的洗涤液的洗涤效果影响
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100৫⊑⦷/% ᰦ䰤/min B BL BD BDL
B ：磷酸缓冲液 ；BL ：磷酸缓冲液 + 脂肪酶（100 U）；BD ：磷酸缓冲液
+1%SDS 溶液 ；BDL ：磷酸缓冲液 +1%SDS 溶液 + 脂肪酶（100 U）
图 7 不同的洗涤时间对洗涤液洗涤效果的影响
7 8 9 10 11
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70৫⊑⦷/%
pH
B
BL
B ：磷酸缓冲液 ；BL ：磷酸缓冲液 + 脂肪酶（100 U）
图 8 不同 pH 对洗涤效果的影响
致去污率的降低。
2.6.5 SDS 及 TritonX-100 浓 度 对 去 污 率 的 影
响 SDS 及非离子型表面活性剂对去污效率影响试
验的结果表明，在 SDS 浓度为 0.5% 时达到最大去
污率 64.05%，洗涤浓度超过 0.5% 其去污效果逐渐
降低。加酶后的洗涤液随着 TritonX-100 浓度的增加
在一定浓度范围内去污率逐渐增加，当 TritonX-100
浓度达到 0.5% 以上后，其去污率基本不变。
3 讨论
优化产脂肪酶菌株的发酵培养条件，得到更适
于菌体产酶的生长条件，拓宽高洗涤活性脂肪酶的
应用领域，对其工业化开发具有重要的意义。施氏
假单胞菌可利用多种碳源和氮源，其实验室培养产
脂肪酶的最佳碳氮源分别为蔗糖和大豆蛋白胨。有
2016,32(7) 193刘金辉等：施氏假单胞菌 PS59 产脂肪酶发酵条件及脂肪酶洗涤性能优化
机碳源蔗糖使脂肪酶达到最大产量为 14.3 U/mL，有
机氮源大豆蛋白胨能够显著的刺激脂肪酶达到最大
酶活为 18.7 U/mL。橄榄油为最佳诱导剂，使酶活达
到 21 U/mL。以橄榄油为诱导物诱导产脂肪酶菌株生
产脂肪酶与许多相关报道一致［5，7］。通过 Plackett-
Burman（PB）设计和响应面分析确定最佳培养条件，
使脂肪酶产量显著提高。
在各种来源的微生物脂肪酶中，以细菌脂肪酶
催化反应的类型最多、活性最高、稳定性最好，其
中又以假单胞菌属（Pseudomonas）脂肪酶的性能最
为优越［8］。大多数细菌脂肪酶最适作用温度和 pH
范围分别为 35-45℃和 8.0-9.0［9］，而低温碱性脂肪
酶在 pH8.0-10.5，温度 10-35℃的范围内有高催化
活性［10］。例如，产自 Yarrowia lipolytica NCIM 3639
的脂肪酶最适温度为 25℃ ；Acinetobacter sp. strain no
6 脂肪酶最适温度为 20℃ ；Areomonas sp. LPB 4 脂
肪酶最适温度为 10℃。本研究报道的 Pseudomonas
stutzeri PS59 脂肪酶在低温 20℃或更低的温度下能够
保持较高酶活，在 25℃具最佳洗涤性能，并且 pH
对其洗涤效果影响不大，说明该酶具有较宽的 pH
稳定性。此外，该脂肪酶在一定时间内可以稳定存
在于多种离子型和非离子型表面活性剂溶液中，具
备了工业用酶的条件。
4 结论
施氏假单胞菌 PS59 摇瓶发酵最优培养基组成
（g/mL）及条件如下 ：大豆蛋白胨 22.39，蔗糖 10，
K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2 0.05，橄
榄油 8.1，初始 pH8.1，培养温度 30℃，培养时间 36 h，
接种量为 2%。优化后脂肪酶产量为 36.12 U/mL，相
对于起始培养基和培养条件下，产量提高了 1.3 倍。
经洗涤性能评估，确定最佳加酶量为 100 U，最佳洗
涤温度为 25℃，最佳洗涤时间为 25 min，洗涤 pH
对该脂肪酶洗涤效果影响不大，SDS 浓度为 0.5% 时
达到最大去污率 64.05%，TritonX-100 浓度达到 0.5%
以上后，其去污率基本不变。在最佳洗涤条件下，
加酶洗涤液的洗涤效率可以提高 30%-40%。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）