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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):68-73
原生质体是指去除细胞壁的植物细胞，可以同
整株植物一样进行正常的生理反应和细胞活动［1］，
是多功能的植物遗传改良的重要实验体系之一，在
研究细胞生理过程和活动中发挥着重要的作用，如
细胞壁的合成，细胞分裂、分化［1］，光合作用［2］，
钙离子信号调控［3］，蛋白质亚细胞定位［4］和完整细
胞器的分离［5］。应用原生质体为受体进行的遗传操
作必须建立在其有效分离的技术基础之上。原生质
体分离的方法主要有机械法和酶解法两种，机械法
分离原生质体的过程非常复杂且产量低，而酶解法
可以在短时间内非常容易地分离出大量的原生质体，
因此目前常用酶解法分离原生质体。从 Cocking 等［6］
首次采用酶解法成功地分离原生质体至今，已经成
功应用此法分离到了多种植物的原生质体，如拟南
芥［1］、烟草［7］、水稻［8］、一品红［9］及番茄［10］等。
普通小麦（T.aestivum. L）是世界上种植面积最
大的粮食作物，由于其具有遗传上的高度杂合性、
染色体的多种倍性和来源广泛等特点，使其原生质
体培养一直受到重视，成为小麦育种的重要手段之
一，通常小麦的悬浮培养细胞和愈伤组织常用来作
收稿日期 ： 2015-06-28
作者简介 ：席海秀，女，硕士研究生，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：haixiuxi@yeah.net
通讯作者 ：佟少明，男，副教授，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：tongsm@163.com
普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化
席海秀  艾可筠  佟少明
（辽宁师范大学生命科学学院 辽宁省植物生物工程重点实验室，大连 116081）
摘 要 ： 以 7 日龄小麦幼苗的叶肉细胞为材料，采用正交试验分析了纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解时间、甘露醇浓度
对原生质体分离时的产量和活力的影响 ；采用瞬时表达技术通过 PEG-Ca2+ 介导法转化小麦的原生质体，分析了 PEG 浓度对转化效
率的影响。结果表明，小麦叶片原生质体分离的最佳条件为纤维素酶 1.5%，离析酶 0.75%，甘露醇 0.4 mol/L，酶解时间 3 h，得到
的原生质体的产量可达到 7.2×106 个 /g·FW，活力超过 95% ；瞬时表达实验结果表明，在 25% PEG 浓度下，小麦原生质体的转
化效率最高。
关键词 ： 普通小麦 ；原生质体 ；分离 ；瞬时表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.008
The Optimization of Isolation Method for Mesophyll Protoplast from
Common Wheat（Triticum aestivum）Seedlings
XI Hai-xiu AI Ke-jun TONG Shao-ming
（School of Life Sciences，Liaoning Normal University，The Key Laboratory of Plant Biotechnology of Liaoning Province，Dalian 116081）
Abstract: By orthogonal test，we analyzed the effects of concentrations of cellulose，macerozyme，and mannitiol as well as the time
of enzyme digestion on the productivity and vitality during the isolation of protoplast from 7 days of wheat seedling mesophyll. Further，the
transient expression technology was employed to analyze the effects of PEG concentration on the transformation efficiency by PEG-Ca2+-mediated
transformation of mesophyll. The results showed that the optimal condition for isolating the mesophyll from wheat leaves was ：1.5% of cellulase，
0.75% of macerozyme，0.4 mol/L mannitol，and 3 h of enzyme digestion ；the protoplast yield was 7.2×106 cells/g·FW，the vitality was
more than 95%. The results from the transient expression technology revealed that transformation efficiency was the highest under 25% PEG.
Key words: common wheat ；protoplast ；isolation ；transient expression
2016,32(4) 69席海秀等：普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化
为分离原生质体的材料［11］，但应用这两种材料分离
原生质体耗时长，操作繁琐，且经酶解后仍有很多
未酶解的组织，细胞和已破碎的物质对原生质培养
和进一步的遗传转化等极为不利［12］。目前，仅有少
数的报道对小麦叶肉细胞原生质体的分离方法进行
了研究。本研究以 7 日龄小麦的叶肉细胞为材料，
对分离原生质体过程中使用的酶浓度、酶解时间及
酶解液中甘露醇浓度等因素进行研究，建立了最佳
的小麦叶肉细胞的原生质体制备体系，旨为进一步
的细胞培养和融合及以原生质体为受体材料而进行
的各种遗传操作提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
实 验 材 料 为 普 通 小 麦（T. aestivum L） 品 系
CAU981，用 5％的次氯酸钠对种子进行表面消毒处
理 10 min，蒸馏水冲洗 3 遍，置于 4℃冰箱中黑暗
培养 3 d 后，将种子分散放置在盛有水的托盘里，
水分以没过种子为准，置于培养室（温度 25℃，相
对湿度 60％，16 h 光照 /8 h 黑暗，光强 250 μmol·
m-2·s-1）中培养。取播种后生长至第 7 天的麦苗的
叶片及叶鞘部分作为实验材料（图 1-A）。
实验所用载体是在 pBI221 基础上改造而成，由
烟草花叶病毒 35S 启动子、萤火虫荧光素酶基因和
NOS 终止子构成。
1.2 方法
1.2.1 小麦叶肉原生质体分离 取 2 g（约 50-60 株）
麦苗，用新的手术刀片切成 0.5-1 mm 细条 ；立即将
切好的材料浸没在 0.4 mol/L 甘露醇中，黑暗处理 10
min ；弃掉甘露醇后，将细条培养在装有 20 mL 酶解
液的三角瓶中 ；用锡纸将三角瓶包好，黑暗条件下
用真空干燥器抽真空 30 min，使细条完全浸没在酶
解液中（图 1-B）；将三角瓶置于摇床中，在室温黑
暗条件下以 60-80 r/min 转速振荡酶解 ；当酶解液变
绿后 2 h 在显微镜下观察原生质体分离情况，每隔
0.5 h 检测一次，约 3 h 原生质体可充分释放（图 2）。
1.2.2 小麦叶肉原生质体纯化 酶解结束后，用
等 体 积 的 W5 洗 液［2 mmol/L MES（pH5.7）；154
mmol/L NaCl ；125 mmol/L CaCl2 ；5 mmol/L KCl］，稀
释酶解液 ；将原生质体悬浮液经 200 目（0.75 μm）
的尼龙过滤网（提前用 W5 洗液润洗）过滤到 50 mL
的离心管中去除未酶解的组织，每次用 5 mL W5 洗
液冲洗 3-5 次 ；取滤液室温下 100 g 离心 5 min，去
除上清液 ；用 15 mL 的 W5 洗液将原生质体重新悬
浮起来，100 g 离心 5 min，重复操作 3 次洗涤纯化
原生质体 ；最后用 15 mL W5 溶液悬浮原生质体，60
g 离心 5 min 收集原生质体。
1.2.3 小麦原生质体分离条件的优化 依据单因素
试验结果及已报道的文献资料，选取纤维素酶浓度、
离析酶浓度、甘露醇浓度及酶解时间 4 个因素中较
优的 3 个水平进行正交试验设计，通过正交试验确
定小麦原生质体分离的最优条件，实验设计因素水
平，见表 1。
表 1 小麦原生质体分离正交实验设计因素水平表
因素 纤维素酶
浓度 /%
离析酶
浓度 /%
甘露醇浓度 /
（mol·L-1）
酶解
时间 /h
1 1 0.5 0.2 2
2 1.5 0.75 0.4 3
3 2 1 0.6 4
1.2.4 原生质体产量测定 用 5-10 倍的 W5 溶液稀
释收集到的原生质体，取少量原生质体悬浮液滴加
在 0.1 mm 血球计数板上，盖上盖玻片，在光学显微
镜下（10×100）观测，计算 4 个角上大格及中央大
格（共 5 个大格）内的原生质体数目，然后按公式
计算原生质体总数，每个样品重复 3 次，最后计算
A B
A ：生长 7 d 的麦苗，图中圆圈为叶鞘及叶片部分 ；B ：完全浸在的酶解液
中的麦苗切段
图 1 用于制备原生质体的麦苗及酶解液中的麦苗切段
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.470
出每克材料分离得到的原生质体产量（个 /g·FW）。
原生质体数（个 /mL）=5 个大格内原生质体总
数 ×5×1 000× 稀释倍数
原生质体产量（个 /g）=［原生质体数（个 /mL）×
稀释后体积（mL）］/ 叶片质量（g）
1.2.5 原生质体活力测定 采用 FDA（Sigma）染色
法检测原生质体活力。取 100 μL 原生质体悬浮液，
加入 2 μL 5 mg/mL FDA（丙酮溶解），2-5 min 后在
荧光显微镜下观察［13］，统计发绿色荧光的原生质体
数和原生质体总数。原生质体活力以一个视野中有
活力的原生质体占该视野中原生质体总数的百分数
来表示，随机选取 3 个视野进行统计。
原生质体活力 =（发绿色荧光的原生质体数 / 原
生质体总数）×100％
1.2.6 小麦原生质体转化 将原生质体悬浮液 200 g
离心 5 min，弃上清收集原生质体 ；用 MMG 溶液（4
mmol/L MES ；0.4 mol/L 甘 露 醇 ；15 mmol/L MgCl2）
稀释原生质体至 1×106 个 /mL ；取 100 μL 原生质体
加入到 2 mL tube 管中，每管加入 10 μL 质粒（15-20
μg）混匀 ；加入 110 μL 不同浓度的 PEG-Ca2+ 转化液
（0.2 mol/L 甘 露 醇 ；100 mmol/L CaCl2 ；10%、20%、
25%、30% 和 40% PEG-4000）；23℃暗培养 20 min ；
加 入 440 μL 的 W5 溶 液 终 止 反 应，200×g 离 心 5
min ；弃 上 清， 加 入 260 μL 的 WI 溶 液（4 mmol/L
MES ；0.5 mol/L 甘露醇 ；5 mmol/L KCl），混匀后加
入到 24 孔板（BSA 洗液润洗），23℃暗培养 24 h。
1.2.7 荧光素酶基因瞬时表达检测 荧光素酶基因
瞬时表达检测采用荧光素酶检测试剂盒（Promega，
USA）在发光仪（Berthold，Germany）上检测所发
荧光的强度，检测过程参照说明书，略加修改。
将用液氮快速冷冻转化后过夜培养的原生质体，
充分研磨 ；加入 100 μL CCLR（试剂盒中试剂）重
新悬浮并匀浆 ；平衡至室温后 1 000×g 离心 2 min ；
取上清，弃碎片，加入 200 μL 裂解液和 100 μL 检
测试剂 ；混匀后，于发光仪上检测荧光素酶活性。
2 结果
2.1 小麦原生质体最佳分离条件的确定
在设定的水平范围内，根据正交实验结果，对
小麦原生质体的产量和活性进行极差分析，确定纤
维素酶、离析酶、甘露醇浓度及酶解时间 4 个因素
对小麦原生质体产量及活性的影响（表 2）。
表 2 正交试验结果及极差分析
实验组数 纤维素酶 /% 离析酶 /% 甘露醇 /（mol·L-1） 酶解时间 /h 产量 /（个 /g·FW） 活性 /%
1 1 0.5 0.2 2 3.90×106 95.37
2 1 0.75 0.4 3 5.08×106 96.50
3 1 1 0.6 4 4.33×106 96.18
4 1.5 0.5 0.4 4 5.77×106 96.42
5 1.5 0.75 0.6 2 5.74×106 96.56
6 1.5 1 0.2 3 5.93×106 95.13
7 2 0.5 0.6 3 5.02×106 96.32
8 2 0.75 0.2 4 5.42×106 96.34
9 2 1 0.4 2 5.34×106 95.84
K1 1.33×107 1.47×107 1.53×107 1.50×107
K2 1.74×107 1.62×107 1.62×107 1.60×107
K3 1.58×107 1.56×107 1.51×107 1.56×107
R 4.1×106 1.5×106 1.1×106 1.0×106
从表 2 中的极差分析可知，纤维素酶浓度的 R
值最大，说明这几个因素中纤维素酶浓度对小麦叶
片原生质体分离影响最大 ；其次是离析酶浓度。在
本研究中，选用播种后生长至第 7 天小麦幼苗的叶
片和叶鞘制备原生质体时，酶液组合为 1.5% 纤维素
酶及 0.75% 离析酶，解离 3 h 后分离到的原生质体
2016,32(4) 71席海秀等：普通小麦幼苗叶肉细胞原生质体分离方法的优化
的产量可以达到 7.2×106 个 /g·FW。
2.2 小麦原生质体活力测定
原生质体活力高低是代表原生质体分离质量好
坏的重要指标之一，本研究中采用 FDA 染色法对小
麦原生质体进行染色，染色后发绿色荧光的原生质
体为有活力的原生质体。荧光显微镜下观察大部分
小麦原生质体发出绿光，染色清晰（图 2-D、E、F），
最佳酶解条件下原生质体活力可高达 98%。
A、B 及 C 为光学显微镜下观察分离到的原生质体，分别放大 100 倍、200 倍及 600 倍 ；D、E 及 F 为荧光显微镜下观察分
离的 FDA 染色后的原生质体，分别放大 100 倍、200 倍及 600 倍
图 2 显微镜下观察分离到原生质体及原生质体活力检测
2.3 瞬时表达转化原生质体
本研究将含有改造过的萤火虫荧光素酶的载体
pBI221 通过 PEG-Ca2+ 法转化进入小麦的原生质体，
探讨了不同 PEG 浓度对小麦原生质体的转化效率的
影响。结果（图 3）发现，25% PEG 浓度下小麦原
生质体的转化效率显著的高于其他浓度（P<0.01）
最 高， 其 次 是 30% 和 20% 的 PEG 浓 度，10% 及
40% 的 PEG 浓度的相对较低，其中在 10% 的 PEG
浓度下，小麦原生质体的转化效率最低。
3 讨论
原生质体可以从植物叶片、叶鞘、叶柄、茎等
组织器官中分离出来，由于叶片来源广泛，叶肉细
胞排列松散等特点，是植物原生质体分离的常用材
料［14］。本研究在分别取用播种后水培养 7 d 的小麦
幼苗的叶片和叶鞘分离原生质体时，发现叶片与叶
鞘分离出的原生质体的产量几乎相差无几，但取用
幼茎作材料时，产量显著低于叶片和叶鞘。最适宜
的培养时间为 5-7 d，最佳为 7 d，若低于 5 d 由于
材料过于幼嫩不容易控制酶解时间，同时分离到的
碎片太多不利于后期遗传转化，即使调节酶解液浓
度效果也不明显；超过 7 d 后，相应要增加酶解时间，
可能是叶片幼嫩程度不一致，随着酶解时间的延长，
先分离出的原生质体就会破碎，产生的碎片也不利
于后期遗传转化。因此，在本研究中，我们选用播
种后生长 7 d 左右的小麦幼苗的叶片和叶鞘作为分
离材料时，得到的原生质体的产量最高，质量最佳。
0 10 20 25
PEG⎃ᓖ/% 30 40
1.0×106
8.0×105
6.0×105
4.0×105
2.0×105
0.0
㦗ݹᕪᓖ
图 3 不同浓度 PEG 介导的转化小麦原生质体的瞬时表达
荧光强度
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.472
酶解法是目前植物原生质体分离的主要方法，
酶解材料时，酶液的组成、浓度、渗透压及酶解时
间等因素对原生质体的产量和活力会产生显著的影
响。酶液的组合和浓度要随酶解材料的不同略有差
异［15，16］，孙鹤等［17］以 10 日龄小麦叶片为材料分
离原生质体，最佳酶液组合为 1.5% 纤维素酶及 0.5%
离析酶，酶解 5 h 后产量达 6×106 个 /g·FW。在本
研究中，选用 7 日龄小麦幼苗叶片和叶鞘制备原生
质体，发现酶液组合为 1.5% 纤维素酶及 0.75% 离析
酶，解离 3 h 后产量就可达 7.2×106 个 /g·FW，采
用此酶液的组合在缩短了酶解时间的同时，增加了
原生质体的产量 ；酶解液中渗透压的调节是依赖于
不同浓度的甘露醇来实现的，不适宜的渗透压会造
成原生质体的胀裂或皱缩。在酶液和洗涤液中，广
泛使用的渗透压调节剂浓度约在 0.2-0.8 mol/L［18］。
本实验结果表明，用 0.4 mol/L 甘露醇作为渗透剂有
利于小麦叶肉原生质体渗透压的稳定，分离的原生
质体呈饱满球形，活力较高（图 2-A、C）；酶解时
间是影响原生质体分离的另一重要因素，酶解时间
过短，原生质体释放不充分产量太低，时间过长则
导致较早游离出来的原生质体破裂。本实验中酶解
2 h 后仅有少量原生质体游离出来，超过 3 h 的酶解
时间虽然会使原生质体的产量增加，但细胞碎片增
多，影响原生质体活力，不利于后续融合、转化等
实验。经过综合分析，确定小麦原生质体分离最佳
的酶解时间为 3 h，此时分离的原生质体产量高、碎
片少且均具有较高活性。
除此之外，原生质体分离的过程中还需要考虑
其他的因素，如酶解液的 pH 值、离心力、酶解温
度等。酶解液的 pH 值过低或过高时，产量都不高，
原因是受到酶的活力的影响，纤维素酶的最适 pH
是 5.5-6.0［19］；离析酶有效作用的 pH 是 3.0-7.0［20］，
因此，酶解液的 pH 要同时使两种酶的活性达到最
佳。此外，pH 值还对细胞膜及细胞保护系统有较大
的影响［18］。本研究从上述两方面考虑，确定酶液的
最适 pH 值为 5.6。离心收集原生质体时所用离心力
为 100×g（brake 为 3），离心时间为 5 min 较合适，
实验中发现离心力低于 100 g 无法将原生质体完全
沉淀下来，过大时会使沉淀下来的原生质体压实，
后续无法充分洗涤干净，且会造成原生质体破碎降
低原生质体产量。
活性染色法是测定原生质体活力的方法之一，
其中最常用的是 FDA 和台盼蓝染色。FDA 染色，即
荧光素双醋酸酯染色法，因为 FDA 本身不产生荧光，
且能自由出入完整的细胞膜，当 FDA 进入活细胞后，
被细胞内的酯酶分解生成荧光素，因此有活力的原
生质体能够产生荧光 ；台盼蓝染液可以通过死亡原
生质体的细胞膜而使死亡细胞染成蓝色，但由于染
料无法透过活细胞，因此活细胞不被着色，另外由
于叶绿体的存在，在显微镜下看到的是深蓝色，不
容易同活细胞区分［21］。因此，FDA 比台盼蓝染色更
清晰，且不会受到叶绿体等内含物的干扰，并且适
用于不同来源的原生质体。
影响原生质体转化效率的因素有许多，如原生
质体纯度和活力、质粒 DNA 大小和纯度、DNA 与
原生质体的比例、孵育时间及 PEG 浓度等［17，22］。
PEG 浓度是影响转化率的最重要因素，不同植物，
甚至同种植物不同的供试组织分离到的原生质体，
其转化所需的 PEG 浓度都是存在差异的［23］。据报道，
终浓度为 10%-20% 的 PEG 浓度可使拟南芥原生质
体转化效率达到最佳［3］。有报道表明，25% 的 PEG
浓度对于 10 日龄麦苗分离到的原生质转化率是最高
的［17］，在本研究中，也发现 25% 的 PEG 浓度对于
7 日龄麦苗分离到的原生质体的转化率最高。
4 结论
综合原生质体产量、活力及转化效率等多方面
考虑，确定 7 日龄小麦麦叶肉细胞原生质体分离的
最佳条件为 ：酶解液组合为纤维素酶 1.5％及离析
酶 0.75％，酶液中甘露醇浓度为 0.4 mol/L，酶解时
间为 3 h，原生质体的产量可达 7.2×106 个 /g·FW，
且分离到的原生质体呈饱满球形，淡绿色叶绿体多，
清晰均匀分布在原生质体中，并含有颗粒状内含物，
活 力 较 强， 均 超 过 95%。 在 PEG 浓 度 为 25% 时，
小麦原生质体的转化率是最高的。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）