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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):93-97
黄瓜（Cucumis sativus L.）是一种世界范围内广
泛种植的重要经济作物，但是其产量易受病原微生
物如炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）的影响而
下降。尽管化学杀菌剂可以有效缓解病害损失，但
是农药的大量使用加重了社会和生态负担。
采用诱导剂激活植物细胞防御响应以抵抗病原
微生物侵染是一种较为理想的方法［1］。细胞防御响
应包含一系列的级联过程，包括活性氧粒子的积累、
信号分子浓度增加、苯丙素途径强化以及病程相关
蛋白的生成［2，3］。病程相关蛋白包含多种蛋白酶抑
制剂及水解酶作用于外源微生物而起到防御作用。
苯丙素类物质除激活信号传导以外，还能够改变植
物细胞壁结构以起到屏障作用［4］。
研究表明，β-葡聚糖能够激活多种植物的防御
响应。如昆布多糖和热凝胶寡糖分别被证实能够对
烟草和马铃薯产生诱导作用［5，6］。香菇多糖（Len-
收稿日期 ：2015-06-09
作者简介 ：张文华，女，讲师，研究方向 ：微生物技术与应用 ；E-mail ：1072418227@qq.com
香菇多糖增强黄瓜幼苗对炭疽病菌抗性机理
张文华
（包头轻工职业技术学院，包头 014030）
摘 要 ： 旨在考察香菇多糖诱导黄瓜（Cucumis sativus L. cv. Jinfeng）幼苗叶片细胞产生防御响应的效果。经 0.75 g/L 香菇多
糖处理后，叶片胞内 H2O2 和水杨酸浓度迅速增加，分别在 10 min 和 4 h 达到峰值，随后均逐渐下降至诱导前水平。经香菇多糖诱
导后，胞内抗性相关蛋白 β-1，3- 葡聚糖酶、几丁质酶和苯丙氨酸氨解酶比活性均显著增加，96 h 后酶活力仍然保持较高水平。进
一步研究发现，经香菇多糖诱导后，黄瓜对炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）抗性明显增强。经 2.00 g/L 香菇多糖处理后，叶片
菌斑面积和数量分别显著下降至对照水平的 53.1% 和 51.3%，结果表明香菇多糖具有诱导黄瓜细胞产生防御响应的作用。
关键词 ： 香菇多糖 ；黄瓜 ；防御响应 ；炭疽病菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.015
The Mechanism of Lentinan Enhancing the Resistance of Cucumber
Seedlings to Colletotrichum orbiculare
ZHANG Wen-hua
（Baotou Light Industry Vocational Technical College，Baotou 014030）
Abstract: This study is to investigate the inducing effect of lentinan on the defense responses of cucumber（Cucumis sativus L. cv.
Jinfeng）seedling leaves. The seedlings were treated with 0.75 g/L of lentinan. The concentration of H2O2 and salicylic acid in cells of leaves
increased rapidly and reached the peak levels at 10 min and 4 h，respectively. Afterwards，the levels of both H2O2 and salicylic acid gradually
declined to the ones before treatment. Moreover，the activities of defense related proteins，including β-1，3-glucanase，chitinase，and
phenylalanine ammonia lyase，significantly increased after lentinan induction，and still kept stable after 96 hours. In addition，the resistance
of cucumber treated with lentinan to Colletotrichum orbiculare was notably enhanced after lentinan induction. Both the number and area of lesions
on cucumber leaves significantly decreased to 53.1% and 51.3% in comparison with the control，respectively，which indicated that lentinan
played a role in inducing the defense responses of cucumber cells.
Key words: lentinan ；Cucumis sativus L. cv. Jinfeng ；defense response ；Colletotrichum orbiculare
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.394
tinan，Ltn）是一种线性 β-1，3- 葡聚糖，具有潜在的
激活植物防御响应的活性，但是其对黄瓜细胞是否
具有诱导活性仍需要进一步研究。综上所述，本研
究通过对黄瓜叶片细胞内信号分子浓度以及关键酶
活性的测定，结合黄瓜对炭疽病菌抗性效果统计结
果，对香菇多糖诱导黄瓜细胞防御响应的效果进行
考察，旨在为黄瓜病害的生态防治提供数据支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 黄 瓜 和 菌 种 黄 瓜 植 株（C. sativus L. cv.
Jinfeng）于无菌温室中培养（培养温度 25℃，光照
周 期 16 h/d）。 炭 疽 病 菌（C. orbiculare） 购 自 广 东
菌种保藏中心（广州），菌种培养及孢子收集参照
Zhang 等［7］的方法。
1.1.2 试剂 香菇多糖，蓝色几丁质（Chitin azure），
反式肉桂酸，水杨酸购自 Sigma 公司（美国）；其余
试剂均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。
1.1.3 仪 器 液 相 色 谱 仪 Hitachi CM5000 HPLC
system（日本）；离心机 Sigma 2K5S（美国）。
1.2 方法
1.2.1 不同浓度香菇多糖对炭疽病菌侵染黄瓜幼苗
的抑制 分别以 0.25、0.75 和 2.00 g/L 香菇多糖溶液
均匀喷撒黄瓜幼苗叶片表面，以无菌去离子水作为
空白对照（CK）。喷洒 24 h 后，以浓度为 107 孢子 /mL
C. orbiculare 孢子悬液均匀喷洒叶片表面。培养 168
h 后对叶片病斑数量和病斑面积进行统计。每种处
理采用 10 株马铃薯幼苗，所有植株培养条件一致。
1.2.2 香菇多糖对黄瓜的诱抗作用机理
1.2.2.1 黄瓜叶片处理与取样 以 0.75 g/L 香菇多
糖溶液喷撒培养 6 周的黄瓜幼苗叶片表面，以无菌
去离子水作为空白对照（CK）。然后，分别于喷洒
后剪取叶片用于胞内 H2O2 和水杨酸（salicylic acid，
SA）浓度测定或胞内 β-1，3- 葡聚糖酶、几丁质酶
和 苯 丙 氨 酸 氨 解 酶（phenylalanine ammonia lyase，
PAL）比酶活测定。每项指标测定均采用不同植株
的叶片进行 3 次重复。
1.2.2.2 各 种 诱 抗 物 质 测 定 方 法 （1） 叶 片 胞 内
H2O2 和水杨酸浓度测定 ：H2O2 与 SA 的提取及浓度
测定分别采用 Li 等［8］和 van Spronsen 等［9］报道的
方法。（2）胞内蛋白提取方法 ：称取 200 mg 黄瓜
叶片并迅速于液氮中研磨成粉末，随后加入 1.0 mL
蛋白提取溶液（含有 50 mmol/L 乙酸钠缓冲液，5
mmol/L EDTA，2 mmol/L DTT，0.04% 硫代硫酸钠，
0.1% 聚乙烯吡咯烷酮，pH5.5）并于 4℃震荡溶解
10 min。 然 后 将 混 合 液 于 4℃，10 000×g 离 心 30
min 并收集上清，于 -20℃保存。（3）β-1，3- 葡聚糖
酶活力测定 ：测定反应体系包含 200 μL 10 g/L 昆布
多糖溶液（溶于 50 mmol/L 乙酸钠缓冲液，pH5.0），
200 μL 50 mmol/L 乙酸钠缓冲液（pH5.0）和 100 μL
蛋白提取液。该反应体系于 37℃反应 2 h，随后沸
水浴 10 min 终止反应。反应体系中加入预先灭活
的蛋白提取液作为空白对照。反应体系中每 1 min
生成 1 μg 还原糖的酶量定义为 1 酶活单位（1 U）。
（4）几丁质酶活力测定 ：几丁质酶活力测定采用
Ippolito 等［10］报道的方法。反应体系包含 140 μL 25
g/L 蓝色几丁质溶液（溶于 50 mmol/L 乙酸钠缓冲液，
pH5.0）和 70 μL 蛋白提取液。该反应体系于 37℃反
应 2 h，随后加入 100 μL 2 mol/L HCl 终止反应。（5）
苯丙氨酸氨解酶活力测定 ：PAL 活力测定采用 Wang
等［11］报道的方法。反应体系包含 500 μL 20 mmol/L
L-苯 丙 氨 酸（ 溶 于 50 mmol/L Tris-HCl 缓 冲 液，
pH8.5），400 μL 50 mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.5）
和 100 μL 蛋白提取液。该反应体系于 37℃反应 2 h，
随后加入 200 μL 6 mol/L HCl 终止反应。
1.2.3 统计方法 数据统计采用 SPSS 统计软件（V-
er. 18.0，SPSS Inc.，美国）。单因素方差分析（one-way
ANOVA）用于各测定指标不同处理组之间的比较。
最 小 显 著 差 数 法（least significant difference，LSD）
用于测定指标间显著性分析（显著性水平 P<0.05）。
2 结果
2.1 香菇多糖提高黄瓜对炭疽病菌的抗性
三种浓度的 Ltn 溶液处理黄瓜叶片后对叶片上
炭疽病菌侵染形成的菌斑数量和菌斑面积进行统计，
结果表明经 Ltn 处理后黄瓜植株对炭疽病抗性明显
增加，并且抗性效果随着 Ltn 浓度增加而逐渐增强。
Ltn 浓度达到 0.75 g/L 后，叶片感染面积和病变数量
与对照组相比均显著性下降，而 Ltn 浓度提高至 2.00
g/L 时，与对照组相比抗性效力接近 50%，表现出较
2016,32(3) 95张文华：香菇多糖增强黄瓜幼苗对炭疽病菌抗性机理
为理想的效果。
2.2 香菇多糖浓度对诱抗效果的影响
采用 Ltn 处理黄瓜叶片 24 h 后，胞内 SA 浓度
随着 Ltn 浓度提高而迅速增加（图 1）。采用 0.75 g/L
Ltn 处理叶片后，胞内 SA 达到 1.785 μg/g，而继续
提高 Ltn 浓度，胞内 SA 水平保持稳定。结果表明，
Ltn 浓度 0.75 g/L 是达到稳定诱导效果的临界水平，
后续实验均在此水平条件下进行。
g/L Ltn 处理 24 h 后胞内 β-1，3- 葡聚糖酶比酶活显著
增加至 115 U/mg，诱导 96 h 后酶活下降至 89 U/mg，
但是仍显著高于 CK 水平。另一方面，经炭疽病菌
（CO）处理后，胞内 β-1，3- 葡聚糖酶的酶活水平同
样出现了显著上升，但低于 Ltn 处理组的水平。经
Ltn 和 CO 联合处理（Ltn+CO）的叶片胞内酶活与
Ltn 组处于同一水平。结果表明，Ltn 处理能够模拟
炭疽病菌的侵染作用而提高胞内 β-1，3- 葡聚糖酶的
比酶活，且在 96 h 后仍然处于较高水平。测定表明，
Ltn、CO 和 Ltn+CO 组胞内几丁质酶活性相比于对照
组均有了显著增加，且 3 种处理方式间并无显著性
差异。该结果与 β-1，3- 葡聚糖酶测定结果一致，即
Ltn 能够诱导胞内病程相关蛋白的表达。分别经 Ltn
和 CO 处理后，黄瓜叶片胞内 PAL 活性均产生了显
表 1 香菇多糖诱导黄瓜叶片对炭疽病的抗性效果
处理方式 感染面积 /（mm2/ 片） 相对效力 /% 病斑数量 /（个 / 片） 相对效力 /%
染菌对照 73.6±9.5 - 39.8±7.2 -
Ltn（0.25 g/L） 59.2±8.7 19.6 27.4±6.6 31.2
Ltn（0.75 g/L） 43.6±6.9* 40.8 23.1±7.7* 42.0
Ltn（2.00 g/L） 39.1±8.1* 46.9 20.4±6.8* 48.7
注 ：* 表示显著性水平 P<0.05，下同
2.0
1.5
1.0
0.5
0
≤ᶘ䞨⎃ᓖ/μg·g-1 
0 0.25 俉㧷ཊ㌆⎃ᓖ/g·L-10.50 0.75 1.00 1.25 1.50
图 1 香菇多糖处理黄瓜叶片 24 h 后胞内水杨酸浓度变化
2.3 香菇多糖提高黄瓜胞内信号分子浓度
测定经 Ltn 诱导后黄瓜叶片细胞内 H2O2 和 SA
浓度变化趋势。结果（图 2）显示，经 Ltn 诱导后胞
内 H2O2 浓度急剧升高，至 10 min 后达到峰值，随
后迅速下降。尽管诱导 30 min 后 H2O2 浓度仍高于
诱导前水平但是两者之间无显著性差异。60 min 后
胞内 H2O2 浓度恢复至诱导前水平。胞内 SA 浓度变
化趋势与 H2O2 类似。胞内 SA 水平迅速增加至诱导
4 h 后达到峰值，随后逐渐下降至 120 h 后恢复至诱
导前水平。
2.4 香菇寡糖增强黄瓜胞内抗性蛋白比活性
由图 3 可知，与空白对照（CK）相比，经 0.75
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0
≤ᶘ䞨⎃ᓖ/μg·g-1 
0 20 䈡ሬᰦ䰤/min40 60 80 100 120
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
≤ᶘ䞨⎃ᓖ/μg·g-1 
0 24 䈡ሬᰦ䰤/h48 72 96 120
Lth
CK
Lth
CK
A
B
图 2 香菇多糖处理后黄瓜叶片胞内 H2O2（A）和水杨酸
（B）浓度变化曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.396
著的增加，且 96 h 后仍然保持较高活性。该结果与
β-1，3- 葡聚糖酶和几丁质酶测定结果一致。
成［3，14］。因此，胞内信号分子 H2O2 和 SA 积累水平
产生显著变化是确定细胞防御响应发生的关键指标。
另一方面，胞内一级和二级信号分子 H2O2 和 SA，
浓度分别在 10 min 和 4 h 时达到最高水平，表明胞
内信号放大存在一定的时间滞后效应，该现象与前
述研究结果一致［5，15］。胞内 SA 浓度在 4-96 h 均显
著高于诱导前水平，表明 Ltn 处理能够在较长时间
内对黄瓜叶片细胞的防御响应产生诱导作用。
为进一步验证 Ltn 对黄瓜细胞防御抗性的诱导
作用，本研究考察了经 Ltn 处理后胞内 3 种与防御
相关的典型蛋白的酶活性的变化情况。葡聚糖酶因
能够水解致病性真菌细胞壁的主要组分 β-1，3- 葡
聚糖而具有较高的抗真菌活性，属于病程相关蛋白
PR-2 家族［16］。同时，β-1，3- 葡聚糖水解后的寡糖
能够进一步作为诱导子强化植物的防御响应［17］。几
丁质酶属于病程相关蛋白 PR-3、-4、-8 和 -11 家族［16］，
作用于病原菌细胞壁以保护植物自身组织［18］。苯丙
氨酸氨解酶（PAL）催化 L-苯丙氨酸脱氨基生成反
式 - 肉桂酸，是苯丙素途径的关键酶［19］。而苯丙素
途径的产物和中间物除作为物理和化学屏障以防御
病原菌侵染外，还能够激活局部信号通路以强化诱
导基因的表达［4］。因此，PAL 活性是评价植物防御
响应的重要指标。分析表明，香菇多糖处理能够显
著激活黄瓜胞内抗性相关蛋白的活性。
测定结果表明，Ltn 处理能够显著提高黄瓜叶
片胞内信号分子浓度，同时对细胞防御响应相关蛋
白的表达产生显著促进作用。采用 Ltn 处理黄瓜叶
片后，胞内防御相关蛋白的表达与经炭疽病菌处理
组具有相同水平。由此可知，预先采用 Ltn 处理黄
瓜叶片具有增强植物防御炭疽病菌侵染的潜在作用。
而炭疽病菌侵染实验表明，经 Ltn 处理后叶片感染
面积和病变数量与对照组相比均显著性下降。
4 结论
香菇多糖 Ltn 处理能够显著提高黄瓜叶片胞内
信号分子浓度，对细胞防御响应产生激活作用，能
够显著激活黄瓜胞内抗性相关蛋白的活性，并能显
著降低叶片被病原菌感染面积和病变数量。由上可
知，香菇多糖预处理明显提高黄瓜对炭疽病菌的抗
性。作为一种环境安全性的生物多糖，香菇多糖具
120
100
80
60
40
20
0β-
1,
3-
㪑㚊㌆∄䞦⍫/U·mg-1  䈡ሬᰦ䰤/h24a a b b
b
c
b
c
96
4
3
2
1
0
ࠐб䍘∄䞦⍫/U·mg-1  䈡ሬᰦ䰤/h24a a b b
bb
b
b
96
40
30
20
10
0㤟щ≘䞨≘䀓䞦∄䞦⍫/U·m
g-
1 
䈡ሬᰦ䰤/h24a a b b
bbc
b
c
96
A
B
C
CK
Ltn
CO
Ltn+CO
CK
Ltn
CO
Ltn+CO
CK
Ltn
CO
Ltn+CO
CK ：空白对照 ；Ltn ：香菇多糖 ；CO ：炭疽病菌 ；Ltn+CO ：经 Ltn 处理 24 h
后再经 CO 处理 ；小写字母表示差异达显著性水平 P<0.05
图 3 处理方式对黄瓜叶片胞内 β-1，3- 葡聚糖酶（A）、几
丁质酶（B）和苯丙氨酸氨解酶（C）活力测定影响
3 讨论
水杨酸（SA）作为胞内信号分子在植物组织建
立系统性的防御响应过程中起到关键作用［12，13］。因
此，以胞内 SA 积累浓度作为评价指标考察了香菇
多糖（Ltn）浓度对黄瓜叶片组织诱抗效果的影响。
植物细胞膜表面受体识别到诱导子后迅速激活氧代
谢爆发产生活性氧中间体（ROI），如 O2- 和 H2O2，
并进一步激活依赖 ROI 的防御响应二级信使水杨
酸和防御相关基因的表达以及抗菌代谢产物的合
2016,32(3) 97张文华：香菇多糖增强黄瓜幼苗对炭疽病菌抗性机理
有发展成环境友好型生物农药的潜力，进一步拓展
了其应用范围。
参 考 文 献
［1］Jones JDG, Dangl JL. The plant immune system［J］. Nature, 2006,
444（7117）：323-329.
［2］Kombrink E, Somssich IE. Defense responses of plants to
pathogens［M］// Callow JHA, Inez CT, editor. Advances in
Botanical Research ：Academic Press, 1995 ：1-34.
［3］Mcdowell JM, Dangl JL. Signal transduction in the plant immune
response［J］. Trends in Biochemical Sciences, 2000, 25（2）：
79-82.
［4］Dixon RA, Achnine L, Kota P, et al. The phenylpropanoid pathway
and plant defence-a genomics perspective［J］. Molecular Plant
Pathology, 2002, 3（5）：371-390.
［5］Klarzynski O, Plesse B, Joubert JM, et al. Linear β-1, 3 glucans are
elicitors of defense responses in tobacco［J］. Plant Physiology,
2000, 124（3）：1027-1037.
［6］ Li J, Zhu L, Lu G, et al. Curdlan β-1, 3-Glucooligosaccharides induce
the defense responses against Phytophthora infestans infection of
potato（Solanum tuberosum L. cv. McCain G1）leaf cells［J］.
PLoS One, 2014, 9（5）：e97197.
［7］ Zhang PY, Wang JC, Liu SH, et al. A novel burdock fructooligosacc-
haride induces changes in the production of salicylates, activates
defence enzymes and induces systematic acquired resistance to
Colletotrichum orbiculare in cucumber seedlings［J］. Journal of
Phytopathology, 2009, 157 ：201-207.
［8］Li SJ, Zhu TH. Biochemical response and induced resistance against
anthracnose（Colletotrichum camelliae）of camellia（Camellia
pitardii）by chitosan oligosaccharide application［J］. Forest
Pathology, 2013, 43 ：67-76.
［9］ van Spronsen PC, Tak T, Rood AM, et al. Salicylic acid inhibits ind-
eterminate-type nodulation but not determinate-type nodulation［J］.
Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003, 16（1）：83-91.
［10］Ippolito A, El Ghaouth A, Wilson CL, et al. Control of postharvest
decay of apple fruit by Aureobasidium pullulans and induction
of defense responses［J］. Postharvest Biology and Technology,
2000, 19（3）：265-272.
［11］Wang JW, Wu JY. Involvement of nitric oxide in elicitor-induced
defense responses and secondary metabolism of Taxus chinensis
cells［J］. Nitric Oxide-Biology and Chemistry, 2004, 11（4）：
298-306.
［12］Delaney TP, Uknes S, Vernooij B, et al. A central role of salicylic
acid in plant disease resistance［J］. Science, 1994, 266（5188）：
1247-1250.
［13］ Zhang ZG, Wang YC, Ji R, et al. The role of SA in the hypersensi-
tive response and systemic acquired resistance induced by elicitor
PB90 from Phytophthora boehmeriae［J］. Physiological and Mol-
ecular Plant Pathology, 2004, 65（1）：31-38.
［14］ Jones JD, Dangl JL. The plant immune system［J］. Nature, 2006,
444（7117）：323-329.
［15］El Modafar C, Elgadda M, El Boutachfaiti R, et al. Induction of
natural defence accompanied by salicylic acid-dependant systemic
acquired resistance in tomato seedlings in response to bioelicitors
isolated from green algae［J］. Scientia Horticulturae, 2012, 138 ：
55-63.
［16］Van Loon L, Van Strien E. The families of pathogenesis-related
proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type
proteins［J］. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1999,
55（2）：85-97.
［17］Vigers AJ, Roberts W, Selitrennikoff CP. A new family of plant
antifungal proteins［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions,
1991, 4（4）：315-323.
［18］Kuć J. Molecular aspects of plant responses to pathogens［J］.
Acta Physiologiae Plantarum, 1997, 19（4）：551-559.
［19］Matsuda F, Morino K, Ano R, et al. Metabolic flux analysis of
the phenylpropanoid pathway in elicitor-treated potato tuber
tissue［J］. Plant and Cell Physiology, 2005, 46（3）：454-466.
（责任编辑 马鑫）