全 文 ：李海燕 ,王小敏 ,李维林 ,等.蓬蘽茎段与叶片培养及其植株再生 [ J] .江苏农业科学 , 2010(2):42 -44.
蓬蘽茎段与叶片培养及其植株再生
李海燕 , 王小敏 , 李维林 , 吴文龙
(江苏省中国科学院植物研究所 ,江苏南京 210014)
　　摘要:以蓬蘽带腋芽的茎段为外植体 , 研究了 HgCl2处理时间对消毒效果的影响 、不同激素浓度和继代培养次数
对增殖效果的影响以及不同浓度 NAA对生根的影响 ,同时研究了基本培养基种类 、植物生长调节剂配比以及光照强
度对叶片愈伤组织诱导和不定芽再生的影响。结果表明 ,以 75%酒精浸泡 45 s, 再用 0.1% HgCl
2
处理 8 min为最好
的消毒方法 , 污染率为 31.58%, 褐化率为 21.06%,存活率为 52.63%;最佳芽增殖培养基为 MS+6 -BA0.5 mg/L+
NAA0.1 mg/L,增殖系数最高可达 9.22;继代培养次数越多 , 增殖效果越好;正交试验筛选出叶片不定芽再生的最佳
培养基为 MS+TDZ2 mg/L+NAA0.5 mg/L;适宜生根的培养基为 1/2MS+NAA0.01 mg/L, 生根率为 100%, 平均生
根数 11.13条 ,平均根长 3.95 cm。
　　关键词:蓬蘽;组织培养;快速繁殖;叶片;植株再生
　　中图分类号:S663.204.+3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2010)02-0042-03
(上接第 41页)
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　　蓬蘽(RubushirsutusThunb.)是蔷薇科悬钩子属浆果植
物 ,聚合果 ,外观呈圆球形 ,色泽鲜红 ,香味独特 ,酸甜适中 ,含
丰富的氨基酸 、糖 、矿质元素 、有机酸和维生素 E等营养物
质 ,鲜果中 SOD含量高达 262.49 U/g。可鲜食或作药用 、食
用原料 ,可加工成果汁 、果酱 、果酒 、果冻或制茶 [ 1-3 ] ,是悬钩
子类果树宝贵的育种材料 。另据记载 [ 4 ] , 蓬蘽全株可供药
用 ,具有清热止血 ,祛风除湿等功效 ,可治疗急性黄疸型传染
性肝炎 、风湿关节痛 、小儿暑疖等症 。古代多部典籍都有关于
收稿日期:2009-07 -22
基金项目:江苏省农业高科技项目(编号:BG2007311);江苏省科技
基础设施建设计划项目(编号:BM2008101)。
作者简介:李海燕(1984— ),女 , 山西大同人 ,硕士研究生 ,主要从事
植物栽培与生物技术研究。 E-mail:lhy 1984@163.com。
通信作者:李维林(1966— ),男 ,研究员 ,主要从事经济林和药用植物
的研究。 E-mail:lwlcnbg@mail.cnbg.net。
蓬蘽的记载 。 《神农本草经 》下卷果菜部上品中描述:“蓬蔂
味酸平 。主安五藏 ,益精气 ,长阴令坚 ,强志倍力 ,有子 。久服
轻身不老。”在 《医林篡要 》《唐本草 》《日用本草 》等典籍中也
均有记载。因此 ,蓬蘽具有较高的营养价值和医疗保健功效 。
对蓬蘽进行组织培养研究 ,迅速提供大量优质苗木 ,是保证蓬
蘽规模化种植的重要措施 。
1　材料与方法
1.1　材料
蓬蘽来自于南京中山植物园悬钩子种植圃内 ,由李维林
研究员鉴定 。采集蓬蘽 1年生未木质化枝条 , 剪成 1.5 ～
2.0 cm长 、带 1个腋芽的茎段 ,作为初代培养的外植体 。
1.2　方法
1.2.1　外植体消毒方法的筛选 　外植体用自来水冲洗
10 min,加 0.1%洗衣粉浸泡 10 min后用自来水冲洗 45 ～ 60
—42— 江苏农业科学　2010年第 2期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2010.02.128
min,转入超净工作台操作 。在无菌条件下 ,将材料放入 70%
酒精中浸泡 45 s,然后用无菌水冲洗 3次 ,再用 0.1% HgCl2
溶液处理 5 ～ 10 min,最后用无菌水冲洗 3 ～ 4次 ,取出茎段在
吸水纸上吸干水分 ,切去基部 ,接种在培养基中 。 15 d后统
计污染率、褐化率和存活率 。污染率 =(污染外植体数 /接种
外植体数)×100%;褐化率 =(褐化外植体数 /接种外植体
数)×100%;存活率 =(未污染的有新芽萌发的外植体数 /接
种外植体数)×100%。试验所用培养基为 MS基本培养基 ,
培养基中 6 -BA浓度为 0.5 mg/L。
1.2.2　增殖培养基的筛选　选择继代培养的健壮植株 ,从基
部切下分成单一的芽苗 ,接种到以 MS为基本培养基并添加
不同浓度 6 -BA和 NAA的 9种培养基上(表 1)培养 ,每处理
接种 5个三角瓶 ,每瓶接种 3个芽苗 ,重复 2次 , 30 d后观察
统计植株的生长增殖情况 。
表 1　不同浓度 6-BA和 NAA对蓬蘽试管苗不定芽增殖的影响
处理号 6-BA(mg/L)
NAA
(mg/L)
接种株数
(株)
增殖
倍数
平均芽长
(cm)
1 0.0 0.0 30 1.60hG 2.96aA
2 0.3 0.1 30 5.65dD 1.71fD
3 0.3 0.2 30 5.27fE 2.12bB
4 0.5 0.1 30 9.22aA 1.72efD
5 0.5 0.2 30 5.47eDE 2.18bB
6 0.5 0.3 30 4.87gF 1.86cdC
7 1.0 0.2 30 7.28bB 1.93cC
8 1.0 0.3 30 5.89cC 1.51gE
9 1.0 0.5 30 5.60deD 1.81deCD
　　注:同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01), 不同
小写字母表示差异显著 P<0.05)。
1.2.3　继代次数对不定芽增殖的影响 　以 40 d为 1个周
期 ,将蓬蘽的丛生芽苗连续继代培养 4次 ,每处理 30个芽 ,统
计平均增殖倍数 。培养基为 MS基本培养基添加 1.0 mg/L
6-BA和 0.5 mg/LNAA。
1.2.4　叶片再生培养 　取 25 ～ 30 d叶龄的组培苗 ,选取植
株中上部叶片 ,弃去叶缘和叶尖 ,于培养基上培养 。试验采用
L9(34)正交试验设计 , 4因素及 3个水平分别是:基本培养基
(MS、3/4MS、B5)、NAA(0.5、1.0、2.0 mg/L)、TDZ(1.0、2.0、
4.0 mg/L)、光照(0、1 000、2 000 lx)。每处理接种 30个材
料 , 30 d后统计愈伤组织诱导率 、不定芽再生率 。
1.2.5　生根培养基的筛选　选取生长健壮且长势一致的组
培苗进行生根培养 ,要求苗高 2 ～ 3 cm,每株带有 2 ～ 4片叶 。
以 1/2MS为基本培养基 ,添加不同浓度 (0.01、0.05、0.10、
0.50、1.00 mg/L)的 NAA,共 5个处理 ,每处理接种 10个芽 ,
重复 3次 , 30 d后统计生根情况 。
以上所有试验中 ,培养基中蔗糖浓度为 25 g/L,琼脂为
5.6 ～ 6.0 g/L, pH值 5.8 ,培养温度 25 ℃,光照度 1 500 ～
2 000 lx,光照 14 h/d。
1.2.6　数据处理　数据采用 Excel进行差异显著性分析 ,用
正交设计软件进行正交分析 。
2　结果与讨论
2.1　HgCl2的消毒时间
由表 2可以看出 ,随着 0.1% HgCl2浸泡时间的延长 ,外
植体的污染率下降 ,但褐化率增加 ,说明 0.1% HgCl2浸泡时
间的长短对消毒效果影响很大 。 0.1% HgCl2处理时间为
10 min时 ,污染率最低 ,但是褐化率却最高 ,同时存活率比处
理时间为 8 min时要低 。因此认为 ,用蓬蘽的茎段作为外植
体进行组培时 ,最好的消毒方式为 70%酒精浸泡 45 s+0.1%
HgCl2消毒 8 min。
表 2　不同消毒时间对茎段消毒效果的影响
处理号
0.1% HgCl2
处理时间
(min)
接种数
(个)
污染率
(%)
褐化率
(%)
存活率
(%)
1 5 60 78.33 3.33 16.67
2 8 19 31.58 21.06 52.63
3 10 31 25.81 22.58 45.16
2.2　6-BA和 NAA对蓬蘽不定芽增殖的影响
一般来说 ,最优化的增殖培养基不仅要求有较高的增殖
率 ,还要有适合继代的芽长 ,植株生长也要健壮 。由表 1可以
看出 ,在不添加任何激素的 MS培养基上 ,芽苗产生新不定芽
的能力很低 ,增殖倍数仅为 1.6 ,但平均芽长最大且有较多根
系产生 。在 6 -BA浓度相同的情况下 ,随着 NAA浓度的增
大 ,增殖倍数呈下降的趋势 。当 6 -BA浓度为 1.0 mg/L时 ,
不定芽出现不同程度的玻璃化 ,且当 NAA浓度为 0.2 mg/L
时 ,玻璃化现象最严重 。在生长素 NAA浓度相同的情况下 ,
细胞分裂素 6 -BA浓度较高时增殖倍数较大 。综合比较 ,蓬
虆不定芽继代增殖时 6 -BA浓度应低于 1.0 mg/L,不定芽最
佳增殖培养基为:MS+6 -BA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L。
2.3　继代培养次数对蓬蘽不定芽增殖的影响
由表 3可见 ,第 1次继代培养的繁殖系数较小 ,第 2、3、4
次继代培养的繁殖系数明显提高 ,且趋于稳定 。试验还发现 ,
第 1次继代培养时 ,芽苗节间短 ,叶片较大 ,叶柄较长;第 2、
3、4次继代培养的芽苗的整体长势都明显好于第 1次继代 ,
表现为芽苗叶片变小 ,叶柄变短 ,植株较高。
表 3　继代培养次数对蓬蘽不定芽增殖培养的影响
继代次数 接种株数(株) 增殖倍数 生长情况
1 30 2.84 长势一般
2 30 8.10 长势良好
3 30 10.59 长势良好
4 30 9.58 长势良好
2.4　基本培养基种类 、生长调节剂配比以及光照强度对愈伤
组织诱导和不定芽再生的影响
不同培养基配方对蓬蘽嫩叶愈伤组织的诱导率和不定芽
再生率影响很大 。从表 4中的极差 RⅠ和 RⅡ分别可以看出 ,
影响蓬蘽嫩叶愈伤组织诱导率的因子由大到小依次是基本培
养基 >光照强度 =TDZ>NAA,影响蓬蘽不定芽再生率的因
子由大到小依次是基本培养基 >TDZ>NAA>光照强度 。基
本培养基对于诱导率和再生率取 MS作为基本培养基最好;
光照强度对于诱导率和再生率以 2 000 lx最好;NAA对于诱
导率和再生率以 0.5 mg/L最好;TDZ对于诱导率以
1.0 mg/L最好 ,而对于再生率以 2.0 mg/L最好 。因此综合
考虑 ,最终选择 MS作为基本培养基并添加 1.0 mg/L或
2.0 mg/LTDZ和 0.5 mg/LNAA为最佳培养基 ,且光照强度
为2 000 lx。
—43—李海燕等:蓬蘽茎段与叶片培养及其植株再生
表 4　蓬蘽叶片再生培养 L9(34)正交试验结果
处理号 基本培养基
光照强度
(lx)
NAA
(mg/L)
TDZ
(mg/L)
愈伤组织
诱导率Ⅰ
(%)
不定芽
再生率Ⅱ
(%)
1 1(MS) 1(0) 1(0.5) 1(1.0) 100.00 66.67
2 1 2(1000) 2(1.0) 2(2.0) 93.33 66.67
3 1 3(2000) 3(2.0) 3(4.0) 100.00 33.33
4 2(3/4MS) 1 2 3 93.33 0.00
5 2 2 3 1 100.00 26.67
6 2 3 1 2 100.00 83.33
7 3(B5) 1 3 2 33.33 0.00
8 3 2 1 3 83.33 0.00
9 3 3 2 1 83.33 0.00
kⅠ 1 97.777 75.553 94.443 94.443kⅠ 2 97.777 92.220 89.997 75.553kⅠ 3 66.663 94.443 77.777 92.220
RⅠ 31.114 18.890 16.666 18.890
kⅡ 1 55.557 22.223 50.000 31.113
kⅡ 2 36.667 31.113 22.223 50.000
kⅡ 3 0.000 38.887 20.000 11.110
RⅡ 55.557 16.664 30.000 38.890
2.5　蓬蘽的生根培养
试验中观察到 ,转入生根培养基的蓬蘽组培苗 , 10 d后
开始生根 ,除了处理 1以外 ,其他处理都产生了较多的气生
根 。由表 5可以看出 ,在添加不同浓度 NAA的生根培养基
中 ,蓬蘽组培苗均 100%生根 ,但平均根数和根长存在显著差
异 ,其中添加 0.01 mg/LNAA处理中组培苗生根最多最长 ,
随着 NAA浓度的增大 ,平均根数和根长均降低 。综合分析认
为 ,蓬蘽 组培苗的 最佳生根 培养 基为 1/2MS+NAA
0.01 mg/L。
表 5　不同浓度 NAA对蓬蘽生根效果的影响
处理号 NAA浓度(mg/L)
接种株数
(株)
生根率
(%)
平均生根数
(条 /株)
平均根长
(cm/条)
1 0.01 30 100 11.13aA 3.95aA
2 0.05 30 100 4.78dD 2.12bB
3 0.10 30 100 8.70bB 1.93bB
4 0.50 30 100 6.60cC 1.40cC
5 1.00 30 100 3.90eD 0.81dD
　　注同表 1。
3　讨论
对外植体材料进行合理有效的灭菌处理 ,是植物组织培
养工作的重要环节 。消毒时间太短达不到较好的消毒效果 ,
大部分外植体会因污染而死亡 。消毒时间太长 ,则由于消毒
剂对外植体的伤害太重 ,而大大降低其存活率 。本试验采用
的 70 %酒精浸泡 45 s+0.1% HgCl2消毒 8 min达到了相对
较好的结果 。
繁殖速度是离体快速繁殖中最为重要的一个问题 ,只有
繁殖速度快 ,在生产实践中才有应用价值 。芽增殖培养的目
的是为了繁殖大量有效的芽和苗 。在影响繁殖速度的众多因
素中 ,植物生长调节剂往往起决定性作用。本试验通过研究
不同浓度的激素组合对蓬蘽试管苗不定芽增殖的影响发现 ,
蓬蘽不定芽最佳增殖培养基为 MS+6 -BA0.5 mg/L+NAA
0.1 mg/L。
继代培养次数对增殖效率的影响因培养材料而异 。常出
现 2种情况 ,一种是增殖代数越高 ,驯化现象越稳定 ,另一种是
组织器官及植株再生能力降低和丧失 。王丽玲 [5 ]在研究继代
次数对树莓和黑莓增殖效果的影响时发现 ,随着继代次数的增
加 ,芽分化数也在递增 。本试验发现随着继代次数的增加 ,蓬
蘽组培苗的增殖倍数显著增加 ,保持了较高的增殖能力 。
叶片通过器官发生再生不定芽的主要方式是叶片经过愈
伤组织阶段诱导不定芽再生 ,但也有报道表明叶片不定芽再
生不经过或经过很少的愈伤组织阶段 [ 7-9] 。本试验研究结果
表明 ,蓬蘽叶片需要经过愈伤组织阶段才能诱导不定芽再生 ,
基本培养基种类 、生长调节剂配比以及光照强度对愈伤组织
诱导和不定芽再生均有一定的影响 ,在 MS培养基中适当配
比的 TDZ与 NAA,不仅有助于诱导蓬蘽叶片产生愈伤组织 ,
而且有助于蓬蘽叶片不定芽再生 。
植物的生根多数都是用生长素单独实现的 ,不同种类相
同浓度或相同种类不同浓度的生长素对试管苗生根有不同程
度的影响。蒋小满等 [ 6 ]在对黑莓的生根中采用 1/2MS+NAA
0.05 mg/L为最好 ,平均生根率和生根数均最高 ,高浓度的
NAA反而不利于生根 。本试验研究不同浓度的 NAA对蓬蘽
生根的影响 ,结果发现 ,采用 1 /2MS培养基 ,添加 0.01 mg/L
NAA即可达到目的 ,随着添加 NAA浓度的增大 ,生根的数量
和质量会降低 ,不利于试管苗生根 。
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