全 文 ：收稿日期:2006-06-02 接受日期:2006-08-01
基金项目:河南省科技攻关项目(0324070047)。
作者简介:孙新政 男,副教授,主要从事园艺植物繁殖与种苗生产技术研究与教学。Tel:0371-68520380,E-mail:sunxinzheng@163.com
% 通讯作者。Authorforcorespondence.Tel:0371-68520380,E-mail:shenshunxian@163.com
钙果4号欧李组织培养技术研究
孙新政,申顺先 *,李庆伟,陈世昌
(河南农业职业学院,河南中牟 451450)
摘 要:以钙果4号欧李秋季生长的幼嫩上部枝和春季萌生的幼嫩基生枝为材料,利用正交试验设计等方法研究了
欧李组织培养的最佳基本培养基和植物生长调节剂配比。结果表明,以春季萌生的幼嫩基生枝为外植体材料较好,
以 70%～75%酒精浸洗 10～30s后用 0.1%升汞浸洗 6min消毒效果最好,适宜芽诱导的培养基是改良 MS+NAA
0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+20g/L蔗糖+7g/L琼脂,最佳芽增殖培养基是改良 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA3
0.2mg/L+20g/L蔗糖+7g/L琼脂,适宜生根培养基是1/2MS+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L+20g/L蔗糖+7g/L琼脂。
关键词:欧李;组织培养;正交试验
中图分类号:S662.3 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2007)01-80-04
StudiesontissuecultureofGaiguo4,alineofCerasushumilis
SUNXin-zheng,SHENShun-xian*,LIQing-wei,CHENShi-chang
(HenanAgriculturalVocationalColege,Zhongmu,Henan451450China)
Abstract:ExperimentwascariedoutusingtheuppertendersteminAutumnandtheinceptivetendersteminSpringofGaiguo
4(alineofCerasushumilisBunge)asmaterial,andutilizingtheorthogonaltesttoobtainedtheoptimalmediumforitstissue
culture.Resultshowed:theinceptivetendersteminspringwasthebestexplant.Thebestmethodfordisinfectantwas70%to
75%alcohol(washedfor10sto30s)and0.1%mercuricchloride(washedfor6min).Theoptimalmediumforinducingshootwas
improvedMS+NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L+20g/Lsugar+7g/Lagar;theoptimalmediumforshootgenerationwasim-
provedMS+6-BA2.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA30.2mg/L+20g/Lsugar+7g/Lagar;theoptimalmediumforrootingis1/2MS
+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L+20g/Lsugar+7g/Lagar.
Keywords:CerasuslumilisBunge;Tissueculture;Orthogonaltest
欧李(CerasuslumilisBunge)为蔷薇科李亚科樱
桃属落叶小灌木,是我国特有的一个古老的野生果树,
其鲜果钙含量高达3.6mg/g,俗称为“钙果”[1-2]。欧李
的常规繁殖多采用扦插和分株等方法,受外界环境
条件影响较大,繁殖系数较低。自钱国珍等[3]利用欧
李实生苗进行组织培养研究获得成功以来,赵玉军
等[4]也对实生苗快繁技术进行了报道,钟士传等[5-7]
对其进行研究时均没有具体指出所用材料为何品
种;庄丽娟等[8]以“优质大欧李”、任清盛[9]以“中华钙
果”为材料进行了研究,然而,他们对外植体消毒研
究不够深入,虽然也找到了欧李芽增殖的培养基配
方,但芽增殖率不高(最高为6.9)。由于试材基因型、
外植体类型及其生理状态对植物生长调节剂敏感程
度不同,外植体高效再生成苗也相应存在差异,适宜
培养基的筛选确定成为欧李组织培养技术中的第一
步。本试验以欧李新品种钙果4号[10]为材料,利用正
交试验方法进行组织培养技术研究,深入研究外植
体选择与消毒方法,筛选适宜的芽诱导、芽增殖和生
根培养基,以建立钙果4号的组培体系。
1 材料和方法
1.1 材料
供试材料是 2003年由山西农业大学引进的欧
李优良品种钙果4号苗木,栽植于庭院。2004年10
月下旬和2005年4月初,分别选用幼嫩上部枝和幼
嫩基生枝为外植体进行培养。
1.2 方法
1.2.1 外植体无菌体系建立 将从田间剪取的幼嫩
上部枝或基生枝去叶留茎,放于清水中冲洗30min左
右,用洗洁精溶液洗涤后,再用流水缓慢冲洗2～4h,
蒸馏水漂洗数次带入无菌操作室,放入70%～75%的
酒精中浸洗10～30s后,迅速用无菌水漂洗2～3次;
然后用0.1%的升汞分别浸洗6、9、12min,无菌水浸
洗4～6次,最后用无菌纸吸干残留水分,剪成 1～2cm
果 树 学 报 2007,24(1):80～83
JournalofFruitScience
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2007.01.018
取材季节部位
Adaptedseasonandpart
0.1%升汞浸洗时间
0.1%mercuricchloride
dippingtime(min)
接种株数
No.ofshoots
污染株数
No.of
polution
污染率
Polution
rate(%)
未萌芽株数
No.without
embryo
未萌芽率
Theratewithout
embryo(%)
存活数
No.of
survival
存活率
Survivalrate
(%)
秋季上部枝
Autumnupperstems
春季基生枝
Springbasalstems
6
9
12
6
9
12
18
18
18
18
18
18
12
9
7
3
3
5
67
50
39
17
17
28
0
0
4
0
1
5
0
0
22
0
6
28
6
9
7
15
14
8
33
50
39
83
77
44
表3 不同季节不同部位不同消毒时间对钙果4号欧李外植体存活率的影响
Table3Efectofdiferentseason,partandtimeonexplantsurvivalofC.lumilisvaritetyGaiguo4
试验号
Test
number
基本培养基
Basicmedium
NAA
(mg/L)
6-BA
(mg/L)
接种数(瓶)
No.ofshootinnoculated
上部枝
Upperstem
基生枝
Basalstem
1
2
3
4
MS
MS
改良MS
ImprovedMS
改良MS
ImprovedMS
0.02
0.10
0.02
0.10
0.2
1.0
0.2
1.0
15
15
15
15
15
15
15
15
表1 芽诱导试验设计
Table1Testdesignforbudinducing
表2 芽增殖试验生长调节剂处理因素水平表
Table2Factorsandlevelsofplantgrowthregulatorsin
shootmultiplication
长茎段(含1～2个腋芽),接种在培养基上培养。20d
后统计污染率、未萌芽率和存活率。试验结果统计参
考肖显华等[11]的方法,并作改动。污染率(%)=(污染
外植体数/接种外植体数)×100,未萌芽率(%)=[(死
亡外植体数+未萌芽外植体数)/接种外植体数]×
100,存活率(%)=(萌芽不污染外植体数/接种外植
体数)×100。
1.2.2 芽诱导 芽诱导所用基本培养基是MS培养
基与改良MS培养基 (1/2大量元素+1/2微量元素+
铁盐+有机物),附加不同浓度的 NAA与 6-BA(表
1),培养基中添加20g/L的蔗糖和 7g/L的琼脂(下
同),培养基pH值(下同)5.6～6.0。培养条件(下同)
为:温度(25±2)℃,光照强度 2000～3000lx,光照时
间12～14h/d,培养室空气相对湿度70%左右。
1.2.3 芽增殖试验 以改良 MS培养基为基本培
养基,进行3因素3水平正交设计(表2)。采用芽诱
导中生长一致,长度1～2cm含1～2个腋芽的茎段,
接种于9组培养基中培养,每组试验做5次重复。
芽增殖率(%)=最终芽的数量/最初芽的数量×100
1.2.4 不定根诱导 将芽增殖中生长一致,株高3～
4cm、含茎尖的茎段接种于各种培养基上。30d后
统计生根情况。
2 结果与分析
2.1 无菌体系建立与芽诱导试验
2.1.1 外植体存活情况 由表3可以看出,钙果4
号欧李春季萌生的基生枝在0.1%升汞中浸洗6min
的存活率最高,为 83%;随着在 0.1%升汞中浸洗时
间的延长,外植体的存活率减小,其中主要是未萌芽
率在升高。在0.1%升汞中浸洗6min和9min的污
染率均比较低,为17%。秋季上部枝在相同消毒时
间下污染率明显高于春季基生枝,且存活率明显低
于后者。可见以春季萌生的基生枝为外植体材料更
好,以70%～75%酒精浸洗 10～30s,0.1%升汞浸洗
6min对外植体消毒灭菌效果最好(图版-1)。
2.1.2 芽诱导情况 接种于1号培养基的上部枝茎
段在第20天时,萌发的腋芽很少,在第 30天,生长
势不佳;基生枝茎段在第 20天时,单株萌发的腋芽
有1～3个,在第30天,生长势比前者好。而接种于2
号培养基的上部枝茎段在第20天时,部分茎段腋芽
已萌发,但颜色很浅,在第30天,已形成多个芽,但
有的芽趋向白化,生长势不好;基生枝茎段在第 20
天时,单株萌发的腋芽有 2～4个,在第 30天,生长
势一般。而接种于3号培养基上的幼嫩基生枝茎段
在10d内顶芽萌发,而有顶芽的茎段腋芽萌发不明
显,在第20天时,单株萌发的腋芽不足3个,在第30
天,不足8个,整个过程生长较慢;上部枝茎段在第
20天时,单株萌发的腋芽2～3个,在第30天,3～5
个。接种于 4号培养基的幼嫩基生枝茎段在 10d
内顶芽与腋芽就开始萌发,然后迅速生长,在第20
天时,萌发的腋芽有4个以上,在第30天,单株萌发
的腋芽有5～10个,有的更多,并且这些芽的质量都
正常;上部枝茎段在第 20天时,单株萌发的腋芽有
3～4个,在第30天,单株萌发的腋芽有5～8个。可见
钙果4号欧李芽诱导采用春季萌生的幼嫩基生枝优
于上部枝,采用4号培养基即改良MS+NAA0.1mg/
孙新政等:钙果4号欧李组织培养技术研究1期
1
2
3
0.02
0.10
0.50
0.2
1.0
2.0
0.0
0.2
0.5
水平
Level
因素 Factor
NAA(mg/L) 6-BA(mg/L) GA3(mg/L)
81
果 树 学 报 24卷
0.02
0.02
0.02
0.10
0.10
0.10
0.50
0.50
0.50
7.13
5.40
4.73
2.40
0.20
1.00
2.00
0.20
1.00
2.00
0.20
1.00
2.00
3.73
6.73
6.80
3.07
0.00
0.20
0.50
0.20
0.50
0.00
0.50
0.00
0.20
4.53
6.67
6.07
2.14
2.8
9.4
9.2
5.0
5.6
5.6
3.4
5.2
5.6
1
2
3
4
5
6
7
8
9
水平均值
Leveldistance
T1
T2
T3
R
NAA
(mg/L)
6-BA
(mg/L)
GA3
(mg/L)
试验号
Testnumbers
因素Factor 平均芽增殖率
Averageshoot
multiplicationrate(%)
图 版 说 明
1.初代培养;2.丛生芽苗生长情况;3.钙果4号欧李生根(由瓶底照相);4.钙果4号欧李生根
Explanationofplates
1.Initialculture;2.Clumpbudgrowing;3.CreasuslumilisBungevaritetyGaiguo4root(photoedfrombotlebotom);
4.CerasuslumilisBungevaritetyGaiguo4root
表5 不同培养基配方对钙果4号欧李生根的影响
Table5Theefectofdiferentmediumonrootingof
C.lumilisBungevaritetyGaiguo4
培养基
Medium
接种株数
No.of
shoots
生根率
Rootrate
(%)
平均生根数
Theaverage
numberofroot
MS
MS+IBA0.2mg/L
MS+IBA1.0mg/L
MS+IBA2.0mg/L
MS+IBA0.2mg/L+KT0.02mg/L
MS+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L
MS+IBA2.0mg/L+KT0.02mg/L
MS+IBA0.2mg/L+KT0.20mg/L
MS+IBA1.0mg/L+KT0.20mg/L
MS+IBA2.0mg/L+KT0.20mg/L
1/2MS
1/2MS+IBA0.2mg/L
1/2MS+IBA1.0mg/L
1/2MS+IBA2.0mg/L
1/2MS+IBA0.2mg/L+KT0.02mg/L
1/2MS+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L
1/2MS+IBA2.0mg/L+KT0.02mg/L
1/2MS+IBA0.2mg/L+KT0.20mg/L
1/2MS+IBA1.0mg/L+KT0.20mg/L
1/2MS+IBA2.0mg/L+KT0.20mg/L
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
0
0
50
40
30
60
40
10
70
70
30
50
90
80
3
100
100
50
100
90
0.0
0.0
0.5
0.4
0.3
0.7
0.6
0.1
0.9
0.8
0.3
0.5
1.5
1.1
0.3
2.3
1.7
0.5
1.8
1.6
表4 钙果4号欧李芽增殖培养正交试验设计方案
与试验结果直观分析表
Table4Testdesignandvisualmultiplicationanalysis
ofC.lumilisBungevaritetyGaiguo4
L+6-BA1.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L较好。
2.2 芽增殖培养试验
在培养到第10天时各组试验,植株生长正常,
每组芽都有所增殖,其中芽增殖率最高与芽质量最
优的分别是第2组与第4组,并且多组茎段基部切
口处出现少量绿色沙砾状或小米粒状愈伤组织。在
培养到第20天时,绝大部分植株生长正常,每组腋
芽都有所增殖,其中芽增殖率最高与芽质量最优的
分别是第3、4、5、7组,愈伤组织变化不大。在培养到
第30天时,绝大部分植株生长良好(表4)。
由表 4可以看出各因素极差 R的大小顺序
3.07>2.40>2.14,对芽增殖率高低产生的效应由主到
次的因素顺序依次是6-BA、NAA、GA3,3者引起平
均芽增殖率高低的水平依次是第 3、1、2,即改良
MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA30.2mg/L+蔗
糖 20g/L+琼脂 7g/L就是最佳芽增殖培养基配方。
对其进行方差分析,得出 6-BA表现差异显著,
NAA与GA3均不显著,说明6-BA浓度的变化会引
起芽增殖率的显著变化,而 NAA与 GA3浓度的变
化不会引起芽增殖率的显著变化。对试验结果验证
的平均芽增殖率是11.8,且芽质量良好,明显高于
表4中平均芽增殖率的最高值 9.4,说明改良 MS+
6-BA2.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA30.2mg/L+蔗糖
20g/L+琼脂7g/L就是钙果4号欧李最佳芽增殖培
养基配方(图版-2)。
2.3 生根培养试验
含茎尖的钙果 4号欧李茎段首先在基部切口
处产生浅黄色或白色沙砾状愈伤组织,接着产生白
色不定根,有的小根产生于培养基与空气相交界的
茎段基部,有的小根产生于培养基与空气相交界的
茎段产生的愈伤组织内部(图版-3,4)。说明不定根
的产生途径不是单一的,可以直接产生也可以经脱
分化再分化途径产生。由表5可以看出,最适宜的生
1 2 3 4
82
1期
根培养基配方为1/2MS+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L+
蔗糖20g/L+琼脂7g/L。
3 讨 论
外植体的带菌状况直接影响着培养体系的建
立,木本植物组织培养中的困难之一是获得无菌
材料[12]。钱国珍等[3]对欧李组培技术研究以来,仅
刘琳[13]对外植体消毒进行了稍深入的研究,发现用
0.1%升汞处理7min时污染率最低为20%,存活率
最高为78%。而笔者在试验中发现用0.1%的升汞对
春季萌生的幼嫩基生枝处理6min时污染率最低为
17%,存活率最高为83%。另外,本试验还发现,不同
取材季节和部位消毒处理后的存活情况有较大差
异。
同一树上的不同部位生理年龄不同:离树干基
部的距离越远,生理年龄越老,而靠近树干基部的先
前长出来的枝干,表现幼态[14]。本试验中利用钙果4
号欧李幼嫩的基生枝与上部枝离体培养进行比较,
结果发现欧李同样具有这一特性。
植物生长调节物质,在试管苗增殖中起决定性
作用,由于植物内源激素难以测定,因此,外源激素
的加入靠一系列的试验来修正[15]。在芽增殖试验中,
笔者筛选出的钙果 4号欧李培养基配方有效芽增
殖率高达11.8,远远高于钟士传等[5]的6.9与庄丽娟
等[8]的4.99。然而,随着继代培养次数的增加,部分
芽出现玻璃化现象,有效芽变少,适当降低6-BA浓
度与提高琼脂浓度来进一步培养这些已轻度玻璃化
的植株,发现这些植株又重新抽出正常的叶和茎来,
成为正常的植株。可见随着继代培养次数的增加,要
适当降低细胞分裂素和生长素比值,即降低最佳培
养基配方中6-BA的浓度,才能保证欧李优良组培
苗不断的培养出来。
4 结 论
研究表明,钙果4号欧李组织培养选春季萌生
的幼嫩基生枝作外植体为佳;芽增殖的最佳配方
为改良 MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA3
0.2mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L;最适宜的生根培
养基配方为 1/2MS+IBA1.0mg/L+KT0.02mg/L+蔗
糖20g/L+琼脂7g/L。
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