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微波提取白鹃梅黄酮类物质
及其抗氧化活性研究
朱玲玲，张广文* ，杨婷婷，邱瑞霞
(暨南大学理工学院食品科学与工程系，广东广州 510632)
收稿日期:2015－05－13
作者简介:朱玲玲(1990－) ，女，硕士研究生，研究方向:食品添加剂，E－mail:jiningzhulingling@ 163.com。
* 通讯作者:张广文(1975－) ，男，博士，副教授，研究方向:食品添加剂，天然产物活性成分，E－mail:zgwzsu@ 163.com。
摘 要:本文以白鹃梅为原料，采用微波辅助提取白鹃梅中黄酮类化合物。在单因素实验的基础上，利用响应面法对
微波功率、时间、料液比、温度进行优化;并对其体外抗氧化活性进行测定。结果表明，微波功率、时间、温度对总黄酮
提取量影响比较显著;最佳工艺条件为:微波功率 357 W，时间 63 min，料液比 1∶26 g /mL，微波温度 47 ℃，由此得到白
鹃梅总黄酮提取量为 14.59 mg /g，与预测值 14.67 mg /g 的相对误差为 0.5%。总黄酮清除 DPPH·、·OH、O －2·以及的
IC50值分别为 0.52、0.55、1.18 mg /mL。其清除 DPPH·、·OH的能力高于 BHT，而低于 VC;清除 O
－
2·的能力均低于 VC、
BHT。结论:微波辅助提取法能够提高白鹃梅中总黄酮提取量，且白鹃梅中黄酮类物质具有一定能力的抗氧化活性。
关键词:白鹃梅，黄酮类化合物，微波提取，响应面法，抗氧化活性
Study on the microwave extraction technology of flavonoids
from Exochorda racemosa and the antioxidant evaluation
ZHU Ling－ ling，ZHANG Guang－wen* ，YANG Ting－ting，QIU Ｒui－xia
(Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China)
Abstract:Ｒesponse surface methodology(ＲSM)was used to optimize the ultrasonic extraction conditions of
lavonoids from Exochorda racemosa based on the Box－Behnken design.The factors of microwave power，time，
solid to liquid ratio，microwave temperature were analyzed and vitro antioxidant activity were measured.The results
showed that microwave power，time and temperature had significant effect on flavonoids yield. The optimum
extraction conditions were as follows:microwave power 357 W，extraction time 63 min，ratio of solid to liquid 1∶26 g /mL，
microwave temperature 47 ℃.Under the optimized conditions，the yield of flavonoids was 14.59 mg /g，compared
with predictive yield which was 14.67 mg /g，the relative error was 0.5% .The value of IC50 of DPPH·，·OH，and O
－
2·
were 0.52，0.55，1.18 mg /mL.The scavenging effect of DPPH·，·OH was higher than BHT，but lower than VC.The
scavenging effcct of O －2·were all lower than VC and BHT.Conclusion:the yield of flavonoids was higher by the
methods of microwave extraction and the flavonoids in Exochorda racemosa had got certain ability to antioxidant
evaluation.
Key words: Exochorda racemosa; microwave extraction; flavonoids; response surface methodology;
Antioxidant activity
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2015)23－0239－06
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2015． 23． 041
白鹃梅为蔷薇科白鹃梅(Exochorda racemosa)
属，该属植物全世界共 4 种，其中 3 种(白鹃梅、齿叶
白鹃梅、红柄白鹃梅)在我国分布［1］，主要生长在河
南、江西、江苏、浙江一带。白鹃梅的花蕾和嫩叶均
可食用。研究表明每百克白鹃梅嫩叶不仅含胡萝卜
素、维生素等丰富的营养物质而且含有丰富的黄酮
类化合物［1－2］。实验人员采用溶剂提取法，溶剂萃取
法以及超声波辅助等方法对不同白鹃梅进行黄酮类
化合物的提取［3］。
本实验利用微波技术对白鹃梅总黄酮进行提
取，在单因素实验的基础上，以白鹃梅总黄酮提取量
为响应值，利用响应面分析法(ＲSM)［4－5］对微波提取
白鹃梅黄酮工艺条件进行优化，并采用多元二次回
归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系来获得
最优工艺参数，并且对其抗氧化活性进行体外测定。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
白鹃梅叶 河南平顶山舞钢市，于热风干燥箱
240
65 ℃烘干，用粉碎机粉碎，过 60 目筛后备用;芦丁标
准品 中国药品生物制品检定所;无水乙醇，乙酸乙
酯，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠均为分析纯。1，1－
二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH) 氨丁三醇(Tris)，
连苯三酚，2，6－二叔丁基对甲酚(BHT)。
LD－Y1000A 高速万能粉碎机 上海顶帅电器
有限公司;MAS－Ⅱ常压微波 上海新仪微波化学科
技有限公司;UV－9600 紫外分光光度计 北京瑞利
仪器有限公司;EL104 电子分析天平 METTLEＲ
TOLEDD有限公司;SB－5200 超声双频清洗器 宁波
新芝生物科技股份公司。
1.2 实验方法
1.2.1 白鹃梅总黄酮提取工艺流程 干燥白鹃梅→粉
碎过筛→加提取溶剂→浸提→抽滤→浓缩干燥→黄酮粗提物
1.2.2 芦丁标准曲线测定 精密称取在 105 ℃干燥
至恒重的芦丁标准品 0.0050 g，加 80%乙醇溶解定容
至 50 mL，配制成质量浓度为 0.1 mg /mL的标准品溶
液。分别吸取该标准品溶液 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL
置于 5 只 25 mL容量瓶中，加质量分数 5% NaNO2 溶
液 1 mL，摇匀放置 6 min，加质量分数 10% 的
Al(NO3)3溶液 1 mL，摇匀放置 6 min 后，再加质量分
数 4%的 NaOH溶液 10 mL，并加水定容至 25 mL，摇
匀放置 15 min，将不同质量浓度的芦丁标准溶液在
510 nm处，以蒸馏水为空白参比，测定其吸光度，并
绘制黄酮质量浓度与吸光度的标准曲线［6］。
1.2.3 总黄酮含量的测定 取待测液 2 mL于 25 mL
容量瓶中，加质量分数为 5% NaNO2 溶液 1 mL，摇匀
放置 6 min，加质量分数 10%的 Al(NO3)3 溶液1 mL，
摇匀放置 6 min，加质量分数 4% 的 NaOH 溶液
10 mL，再加水稀释至 25 mL，摇匀放置 15 min 后，测
定吸光度，代入公式(1) ，计算出黄酮浓度 c，将其代
入公式(2):
A = 10.975c + 0.0037 式(1)
总黄酮含量 = n × c × v /1000M 式(2)
式中:A为吸光度;n为稀释倍数;M 为原料质量
(g);c为总黄酮质量浓度(mg /mL) ;V 为提取液体积
(mL) ;总黄酮含量(mg /g)。
1.2.4 单因素实验设计 以提取溶剂、料液比、提取
温度、提取时间、微波功率 5 个因素进行单因素实
验，做平行实验 3 次，确定影响白鹃梅总黄酮提取量
的适宜单因素条件。
1.2.4.1 提取溶剂对提取效果的影响 称取白鹃梅
粉末(60 目)10.00 g，按料液比 1∶25(g /mL)分别加入
体积比为 0∶1、1∶0、1∶1、2∶3、1∶2、1∶4 的乙酸乙酯、无水
乙醇混合溶液于 250 mL 烧瓶中，在 45 ℃，300 W 的
微波功率下提取 60 min。
1.2.4.2 微波功率对提取效果的影响 称取白鹃梅
粉末(60 目)10.00 g，按料液比 1∶25(g /mL)加入体积
比为 1∶1 的乙酸乙酯、无水乙醇混合溶液于 250 mL
烧瓶中，于 45 ℃，分别在 100、200、300、400、500 W
的微波功率下提取 60 min。
1.2.4.3 提取时间对提取效果的影响 称取白鹃梅
粉末(60 目)10.00 g，按料液比 1∶25(g /mL)加入体积
比为 1∶1 的乙酸乙酯、无水乙醇混合溶液于 250 mL
烧瓶中，在 45 ℃，300 W的微波功率下分别提取 30、
40、50、60、70 min。
1.2.4.4 料液比对提取效果的影响 称取白鹃梅粉
末(60 目)10.00 g，按料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、
1∶30(g /mL)分别加入体积比为 1 ∶1 的乙酸乙酯、无
水乙醇混合溶液于 250 mL 烧瓶中，在 45 ℃，300 W
的微波功率下提取 60 min。
1.2.4.5 提取温度对提取效果的影响 称取白鹃梅
粉末(60 目)10.00 g，按料液比 1∶25(g /mL)加入体积
比为 1∶1 的乙酸乙酯、无水乙醇混合溶液于 250 mL
烧瓶中，分别在 35、40、45、50、55 ℃，300 W 的微波功
率下提取 60 min。
1.2.5 响应面分析与优化的设计 根据单因素实验
结果，利用 Box－ Behnken 中心组合实验，设计料液
比、温度、提取时间、微波功率四因素三水平中心组
合实验，利用 Design－Expert软件进行响应面分析，建
立四元二次回归方程，确定白鹃梅黄酮的最佳提取
工艺条件。
表 1 四因素三水平中心组合实验因素水平编码表
Table 1 Four factors and three levels of
central composite experiment factor level table
水平
因素
X1 微波功率
(W)
X2 提取时间
(min)
X3 料液比
(g /mL)
X4 提取温度
(℃)
－ 1 200 50 1∶20 40
0 300 60 1∶25 45
1 400 70 1∶30 50
1.2.6 白鹃梅中黄酮类化合物的抗氧化实验 采用
响应面法得到的最佳提取工艺进行总黄酮的提取;
将提取液浓缩并经 Sevage 法(正丁醇∶氯仿 = 1∶5)脱
蛋白，重复脱除 3 次;上 AB－8 大孔树脂［7］层析柱，利
用 90%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，经检测洗脱液
中总黄酮含量达到 91.45%;旋蒸干燥得到白鹃梅总
黄酮粉末。
1.2.6.1 清除 DPPH·能力测定 不同浓度(0.2、0.4、
0.6、0.8、1.0、1.2 mg /mL)样品溶液 2 mL，加入
0.2 mmol /L DPPH乙醇溶液 2 mL，并以 2 mL 的无水
乙醇作为对照，以蒸馏水作为参比。在室温下避光
30 min，517 nm波长下测定吸光值。以 VC，BHT作为
阳性参照。3 次平行实验取平均值。
清除率(%)= 1－(Asample－Ablank)/Acontrol × 100
注:ASample:样品溶液 + DPPH 的吸光度;AbLank:样
品溶液 +乙醇的吸光度;Acontrol:蒸馏水 + DPPH·的吸
光度。
1.2.6.2 清除羟自由基(·OH)能力测定 不同浓度
(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg /mL)样品溶液 2 mL，依
次加入 2.0 mL 6 mmol /L 的 FeSO4 溶液，2.0 mL
6 mmol /L的 H2O2 溶液，摇匀，反应 10 min，加入
2.0 mL 6 mmol /L 的水杨酸乙醇溶液，摇匀，反应
30 min，510 nm下测吸光值，以 VC、BHT 作为阳性参
照，3 次平行实验取平均值。
241
清除率(%)= 1－(Asample－Ablank)/Acontrol × 100
注:ASample:样品溶液的吸光度;Ablank:无水杨酸时
吸光度;Acontrol:空白对照吸光度。
1.2.6.3 清除超氧自由基(O －2·)能力测定 不同浓
度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg /mL)样品溶液 2 mL，
依次加入 2.0 mL 的 0.05 mol /mL Tris － HCL 溶液
(pH8.2)、0.1 mmol /mL 的连苯三酚溶液，震荡摇匀。
325 nm波长下每隔 30 s测定一次。以 VC，BHT作为
阳性参照。
清除率(%)= 1－Asample /Acontrol × 100
注:Acontrol:蒸馏水代替样品溶液吸光值;Asample:样
品溶液吸光值。
1.2.7 统计分析 用 Microsoft office Excel 软件对数
据进行处理，并计算出半抑制质量浓度 IC50
(concentration for 50% of maximum effect，IC［8］50 );利用
SPSS软件检验各平均数之间的差异显著性，p ＜ 0.05
说明具有意义。
2 结果与分析
2.1 总黄酮标准曲线方程
如图 1 所示，回归方程为 A = 10.975C + 0.0037，
(Ｒ2 = 0.9998)。式中 A为吸光度;C为总黄酮的质量
浓度(mg /mL)。结果表明，芦丁质量浓度在 0.02～
0.1 mg /mL之间时，线性关系良好。
图 1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standard cure of rutin
2.2 单因素实验结果
由图 2 看出，当混合溶剂(V乙酸乙酯 ∶V乙醇 = 1∶1)时，
白鹃梅总黄酮提取量最高。提取溶剂对实验结果影
响不显著。实验最终提取溶剂为乙酸乙酯 ∶乙醇
(v∶v)= 1∶1。
图 2 提取溶剂对总黄酮提取量的影响
Fig.2 Effect of solvent on
yield of total flavonoids from Exochorda racemosa
由图 3 可知，微波功率达到 300 W 时，总黄酮的
提取量达到最大值。功率增大总黄酮的提取量呈明
显的下降趋势，可能是功率过大，微波产生的热量过
多，降低质点间的能量传递［9］从而导致黄酮类物质的
提取量降低。而且微波功率对提取结果影响显著。
因此选择适宜的微波功率为 300 W。
图 3 微波功率对总黄酮提取量的影响
Fig.3 Effect of microwave power on
yield of total flavonoids from Exochorda racemosa
由图 4 可知，提取时间对总黄酮提取量影响显
著。时间超过 60 min后，总黄酮提取量开始下降，可
能是由于时间太长导致黄酮类物质的热分解［10－11］损
失，所以选择适宜提取时间为 60 min。
图 4 提取时间对总黄酮提取量的影响
Fig.4 Effect of time on yield of
total flavonoids from Exochorda racemosa
由图 5 知，当料液比在 1 ∶25 g /mL，总黄酮的提
取量达到最大，料液比进一步增加，黄酮类化合物总
提取量变化不大。并且，料液比对实验结果影响不
显著;为了节约原料及成本选取适宜的料液比为
1∶25 g /mL。
由图 6 可知，提取温度达到 45 ℃时，总黄酮的提
取量最大;温度继续升高，总黄酮提取量下降。主要
原因是温度过高，一部分黄酮氧化分解［12－13］或是溶剂
挥发剧烈而用于提取的有效溶剂相对减少所致。由
图可知，温度对提取结果的影响显著。因此选择适
宜的提取温度为 45 ℃。
2.3 Box－Behnken实验设计结果与响应面法分析
2.3.1 Box－Behnken 实验设计结果 根据单因素实
验结果，利用 Box－Behnken 中心组合实验的设计原
理，设计微波功率、提取时间、料液比、提取温度四因
素三水平 29 个实验点的响应面分析实验。实验结
果见表 2。
2.3.2 模型的建立及显著性检验 将所得的实验数
242
图 5 料液比对总黄酮提取量的影响
Fig.5 Effect of solid to liquid ratio on
yield of total flavonoids from Exochorda racemosa
图 6 温度对总黄酮提取量的影响
Fig.6 Effect of temperature on yield of
total flavonoids from Exochorda racemosa
据采用 Design Expert 8.0.6 软件进行多元回归拟合分
析，得到以总黄酮提取量(Y)为目标函数的多元二次
回归方程:
Y = 14.45200 + 0.23000X1 + 0.70083X2 －
0.036667X3 + 0.24083X4 + 0.45000X1X2 － 0.21500X1X3
+ 0.40000X1X4 + 0.17750X2X3 + 0.16000X2X4 －
0.067500X3X4 －0.25850X1
2 － 1.43225X2
2 － 0.41350X3
2
－ 0.37475X4
2
由表 3 可知，回归模型的 p ＜ 0.0001，说明该模型
极显著，其响应值与各实验因素之间存在显著的线
性相关性。回归决定系数 Ｒ2 = 0.9677，说明响应值变
化有 96.77%的来源于所选因素的变化;模型修正系
数 Ｒ2Adj = 0.9353，说明该模型能反映 93.53%响应值的
变化，因而该模型拟合程度较好。同时失拟项不显
著(p ＞ 0.05) ，也进一步表明回归方程可以较好地描
述各因素与响应值之间的真实关系，综上可以确定
回归方程为白鹃梅的微波提取工艺的优化提供了一
个合适的模型。
2.3.3 响应面分析与优化 表 3 方差分析中可以看
出微波功率 X1、提取时间 X2、提取温度 X4 的 P 直均
小于 0.01，说明这三个因素对黄酮提取量的影响显
著，影响顺序从大到小依次为:X2 ＞ X4 ＞ X1。交互项
对白鹃梅总黄酮提取量的影响均不显著。二次项
X2
2、X3
2、X4
2 对总黄酮提取量具有极显著影响。
由表 3 可知，所选因素对响应值影响强弱次序
为:提取时间 ＞提取温度 ＞微波功率 ＞料液比;微波
功率与提取时间、微波功率与料液比、微波功率与微
波温度、微波时间与料液比、微波时间与温度、料液
比与微波温度交互作用影响不显著。
表 2 Box－Behnken实验设计及结果
Table 2 Experiment design and
results of Box－Behnken
实验号 X1 X2 X3 X4
总黄酮提取量
(mg /g)
1 1 1 0 0 13.73
2 1 0 0 1 14.34
3 － 1 0 0 1 13.74
4 0 0 － 1 － 1 13.43
5 0 1 0 － 1 12.73
6 0 0 0 0 14.43
7 0 － 1 1 0 11.67
8 0 1 － 1 0 13.22
9 － 1 0 － 1 0 13.19
10 － 1 0 1 0 13.35
11 0 0 1 － 1 13.61
12 1 0 － 1 0 14.31
13 0 0 0 0 14.56
14 0 0 － 1 1 14.15
15 0 1 1 0 13.58
16 0 0 0 0 14.43
17 － 1 － 1 0 0 12.18
18 1 0 1 0 13.61
19 － 1 1 0 0 13.47
20 0 － 1 － 1 0 12.02
21 0 0 0 0 14.28
22 0 0 1 1 14.06
23 0 － 1 0 1 11.91
24 0 0 0 0 14.56
25 1 － 1 0 0 12.26
26 0 1 0 1 13.5
27 － 1 0 0 － 1 13.41
28 1 0 0 － 1 13.85
29 0 － 1 0 － 1 11.78
由岭嵴分析得到白鹃梅黄酮类化合物最佳微波
提取工艺条件:微波功率 357 W，提取时间 62.7 min，
料液比 1∶26 g /mL，提取温度 47 ℃，理论最佳提取量
为 14.67 mg /g。
2.3.4 验证实验 根据实际情况设定微波功率
357 W，提取时间 63 min，料液比 1∶26 g /mL，提取温
度 47 ℃进行 3 次平行实验，取平均值，得到白鹃梅总
黄酮提取量为 14.59 mg /g，与预测值较为接近，拟合
性好。实验结果验证了所建模型的正确性，说明响
应面法适用于微波提取白鹃梅黄酮类化合物工艺条
件的回归分析和参数优化。
2.4 白鹃梅总黄酮抗氧化活性分析
由图 7 可以看出，随着浓度的增加，VC、白鹃梅
总黄酮以及 BHT对 DPPH·的清除能力呈线性增加，
其中 VC 对 DPPH·的清除效果最好，白鹃梅黄酮对
DPPH·的清除效果好于 BHT，当浓度达到 1.2 mg /mL
时，白鹃梅黄酮对 DPPH·的清除率达到94.23%，VC
以及 BHT 分别为 95.79%，41.21%。由图可以看出，
243
表 3 回归方程方差分析
Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 2.29 14 0.151 29.91 ＜ 0.0001 ＊＊
X1 0.63 1 0.63 12.55 0.0033 ＊＊
X2 5.89 1 0.589 116.49 ＜ 0.0001 ＊＊
X3 0.06 1 0.02 0.32 0.5812
X4 0.70 1 0.70 13.76 0.0023 ＊＊
X1X2 8.100E－003 1 8.100E－003 0.16 0.6951
X1X3 0.18 1 0.18 3.65 0.0766
X1X4 6.400E－003 1 6.40E－003 0.13 0.7274
X2X3 0.13 1 0.13 2.49 0.1368
X2X4 0.10 1 0.10 2.02 0.1767
X3X4 0.018 1 0.018 0.36 0.5580
X1
2 0.43 1 0.43 8.57 0.0110 *
X2
2 13.31 1 13.31 262.98 ＜ 0.0001 ＊＊
X3
2 1.11 1 1.11 21.92 0.0004 ＊＊
X4
2 0.91 1 0.91 18.00 0.0008 ＊＊
残差 0.071 14 0.051
失拟项 0.065 10 0.065 4.86 0.0706
纯误差 0.0054 4 0.013
总离差 2.19 28
Ｒ2 = 0.9677 Ｒ2Adj = 0.9353
注:＊＊.差异极显著，p ＜ 0.01;* .差异显著，p ＜ 0.05。
三者对 DPPH·的清除能力大小顺序为:VC ＞白鹃梅
黄酮 ＞ BHT。由表 4 可以看出总黄酮对 DPPH·的
IC50值为 0.52 mg /mL。
图 7 对 DPPH的清除效果
Fig.7 Scavenging capacity of VC，
total flavonoids，BHT for DPPH·
由图8可以看出，白鹃梅总黄酮对羟自由基的清
除力也是线性增加的，与 VC 相比，总黄酮以及 BHT
的清除效果微差，当浓度为 1.2 mg /mL 时，三者的清
除率分别为 94.07%、85.35%、75.36%。对·OH 的清
除能力大小顺序为:VC ＞白鹃梅黄酮 ＞ BHT。由表 4
可以看出总黄酮的 IC50值为 0.55 mg /mL。
由图 9 可以看出，白鹃梅总黄酮对过氧化自由
基的清除效果远远低于 VC 以及 BHT，当浓度为
1.2 mg /mL时，清除率仅为 51.02%。此时，VC 以及
BHT的清除率为 95.41%，89.15%。可见，总黄酮对
过氧化自由基的清除能力有限。三者对过氧化自由
基清除能力大小顺序为:VC ＞ BHT ＞ 白鹃梅黄酮。
由表 4 可以看出，总黄酮对过氧化自由基的 IC50值为
1.18 mg /mL。
图 8 对·OH的清除效果
Fig.8 Scavenging capacity of VC，
total flavonoids，BHT for·OH
表4 白鹃梅总黄黄酮抗氧化能力 IC50值
Table 4 IC50 values of total flavonoids
in Exochorda racemos
自由基 线性回归方程
相关系数
(Ｒ2)
IC50值
(mg /mL)
DPPH· Y =66.69X = 15.08 0.9930 0.52
·OH Y =57.32X + 18.33 0.9922 0.55
O －2· Y =21.66X = 24.39 0.9810 1.18
综上所述，从 IC50值可以看出，白鹃梅总黄酮对
三种自由基的清除能力不同，这主要因为黄酮类化
合物对自由基的清除能力与其结构［14－15］有关，羟基的
数量、位置直接影响抗氧化活性的高低。
244
图9 对 O －2·的清除效果
Fig.9 Scavenging capacity of VC，
total flavonoids，BHT for O －2·
3 结论
通过单因素实验和 Box－Behnken 中心组合实验
以及响应面分析对微波辅助提取白鹃梅中黄酮类化
合物提取工艺进行优化，得出最佳工艺条件为:微波
功率 357 W，提取时间 63 min，料液比 1∶26 g /mL，提
取温度 47 ℃，总黄酮的提取量为 14.59 mg /g，并得到
影响提取量主要因素变量的二次多元回归模型，该
模型的回归极为显著，对实验拟和性好。
白鹃梅总黄酮清除三种自由基的强弱顺序为:
DPPH·＞·OH ＞ O －2·，对 DPPH 以及 OH 自由基有很
好的清除效果，对过氧化自由基的清除能力则较低;
并且，在一定的范围内，对三种自由基的清除效果与
总黄酮浓度呈良好的线性关系。
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