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垂丝海棠组培再生体系建立的研究
张庆田1 ,夏阳2 ,孙仲序1 ,刘燕苓1 ,陈兴彬1(1.山东农业大学园艺科学与工程学院 ,山东 泰安 271018 ;2.山东省林业科学研究院 , 山东 济南 250014)
摘要:目的:通过对垂丝海棠(Malus halliana koehne)进行组织培养研究为木本观赏海棠提供技术支持。方法:采用常规组培
手段及正交设计试验对外植体消毒时间 、快繁培养 、叶片愈伤诱导 、再生 、生根等进行研究 。结果:外植体最佳消毒时间:75%酒
精 30s+0.1%升汞 10min;最适增殖培养基为:MS+6-BA 0.7mg L+NAA 0.3mg L, 增殖系数可达 7;正交设计结果显示激素对叶
片愈伤组织诱导影响的因素大小为:2 , 4-D>6-BA>NAA;再生最佳配方为 6-BA 6.0mg L +NAA 0.5mg L再生效率达 91.8%;
最适生根培养基为:1 2MS+IBA 0.3mg L+蔗糖 20g L。结论:对垂丝海棠组培再生研究取得初步成功。
关键词:垂丝海棠;组织培养;再生;观赏植物
中图分类号:S722.37　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)03-0073-03
Establishment of Regeneration System of Malus halliana koehne by Tissue Culture
ZHANG Qing-tian1 , XIA Yang2 , SUN Zhong-xu1 ,LIU Yan-ling1 ,CHEN Xing-bin1
(1.Horticulture Department , Shandong Agriculture University , Tai an 271018 , China;2.Forestry Academy of Shandong , Jinan 250014 ,China)
Abstract:Objective:Technical support would be provided to woody ornamental by tissue culture of Malus halliana koehne.Methods:Conven-
tional tissue culture methods and orthogonal design had been researched for explants disinfection , rapid reproduction , leaves callus induction , re-
generation , rooting.Results:The optimum sterilization times of explants were 75% alcohol 30s+0.1% mercuric chloride 10min .The most suit-
able medium for the initiation of adventitious buds was MS medium supplemented with 0.7mg L 6-BA and 0.3mg L NAA , and the ratio of buds
propagation is 7;The results showed harmone on the leaves orthogonal design factors affecting the size of the callus induction:2 4-D>6-BA>
NAA;The best regeneration tissue culture was MS+6-BA 6.0 mg L+NAA 0.5mg L;The regeneration efficiency was 91.8%.The best root-
age culture medium is 1 2MS+IBA 0.3mg L+sucrose 20g L was most suitable for the rootage.Conclusion:Tissue culture of Malus halliana
koehne was success.
Key words:Malus halliana koehne;tissue culture;regeneration;ornamental
收稿日期:2006-12-09;修回日期:2007-01-15
作者简介:张庆田(1981-), 男 , 硕士 , 从事植物生物技术研究 , E-
mail:zqt123_1981@126.com;＊通讯作者:孙仲序(1946-),男 ,教授 ,从
事树木遗传育种教学和植物生物技术研究 , 发表论文 50 多篇 , E-
mail:abcde05@126.com ,Tel:0538-8242981。
　　垂丝海棠(Malus halliana koehne)是木本观赏植物 ,素有花
中神仙之美称 ,是蔷薇科苹果属的著名庭园观赏树种。 广泛
分布于我国华东及西南地区 , 全国各地均有栽培。垂丝海棠
还是盆栽和制作盆景的优良花木。其花入药能调经和药 , 治
红崩;果实小 , 营养物质丰富 ,据分析 , 每 100g成熟的果实可食
用部分含胡萝卜素 0.386mg、硫胺素 0.008mg 、核黄素 0.016mg 、
尼克酸 0.16mg、抗坏血酸 1.6mg、蛋白质 0.16g、脂肪 0.16g、糖
18.4g、粗纤维1.42g、无机盐 0.5g。成熟的垂丝海棠为黄色 ,风
味独特 ,香气浓郁幽雅 , 但果实个体小 ,单朵均重(0.4 ～ 0.5)g ,
内含种子 3 ～ 4 粒 , 可食用部分占 84.9%, 是加工果汁饮料的
理想原料[ 1] 。
目前多采用嫁接繁殖 , 而利用生物技术手段对木本观赏
海棠进行组织培养及基因遗传转化的研究少有报道 , 作者以
此为切入点进行垂丝海棠研究 , 采用常规组培方法操作研究 ,
为木本海棠组织培养提供技术参考 , 同时建立垂丝海棠高效
快繁再生体系 ,为其组培快繁以及遗传转化育种开辟一条有
效可行的途径。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　试验材料
试材取自山东农业大学实验苗圃栽种的 4年生垂丝海棠
冬季休眠后的枝条。
1.1.2　试剂
试验试剂均为分析纯 , 植物激素购于上海稼丰园艺用品
有限公司 ,琼脂粉购于济南普朗特生物科技有限公司。
1.1.3　培养基
基本培养基MS 每升培养基中加入 30g 蔗糖 , 6.5g 琼脂 ,
调整培养基 pH 值至 5.8 , 培养基在 11kg cm2(121℃)压力下消
毒 20～ 25min , 激素为 6-BA、IBA、2 , 4-D、NAA。
1.2　方法
1.2.1　外植体处理
将垂丝海棠休眠后枝条水培催芽 , 待芽长 2cm 左右在无
菌条件下用 75%酒精和 0.1%升汞(HgCl2)消毒外植体 , 消毒
后用无菌水冲洗 4 ～ 5 次 , 材料切成 0.8 ～ 1.0cm 长段 , 在无菌
条件下接种于 MS 培养基上。
1.2.2　消毒时间
酒精 30s ,HgCl2 5、10、15min处理对垂丝海棠污染率和褐化
率的影响。每一处理的茎段数为 30 个 , 为防止交叉污染每瓶
装 1 个 ,共 30 瓶 ,每次处理设 3 次重复 , 20d后调查试验结果。
1.2.3　激素配比
将外植体接种到含 6-BA 0.5、0.7、1.0mg L , NAA 0.1、
0.3mg L不同配比的培养基中对增殖进行研究每一处理 5 瓶 ,
每瓶 1 株 , 3次重复。组合及结果见表 3。
1.2.4　琼脂浓度
分别用含 6.5g 、7.0g、7.5g、8.0g、8.5g 琼脂含量的培养基
研究对玻璃化现象的影响究每一处理 5 瓶 , 每瓶 1 株 , 3 次重
复。结果见表 4。
1.2.5　愈伤组织的诱导
采用三因素三水平正交试验法对垂丝海棠叶片愈伤组织
诱导率进行研究 , 各因素水平见表 1。每一处理 10 瓶 ,每瓶 4
片叶 , 3 次重复。结果见表 5。
表 1　正交试验因素水平表 L9(34)
Tab.1　Chart of factor and level
水平 level A(NAA)(mg L)B(2, 4-D)(mg L) C(6-BA)(mg L)
1 0 0 1
2 0.1 1 2
3 0.3 2 3
1.2.6　生根
选取健壮苗接种到 1 2MS+IBA0.3mg L+蔗糖 20g L 上
进行生根试验 , 重复 3次 , 每次 30瓶 , 每瓶 1 株。
1.2.7　统计分析
第 17卷第 3 期:73
2007 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.3:73
Jun.2007
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2007.03.027
愈伤组织诱导率(%)=(诱导出现愈伤组织的叶片数 接
种叶片总数)×100%
再生频率(%)=(再生出不定芽的叶片数 接种叶片总数)
×100%
对垂丝海棠叶片愈伤组织诱导率的影响采用直观分析和
方差分析。
2　结果与分析
2.1　消毒时间对污染 、褐化的影响
在植物正常的生长状态下 , 植物细胞中醌类物质水平较
低。当细胞受伤或衰老时 , 在适当的条件(如 pH 、温度等)下 ,
细胞中的酚类物质和氧气在酚氧化酶的作用下发生氧化反
应 ,形成大量有毒的醌类物质。在组织培养时 ,当外植体或培
养物被切割和接种时 ,损伤的切面细胞中酚类物质被氧化成
醌 ,使培养物的切面变成棕褐色或暗褐色而发生褐变。 醌会
逐渐扩散到培养基中 ,抑制其他酶的活性 ,毒害整个组织[2]此
外 ,由于组织老化也能引起褐化 , 因此在愈伤组织培养[3]细胞
悬浮培养[ 4]原生质体培养中也存在褐化现象本实验中发现不
同消毒时间对褐化程度影响不同。
由表 2看 , 随着处理时间的延长污染率下降 , 但褐化率上
升 ,可能是由于外植体随消毒时间的延长受到伤害加重 , 醌类
物质形成造成的。褐化也是我们建立无菌外植体应予以避免
的。(褐化现象在我们的另一种植物材料木瓜海棠中未发现)
可见不同外植体基因型褐化程度也不一样。 本实验 75%酒精
30s+0.1%HgCl2 10min效果最佳。
表 2　不同处理时间对垂丝海棠污染率的影响
Tab.2　Effect of different treatment time on pollution of Malus halliana koehn
HgCl2 处理时间(min)
Treatment time(min)
污染率(%)
Pollution(%)
褐化、死亡率(%)
Brownness、death(%)
成功率(%)
Success(%)
备注
Notes
5 70.0 12.5 17.5 褐化 、死亡
10 42.5 35.5 35.0 中长菌的归
15 27.5 45.0 27.5 到污染中。
2.2　不同 6-BA 和NAA 浓度组合对垂丝海棠增殖的影响
表 3　6-BA和NAA 对垂丝海棠试管苗增殖的影响
Tab.3　Effect of multiplication of different hormone concentration
编号
Treatment
基本培养基
Medium
BA
(mg L)
NAA
(mg L)
增殖系数
Multiplication
modulus
生长状况
Growth status
1 MS 0.5 0.1 2.5 良好
2 MS 0.5 0.3 3.4 良好
3 MS 0.7 0.1 5.2 良好
4 MS 0.7 0.3 7 良好
5 MS 1.0 0.3 9 玻璃化
　　由表 3可见 , 5 #培养基增殖系数最高 , 可达 9 , 但出现玻璃
化现象影响后期继续分化 , 因此选用 4#配方 MS+6 -BA
0.7mg L+NAA 0.3mg L为最适增殖培养基。
2.3　不同琼脂浓度对垂丝海棠玻璃化现象的影响
由于培养条件不当导致瓶苗出现玻璃化现象 , 试管苗叶
片 、嫩梢呈水晶透明或半透明 、水浸状;试管苗矮小肿胀 、失
绿;叶片皱缩成纵向卷曲 , 脆弱易碎 , 叶表面缺少角质层蜡质。
因此对减少玻璃化现象做了如下研究:将玻璃化苗转入增殖
培养基MS+6-BA 0.7mg L+ NAA 0.3mg L+不同琼脂浓度。
调整琼脂浓度后分化率见表 4。
从表中显示出随着琼脂浓度的提高 ,玻璃化从 15.42%降
低到 12.85% , 所以增加琼脂浓度起到了一定的作用 ,但是其
分化率却从 6.35%下降到 3.21%, 这可能因为琼脂用量低
时 ,培养基内水势过高 , 培养器皿内空气湿度大 , 有利于玻璃
苗的形成;其次则由于琼脂浓度越低 ,组培苗在相同时间内吸
收的激素越多 ,也造成玻璃苗的出现。
2.4　不同 6-BA 、2 , 4-D 和NAA浓度配比对垂丝海棠叶片愈
伤组织诱导及再生的影响
每处理用外植体 20 个重复 3 次 , 接种 30d 后调查愈伤组
织诱导率各组合对垂丝海棠叶片愈伤组织的影响 , 进行极差
分析见表 5 , 6-BA 、2 , 4-D 和 NAA对垂丝海棠叶片愈伤组织
的影响大小为:2 , 4-D>6-BA >NAA , 进一步方差分析结果
显示 2 , 4-D和 6-BA对叶片愈伤组织的诱导达到显著水平 。
表 4　琼脂浓度对玻璃化现象的影响
Tab.4　Effect of different argar concent ration on vitrification
琼脂浓度(g L)
Concention
分化率(%)
Multiplicat ion(%)
玻璃化程度(%)
Vitrification(%)
6.5(CK) 6.35 15.42
7.0 5.16 15.13
7.5 4.89 13.28
8.0 3.74 13.03
8.5 3.21 12.85
表 5　试验结果直观分析
Tab.5　Test result visual analysis
组合
Treatment NAA 2 ,4-D BA
愈伤诱导率(%)
Callus(%)
平均(%)
Average(%)
1 1 1 1 0.00 0.00 0.00 0.00
2 1 2 2 100.00 100.00 100.00 100.00
3 1 3 3 100.00 100.00 100.00 100.00
4 2 1 2 73.00 72.00 76.00 73.67
5 2 2 3 88.00 84.00 92.00 88.00
6 2 3 1 75.00 79.00 76.00 76.67
7 3 1 3 69.00 68.00 70.00 69.00
8 3 2 1 78.00 87.00 75.00 80.00
9 3 3 2 86.00 94.00 96.00 92.00
K1 200.00 142.67 156.67
K2 238.33 268.00 265.67
K3 241.00 268.67 257.00
k1 66.67 47.56 52.22
k2 79.44 89.33 88.56
k3 80.33 89.56 85.67
R 13.67 42.00 36.33
表 6　试验结果方差分析
Tab.6　Test result equation analysis
影响因素
Factors
方差
SS
自由度
DF
标准差
MS
F值
F value
显著性
Notability
A 350.83951 2 175.4198 2.898941
B 3509.4321 2 1754.716 28.99798 显著
C 2446.9877 2 1223.494 20.21914 显著
误差 1089.2099 18 60.51166
F0.95(2., 18)=3.55 ,F0.99(2 , 18)=6.01
　　将上述诱导的愈伤组织转入 6-BA 6.0mg L +NAA
0.5mg L中进行两步诱导法得到叶片再生率仅为 45.8%, 远远
低于 6-BA和 NAA组合的直接诱导再生法。
利用 6-BA和 NAA 的不同组合对垂丝海棠叶片再生进
行一步诱导研究 , 暗培 15d 后见光 , 3d 后即可见到部分叶片出
现芽点 , 培养 30d 后统计结果。结果见表 7。
表 7　不同 6-BA和 NAA 浓度配比对垂丝海棠叶片再生率的影响
Tab.7　Effect of different 6-BA and NAA to adventitious bud inducing
配方(mg L)
Treatment
再生率(%)
Regeneration(%)
6-BA 6.0+NAA 0.2 75
6-BA 4.0+NAA 0.2 83
6-BA 6.0+NAA 0.5 91.8
74　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷第 3期
　　由表 7 可见一步诱导法在 MS +6-BA 6.0mg L +NAA
0.5mg L上再生率可达 91.8%。
2.6　生根及移栽
再生的丛生芽从愈伤上切下 ,转移到生根培养基 1 2MS+
IBA 0.3mg L+蔗糖 20g L 上 , 15d 左右就会有根的产生 30d 后
生根率可达 95%以上 , 挑选苗龄 40d 以上 ,叶片达 4 片以上叶
柄较长 ,高度在 2cm 以上的健壮试管苗 , 放入温室进行 10 ～
15d闭瓶炼苗 , 再进行 1～ 10d 开瓶炼苗 ,成活率可达95.8%。
图 1　垂丝海棠再生苗
Fig.1　Regeneration plants
图 2　垂丝海棠快繁苗
Fig.2　Proliferation plants
图 3　垂丝海棠生根苗
Fig.3　Vitrification plants
图 4　垂丝海棠生根苗
Fig.4　Rootage plants
3　讨论
植物组织培养过程中 ,外植体的褐变程度受取材时期 、外
植体类型和消毒时间的影响 , 由于不同植物中酚氧化酶的活
性不同 ,所含酚类物质的含量和种类不同 , 不同植物褐变发生
的程度差异较大。不同植物材料合适的取材时期不尽相同。
灭菌时间对外植体的褐变率也有重要影响 , 本试验随着灭菌
时间的延长 , 所受药害越重 , 褐变死亡率增加 ,而存活率降低
的结果与刘艳芬等[ 5] 的研究结果一致。
许多研究表明 , 培养材料的种类和外植体类型培养基成
分和培养条件如光照 、温度 、湿度 、pH 值等各种内外因素都影
响玻璃苗的发生[ 6] 。选择较高的琼脂浓度可以显著地降低玻
璃化。张燕玲等[ 7]研究表明 , 琼脂作为固体培养基的凝固剂 ,
它能影响培养体系的水分状况 , 从而影响试管苗的玻璃化。
在MS+BA 0.5mg L的培养基上 , 分别加入5 , 7 , 9g L的琼脂 ,
丝石竹的玻璃苗率分别为 95%、85%和 65%, 即玻璃苗率与
琼脂用量呈明显的负相关关系。杜启兰[ 8] 在丽佳秋海棠 ,
Leshem B[9]在香石竹离体培养中也得到了类似的结果;本实验
也得到了同样的结论。 本试验琼脂用量由 6.5g 增加到 8.5g
时玻璃化率由 15.42%降低到 12.85%。因此 , 适当增加培养
基中的琼脂用量可有效地减少玻璃苗数量。
植物叶片分化不定芽通常有两种途径:一种途径为先形
成愈伤组织 ,然后再诱导愈伤组织再生不定芽;另一种为叶片
直接再生不定芽。从已有的文献看 , 诱导叶片直接再生不定
芽的研究占了相当大的比例。叶片直接再生不定芽可以减少
或避免因组织培养引起的遗传突变 , 有助于转基因的成功。
影响叶片再生体系建立的因素很多 , 非常复杂。如受试品种
的基因型 、试管苗苗龄 、培养基条件 、外植体生理状态及暗处
理等。
许多学者的研究表明 , 暗培养能促进苹果叶片再生 , 而前
期光照处理则明显抑制叶片再生[ 10] 。这可能是因为红光抑制
不定芽形成 , 远红光促进不定芽的形成 ,而白炽灯发出的红光
要比远红光多 , 直接在光照下培养 , 不定芽的形成受到红光抑
制 , 导致再生频率大大降低[ 11] 。暗培养时间会因品种不同而
有所不同 , 苹果千秋的离体叶片一般需要暗处理 35d 左右;但
有些苹果主栽品种的叶片再生以暗 15d 为最好[ 12] 。因此 , 为
得到较高的再生效率 , 需通过黑暗培养试验 , 找出最适宜的暗
培养时间 ,本试验以暗 15d 为标准进行研究 , 不同黑暗天数对
再生效率的影响有待进一步研究。
在再生培养基中 , 植物激素的种类和浓度是影响苹果离
体叶片再生最主要因素之一 , 细胞分裂素和生长素对苹果离
体叶片的再生是必需的 , 不同基因型品种所用最适浓度不同。
吴雅琴等[13]在研究指出与 BA 相比 , TDZ 更适于昌红苹果离
体叶片再生 , 。当TDZ浓度为 1.0mg L、NAA 0.5mg L时叶片平
均再生率可达 100%,但 TDZ再生的芽呈簇状 , 茎难以伸长 , 不
如 BA再生的芽健壮 , 本试验一步诱导法 MS+6-BA 6.0mg L
+NAA 0.5mg L上再生率可达 91.8%。其它激素的组合对垂
丝海棠叶片再生的影响有待进一步研究。
总之 ,木本植物植株再生的研究起步较晚而且影响因素
众多 , 本试验只是以几个因素为切入点其它众多因素对组织
培养再生的影响有待进一步研究 , 建立起更多木本植物尤其
是观赏类植物的高效稳定的不同方式的再生体系 , 为基因工
程育种和诱变育种奠定基础;进一步扩展研究对象 , 以便加强
种质资源的离体保存。建立同烟草 、拟南芥 、苜蓿等草本植物
一样的木本植物植株再生的模式体系 , 系统的研究木本植物
植株再生的发生及其调控机制 , 从而更好地利用植物细胞的
全能性;深入开展再生植株遗传变异性的研究。
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