全 文 ：2010 年 20(3) 生 物 技 术
提取率大约为 4. 2%。
表 6 正交试验结果
Table 6 Results of the orthogonal design on pigment extraction
No A B C D 吸光度
1 1 1 1 1 0. 35
2 1 2 2 2 0. 28
3 1 3 3 3 0. 245
4 2 1 2 3 0. 36
5 2 2 3 1 0. 105
6 2 3 1 2 0. 6
7 3 1 3 2 0. 15
8 3 2 1 3 0. 49
9 3 3 2 1 0. 21
K1 0. 292 0. 287 0. 480 0. 222
K2 0. 355 0. 292 0. 283 0. 343
K3 0. 283 0. 352 0. 167 0. 365
R 0. 072 0. 065 0. 313 0. 143
优方案 2 3 1 3
因素次序 C > D > A > B
2. 2 紫甘蓝色素抗氧化性测定
按照 1. 2. 2 的方法测定紫甘蓝色素清除 DPPH·能力，结
果见图 1。由图 1 可以看出，紫甘蓝色素具有较强的清除 DP-
PH自由基的能力，并且随着浓度的增加，清除能力增强。当
浓度为 0. 8mg /mL时，清除率达到 95%左右。但对照 Vc的浓
度为 0. 2 mg /mL时，对 DPPH 自由基的清除率就可达 93%左
右，并随着浓度的增加，基本保持稳定。说明紫甘蓝色素的浓
度达到 0. 8mg /mL后，其对 DPPH自由基的清除能力接近 0. 2
mg /mL的 Vc。
3 讨论
实验利用超声波辅助，在单因素实验基础上通过正交设
计对紫甘蓝色素提取工艺进行优化，利用 DPPH 法来检测了
该色素的抗氧化能力。由正交试验可知超声波辅助的最佳工
艺为浸提液 pH 1，液固比为 25∶ 1，提取温度为 50℃，浸提时间
为 50min，获得鲜艳的红色溶液;紫甘蓝色素具有优良的抗氧
化能力，浓度为 0. 8mg /mL的紫甘蓝色素清除 DPPH·相当于
0. 2 mg /mL的 Vc，可达 95%。
现代医学证明，多数合成色素对人体有害。天然食用色
素，安全无毒，色调诱人，还具有一定的营养价值，深受人们欢
迎。紫甘蓝在我国栽种面积大，产量大，色素含量高，该色素
在酸性条件下具有良好的稳定性［8，9］，具有广阔的开发前景。
图 1 紫甘蓝色素和 Vc对 DPPH自由基的清除作用
Fig. 1 Scavenging effect of purple cabbage pigment and Vc on DPPH radi-
cal
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药用植物佛甲草愈伤组织的诱导和培养
齐小晴，彭斌，胡云虹，余光辉*
(中南民族大学生命科学学院，生物技术国家民委重点实验室，湖北 武汉 430074)
摘要:目的:佛甲草(Sedum lineare Thunb)是景天科植物中具有多种药用功能的植物，其肉质多浆的特点是愈伤组织成功诱
导和培养的瓶颈。方法:以佛甲草的叶和茎为外植体，用正交试验对培养基中的激素浓度(2，4 － D、6 － BA和 Kt)进行配置，在配
置的 18 种培养基中筛选到适合佛甲草叶和茎愈伤组织诱导和继代的培养基配方。结果:MS + 3%蔗糖 + 2，4 － D 2 + Kt 1 和 MS
+ 3%蔗糖 + 2，4 － D 2 + 6 － BA 1 培养基对茎和叶愈伤组织的诱导率分别达到 70%和 80%左右，而MS + 3%蔗糖 + 2，4 － D 2 + 6
－ BA 1 更有利于佛甲草愈伤组织的继代培养。结论:在愈伤组织培养中，佛甲草的茎和叶都可以作为优良的外植体进行愈伤组
织的诱导和培养。实验结果为进一步通过组织培养手段提高佛甲草的药效成分提供了有益参考。
关键词:愈伤组织;外植体;药用植物;佛甲草
中图分类号:Q813. 1 文献标识码:A 文章编号:doi:10. 3969 / j. issn. 1004 － 311X. 2010. 03. 075
Callus Tissue Induction and Culture of Medicinal Plant Sedum lineare Thunb.
QI Xiao － qing，PENG Bin，HU Yun － hong，YU Guang － hui*
(Key Laboratory for Biotechnology of the State Ethnic Affairs Commission，College of Life Science，
South － Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)
Abstract:Objective:Sedum lineare Thunb is the highly important plant with a variety of medicinal function. To effectively enhance its
medicinal value，it is pertinent to conduct callus induction and successive transfer culture to achieve the purpose to enhance the accumula-
tion of secondary metabolites with medicinal ingredients. However，the feature of fleshy pulp is the bottleneck to be overcome in the callus
induction and culture. Method:The leaves and stems of Sedum lineare Thunb were used as explants and an optimum medium for callus
induction and successive transfer culture was screened. Using orthogonal experimental design to configure the concentration of hormones
(2，4 － D，6 － BA and Kt)in medium，18 kinds of culture medium was formulated for callus induction and succeeding culture. Result:
The medium formula of MS + 3% sucrose + 2，4 － D 2 + Kt 1 and MS + 3% sucrose + 2，4 － D 2 + 6 － BA 1 medium are optimized for
stem and leaf callus induction. The induction efficiency was reached about 70% and 80% respectively. However，the latter formula is
more readily suited to the callus succeeding culture. Conclusion:In the callus tissue culture，the stems and leaves can be used as excel-
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生 物 技 术 2010 年 20(3)
lent explants for callus induction and culture，with little difference in callus induction efficiency. Our results provided a useful reference
for further improving the medical efficacy of Sedum lineare Thunb by means of tissue culture.
Key words:callus tissue;explants;medicinal plants;Sedum lineare Thunb
收稿日期:2009 － 08 － 26，修回日期:2009 － 11 － 27
资助项目:中南民族大学植物发育遗传学术团队课题资助
作者简介:齐小晴(1990 －) ，女，生物技术专业本科生;* 通讯作者:
余光辉(1972 －) ，男，副教授，博士，研究方向:植物发育生物学，
Email:yusheen@ 163. com，Tel:027 － 67842689。
佛甲草(Sedum lineare Thunb )为景天科多年生草本植物。
由于其自身具有独特的光合途径———景天科酸 (CAM)代谢
途径，能够使该植物在 CO2 浓度极低的条件下仍能顺利进行
光合作用。同时，佛甲草具有节水、耐旱、耐寒、耐贫瘠和病虫
害少和管理费用低等特点，被广泛用于城市屋顶的绿化植
被［1 － 3］。除具有绿化功能外，佛甲草还具有重要的药用价值。
佛甲草全草性味甘寒，具有清热、解毒、消肿等功效［4］。佛甲
草提取液具有增强机体活力和适应能力及对抗机体疲劳的作
用［5］。随着人们对佛甲草药用价值的认识，野生药用佛甲草
的研究日益受到重视［6，7］。为避免野生资源遭到破坏性采集，
克服野生资源短缺、自然繁殖率低和人工栽培烂根等棘手问
题，组织培养技术日益显现出优势并得到广泛应用。植物的
组织培养技术在药用次生代谢产物的积累和生产上具有巨大
的应用前景［8，9］。尽管国内在红景天组织培养再生植株的研
究方面取得了一定进展［10］，但佛甲草的组织培养技术报道较
少。同时，佛甲草肉质多浆的特点是限制其组织培养成功的
重要因素。作者尝试对野生药用资源的佛甲草进行组织培养
探索，为实验室条件下研究其药用成分及其产量调控提供基
础和参考。
1 材料和方法
1. 1 材料
佛甲草(Sedum lineare Thunb)采自武汉市蛇山。以佛甲
草肉质茎或叶为外植体进行愈伤组织的诱导。将新鲜采摘的
茎与叶片先用清水冲洗干净，再用洗洁精清洗，后用无菌水反
复冲洗 2 ～ 3 次;然后在无菌操作台(净化工作台，上海新苗医
疗器械制造有限公司)上用 75%酒精消毒 30s，无菌水冲洗 2
～ 3 次，再用 5%次氯酸钠(NaClO)消毒 20min，无菌水冲洗 5
次后用灭菌的滤纸吸干外植体上的水分;然后用解剖刀将茎
切成 5 ～ 7mm 的小段，叶片切成 5mm ×5mm小块，再在外植体
上切几个伤口，然后将其放在愈伤组织诱导培养基上进行培
养。
1. 2 培养条件
愈伤组织诱导培养基以 MS 培养基［11］为基本培养基，同
时添加 3%蔗糖，培养基 pH 5. 8。在植物组织培养中 2，4 － D
是常用的生长素，它常和细胞分裂素配合调节植物的发育和
愈伤组织的诱导和继代。在本实验中，培养基中的细胞分裂
素用 6 －苄基氨基嘌呤(6 － BA)和激动素(kinetin Kt)。激素
的配置采取 2 因素 3 水平正交实验进行(表 1) ，培养基中添加
1%琼脂高压灭菌后制备成固体培养基进行愈伤组织的诱导。
激素的正交设计方案如表 2。培养温度为 26℃，黑暗培养。愈
伤组织块的大小用尺子进行测量。诱导率的差异显著性用
SPSS10. 0 软件进行统计分析。
表 1 激素的因素水平表
Table 1 Factor － level of different hormones
水平 1 2 3
2，4 － D (A) 2. 0 mg /L 1. 0 mg /L 0. 5 mg /L
KT (B) 1. 0 mg /L 0. 5 mg /L 0. 2 mg /L
6 － BA (C) 1. 0 mg /L 0. 5 mg /L 0. 2 mg /L
2，4 － D:2，4 －二氯苯氧乙酸;6 － BA:6 －苄基氨基嘌呤;Kt:kinet-
in，激动素。
表 2 正交试验设计方案
Table 2 Orthogonal experimental design
试验号
1 A1B1 A2B1 A2B1
2 A1B2 A2B2 A2B2
3 A1B3 A2B3 A2B3
4 A1C1 A2C1 A2C1
5 A1C2 A2C2 A2C2
6 A1C3 A2C3 A2C3
2 结果与分析
2. 1 愈伤组织诱导
经激素配比试验，在配置的 18 种愈伤组织诱导培养基
中，高浓度 2，4 － D(2 mg·L －1)的培养基对愈伤组织的诱导
效率明显高于低浓度 2，4 － D(≤1mg·L －1)的培养基的诱导
率;在 2，4 － D浓度固定的情况下，6 － BA 对愈伤组织的诱导
效率高于 Kt(激动素，kinetin)的诱导效率(表 3)。正交实验
的结果表明，MS + 3%蔗糖 + 2，4 － D 2mg·L －1(单位下同)+
Kt 1(A1B1 激素配比)和 MS + 3%蔗糖 + 2，4 － D 2 + 6 － BA 1
(A1B1 激素配比)两种培养基对愈伤组织的诱导率最高，分别
达到 70%和 80%左右，差异显著性达到极显著水平(P < 0.
01) ;这两种培养基对以茎和叶为外植体的愈伤组织诱导率差
别不大(P﹥ 0. 05) ，表明茎和叶细胞对外源激素的响应具有
相同的效应;A1B2 和 A1C2 激素配比的培养基对愈伤组织的
诱导达到显著水平(P < 0. 05) (表 3)。其它浓度的激素配比
对愈伤组织的诱导率较低。
表 3 不同激素水平对佛甲草愈伤组织诱导率的影响(3 次重复)
Table 3 Different effect of hormone concentration on Sedum lineare Thunb
callus induction efficiency(n = 3)
叶愈伤诱导率(%) 茎愈伤诱导率(%)
MS +3%蔗糖 + A1B1 73 74
MS +3%蔗糖 + A1B2 49* 45*
MS + 3%蔗糖 + A1B3 24 30
MS + 3%蔗糖 + A2B1 30 34
MS + 3%蔗糖 + A2B2 38 40
MS + 3%蔗糖 + A2B3 34 32
MS + 3%蔗糖 + A3B1 24 28
MS + 3%蔗糖 + A3B2 30 26
MS + 3%蔗糖 + A3B3 32 30
MS + 3%蔗糖 + A1C1 80 82
MS +3%蔗糖 + A1C2 49* 64*
MS + 3%蔗糖 + A1C3 35 32
MS + 3%蔗糖 + A2C1 39 33
MS + 3%蔗糖 + A2C2 40 38
MS + 3%蔗糖 + A2C3 34 43
MS + 3%蔗糖 + A3C1 17 24
MS + 3%蔗糖 + A3C2 14 21
MS + 3%蔗糖 + A3C3 10 12
* P < 0. 05， P < 0. 01.
2. 2 愈伤组织继代
在愈伤组织培养过程中，生长在 MS + 3%蔗糖 + 2，4 － D
2 + Kt 1(A1B1 激素配比)培养基上的愈伤组织生长缓慢，且
有逐步褐化和死亡现象，这一现象表明该培养基虽有利于愈
伤组织的诱导，但不利于愈伤组织的培养和继代。接种到 MS
+ 3%蔗糖 + 2，4 － D 2 + 6 － BA 1(A1C1 激素配比)培养基上
的外植体在培养 7 ～ 10d后出现膨大，此时膨大的组织仍为绿
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2010 年 20(3) 生 物 技 术
色;在培养 10 ～ 20 d后在绿色膨大的边缘会长出白色的愈伤
组织(图 1A) ;以茎为外植体，其愈伤组织的诱导类似于叶的
诱导(图 1B) ，表明茎和叶对外源激素的敏感性相同;在培养
20 ～ 40 d，愈伤组织慢慢长大，呈现质地松软的浅黄色(图 1C
－ D)。将愈伤组织转移到同一培养基上后愈伤组织生长良
好，质地松软呈乳白色且生长速度较快，培养 7d 的体积增大
率为 30%左右，20d需继代 1 次。这一结果表明 MS + 3%蔗糖
+ 2，4 － D 2 + 6 － BA 1 培养基可以作为优良的继代培养基对
愈伤组织进行继代培养。转移到 A1B2 和 A1C2 激素配比的
培养基上的愈伤组织生长缓慢，7 d 培养的愈伤组织体积增大
率仅为 5%左右，继续培养 15d后逐渐出现褐化现象。
图 1 生长在 A1C1 培养基上的佛甲草愈伤组织
Fig. 1 The callus of Sedum lineare Thunb grown on A1C1 medium formu-
las
A:佛甲草叶片愈伤诱导 20 d;B:佛甲草茎愈伤诱导 20 d;C:佛甲草叶
片愈伤诱导 40 d;D:佛甲草茎愈伤诱导 40 d。
3 讨论
佛甲草为景天科多浆植物，首载于《图经本草》，别名佛指
甲、半支连、狗牙半支、铁指甲等［4］。佛甲草是常用的民族民
间中草药，具有抗肝炎、止血和清热解毒等功能。为有效挖掘
和利用其潜在药用价值，需要对其进行组织培养，在实验室恒
定条件下研究其药用活性成分的合成及其调控。虽然肉质多
浆植物的组织培养较难成功，但本文通过激素配比试验，成功
筛选到佛甲草愈伤组织诱导和继代培养的培养基配方。本文
的结果对进一步研究其药用成分及其合成调控具有参考价
值。同科近属植物垂盆草的组织培养已有报道［12］，但佛甲草
的组织培养尚未见报道。
3. 1 不同激素水平对佛甲草叶愈伤组织的诱导效果不同
植物激素是影响植物组织培养的关键因素，不同的激素
水平会调控植物分化和去分化的过程［13］。同时不同部位、不
同生理阶段的外植体对激素刺激信号的反应类型和敏感程度
是不同的，这可能主要取决于外植体本身的内源激素水平，因
为外源激素最终是通过内源激素水平的调整变化起作用
的［14］。前人也有用 MS 作培养基质，研究生长素和分裂素配
比对愈伤组织诱导的影响［15］。在本研究中，我们在 MS 培养
基的基础上采用正交实验表来设计佛甲草叶和茎愈伤组织的
诱导培养基，并成功筛选到佛甲草叶和茎愈伤诱导和继代的
培养基。由于佛甲草为肉质多浆植物，其茎和叶的愈伤组织
的诱导没有明显区别(表 3，图 1)。实验中我们发现在 2，4 －
D浓度固定的情况下，6 － BA较之 Kt来说更有利于愈伤组织
的诱导(表 3)。在愈伤组织的诱导和继代培养中，2，4 － D的
浓度对愈伤组织的诱导起着关键的作用。在高浓度(2mg·
L －1)情况下，有利于佛甲草叶和茎愈伤组织的诱导。这一浓
度可能是促进了叶和茎细胞的去分化状态。在 2，4 － D 浓度
≤1mg·L －1的情况下，不利于愈伤组织的诱导和继代培养。
3. 2 植物组织培养是生产次生代谢产物的有效途径
景天科植物中含有丰富的药用成分［16，17］，其化学成分主
要有黄酮类、酪醇、红景天苷、谷甾醇、有机酸、挥发油、多糖、
脂肪、蛋白质等。药理学研究表明，红景天植物中的主要有效
成分红景天苷和苷元酪醇具有抗心律失常、调节免疫功能、镇
静、抗疲劳、抗缺氧、抗衰老、抗癌等作用［18］。佛甲草为景天科
植物，佛甲草愈伤组织的诱导和继代培养使次生代谢产物的
生产呈现出诱人的应用前景［5］。与完整植株生产次生代谢产
物相比，植物细胞培养具有独特的优势，这是因为在组织培养
条件下，植物的次生代谢占据了植物代谢途径的主导地位，植
物组织培养的可控性使得次生代谢产物的含量和合成速度明
显高于完整植株［8，9，19］。佛甲草独特的景天科酸代谢途径，其
肉质多浆的特点是限制愈伤组织成功诱导和培养的一个主要
因素。本文用激素配置的正交实验，以野生药用佛甲草的茎
和叶为外植体成功诱导出愈伤组织并能够进行继代培养，为
进一步进行药用成分的生产和调控提供了有益的参考。
致谢:感谢中南民族大学植物发育遗传学术团队课题资
助!
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