全 文 ：一测多评法测定垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素含量
郭燕娜Δ，胡华杰
(浙江省舟山医院 药剂科，浙江 舟山 316000)
作者简介:郭燕娜，通信作者，女，本科，中药师，研究方向:中药(中成药)
质量控制，E-mail:3357766703@ qq． com。
［摘要］ 目的 建立一测多评方法，测定垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素含量为控制垂盆草颗粒的质量提供依据。方
法 采用岛津 C18色谱柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm);流动性为甲醇-水(含 0. 4%磷酸溶液)= 50∶40;流速为 1. 0 mL /min;检测波长
360 nm;进样量:10 μL;以槲皮素为参考建立山奈素和异鼠李素间的相对校正因子，考察其重现性，比较计算值与测得值的差异。
结果 槲皮素、山奈素和异鼠李素分别在 32. 36 ～ 426. 43 μg、11. 56 ～ 136. 87 μg 、10. 45 ～ 155. 68 μg呈良好的线性关系，回归方程分别
为:Y = 3625. 8X-13658(Ｒ2 = 0. 9998)、Y = 2682. 9X-10253(Ｒ2 = 0. 9999)、Y = 3012. 2X-11223(Ｒ2 = 0. 9999)。平均加样回收率分别为
99. 3%、99. 6%、98. 5%(ＲSD均 ＜ 1. 0%)。用一测多评法对 10 批垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素与异鼠李素进行测定的结果与外标法
实测值基本一致。结论 该方法可靠，结果准确，可用于垂盆草颗粒的质量控制。
［关键词］ 一测多评;垂盆草颗粒;槲皮素;山奈素;异鼠李素
［中图分类号］ Ｒ969. 3 ［文献标识码］ A ［DOI］ 10. 3969 / j. issn. 1005-1678. 2016. 04. 63
Content determination of quercetin，kaempferide and isohamnetin in Chuipencao
granules by quantitative analysis of multi- components by single-marker
GUO Yan-naΔ，HU Hua-jie
(Department of Pharmacy，Zhoushan Hospital of Zhejiang，Zhoushan 316000，China)
［Abstract］ Objective To develop a method of quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS)for determination of quercetin，
kaempferide，isohamnetin in Chuipencao granules，providing method to control the quality of Chuipencao granules． Methods The analysis was performed
at 30 ℃，on an Shimadzu C18 column(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)，and the mobile phase was methanol -0. 4% phosphoric acid solution . The flow rate was
1. 0 mL /min，and the injection volume was 10 μL. Quercetin as a reference to establish the relative correction factor kaempferol and between
isorhmnetin， the method was evaluated for reproducibility， and the difference between calculated and measured values was compared．
Ｒesults Quercetin，kaempferol and isorhmnetin respectively 32. 36-426. 43 μg，11. 56-136. 87 μg，10. 45-155. 68 μg showed a good linear relationship，
and the regression equation was:Y = 3625. 8X-13658 (Ｒ2 = 0. 9998)，Y = 2682. 9X-10253(Ｒ2 = 0. 9999)，Y = 3012. 2X-11223 (Ｒ2 = 0. 9999). The
average recoveries were 99. 3%，99. 6%，98. 5% (ＲSD were less than 1. 0%). Determination of 10 batches of Chuipencao granules with QAMS and
external standard method，kaempferol and isorhamnetin were measured，and measured values were basically the same． Conclusion The QAMS method is
reliable and accurate，which might be used for the quality control of Chuipencao granules．
［Keywords］ quantitative analysis of multi-components by single marker(QAMS);Chuipencao granules;quercetin;kaempferide;isohamnetin
垂盆草颗粒是提取垂盆草新鲜全草制备而来的，它具有清
利湿热、降低谷丙转氨酶的作用，临床上用于急性肝炎、迁移性
肝炎及慢性肝炎活动期的治疗［1］。据文献报道［2-3］，垂盆草中含
有黄酮及其苷、三萜、甾醇、生物碱、氰苷、氨基酸、糖类等化合
物。而大部分黄酮醇苷结构已经通过其水解后的苷元，如槲皮
素、山柰酚、异鼠李素等得到证实。2015 年版《中国药典》一部
制定垂盆草颗粒中芦丁质控方法和限度，未对槲皮素、山奈素和
异鼠李素做质控要求，近年来，虽已有文献［1-4］对上述成分做了
研究，但是涉及到多种对照物质，检验成本高。2006 年，王智民
等［5］最早建立利用一测多评法来控制中成药多成分的考察模
式，实现以一种对照物质同时检测多种成分，方法简便实用，经
济合理，目前在中药领域得到了广泛应用。
本实验以槲皮素为参照物，建立其与山奈素和异鼠李素间
的相对校正因子，实现以一种对照物质对垂盆草颗粒中的多成
分进行质量控制，这为更真实评价垂盆草颗粒质量提供了全新
模式，以便控制药品质量。通过考察不同色谱仪器和色谱柱对
方法进行验证，并通过比较一测多评法与外标法检测结果的差
异来验证一测多评的准确性和可靠性。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 药品与试剂:垂盆草颗粒 10 批(上海静安制药有限
公司，规 格:5g /袋，批 号:20150503、20150617、20150715、
20150729、20150816、20150830、20150914、20150929、20151016、
—991—
中国生化药物杂志 2016 年第 4 期 总第 36 卷 生化药物技术
20151117);槲皮素对照品(批号:100081-20907，含量:97. 4%)、
异鼠李素对照品(批号:110860-201109，含量:99. 0%)、山奈素对
照品(批号:110861-201209，含量:93. 2%)均购自中国药品生物
制品检定研究院;甲醇为色谱纯，水为纯化水。
1. 1. 2 实验仪器:戴安 Ultimate 3000 系列高效液相色谱仪
(SＲD-3400A分析泵、WPS-3000 自动进样器、TCC-3000SD 柱温
箱、VDW-3000 检测器、工作站:Chromeleon Dionex)，色谱柱:岛
津 ODS (250 mm × 4. 6 mm，5 μm);AB-135S 型电子天平(梅特
勒-托利多国际股份有限公司，D =0. 01 mg)。
1. 2 方法
1. 2. 1 色谱条件:流动相:甲醇-水(含 0. 4%磷酸溶液)=
50∶40;检测波长:360 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。
1. 2. 2 对照品溶液的制备:分别精密称取槲皮素、山柰素
和异鼠李素对照品适量，置 200 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释
至刻度，摇匀，精密量取上述对照品混合溶液 5 mL置 50 mL量瓶
中，加甲醇制成每 1 mL含槲皮素、山柰素和异鼠李素 16. 2、5. 8、
5. 2 μg 的对照品混合溶液，摇匀，用 0. 22 μm 微孔滤膜滤过，
即得。
1. 2. 3 供试品溶液的制备:取混合均匀的垂盆草颗粒约
5 g，研细，精密称定，置 100 mL 烧瓶中，加 25 mL 的甲醇-20%盐
酸溶液(5∶1)混合溶液，加热回流 2 h，期间用甲醇-20%盐酸溶
液(5∶1)补足减失的重量，放冷，混匀后，用 0. 22 μm 微孔滤膜
滤过，即得。
1. 2. 4 阴性样品溶液的制备:按处方制备缺槲皮素、山柰
素和异鼠李素的阴性样品，按 1. 2. 3 项下方法制备阴性供试品
溶液。
1. 2. 5 方法学考察
① 线性关系的考察:精密吸取 1. 2. 2 项下的混合对照品溶
液 2、5、10、15、20、25 μL，分别按照 1. 2. 1 色谱条件进样，记录色
谱图，计算峰面积。
② 稳定性试验:取同一批供试品溶液，放置 0、2、4、6、8、10 h
后按照 1. 2. 1 色谱条件进样，记录色谱图，计算峰面积。
③ 精密度试验:取混合对照品溶液，按照 1. 2. 1 色谱条件连
续进样 6 针。记录色谱图，计算峰面积。
④ 加样回收率试验:取 6 份已知含量的垂盆草颗粒，分别加
入一定量的槲皮素、山奈素和异鼠李素对照品，按照 1. 2. 1 色谱
条件进样，计算峰面积、回收率。
⑤ 相对校正因子的计算:以槲皮素为内参物，按下式计算相
对校正因子:f = fs / fi = AsCi /AiCs
式中 As为内参物对照品峰面积，Ai 为待测成分峰面积，Cs
为内参物浓度，Ci待测成分浓度。
精密吸取“1. 2. 2”项下混合对照品溶液 2、5、10、15、20、
25 μL，分别进样测定。
1. 2. 6 相对校正因子的重现性考察
① 高效液相色谱仪及色谱柱考察:分别考察 Agilent
1260infinity、SHIMADZU LC-10tvp 和 Waters 2695-2489 高效液相
色谱仪，考察 Sunfire C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)、Thermo C18
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)和 SHIMADZU C18(4. 6 mm × 250 mm，
4. 5 μm)色谱柱对相对校正因子的影响。
② 色谱峰专属性考察:色谱峰准确定位是保证一测多评法
应用的前提，本实验中利用相对保留时间进行定位，采用槲皮素
与山奈素和异鼠李素的相对保留时间结合色谱图的整体特征，
结合不同高效液相色谱仪和色谱柱来定位目标成分。
1. 2. 7 样品测定 取 10 批不同批号的垂盆草颗粒，采用外
标法和一测多评法分别计算垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素和异
鼠李素的含量。
2 结果
2. 1 线性关系的考察 对照品、阴性样品和样品的 HPLC
色谱图(见图 2)，以进样量为横坐标(X)、峰面积积分值为纵坐
标(Y)进行线性回归，槲皮素、山奈素和异鼠李素的回归方程
(见图 1)分别为:
Y = 3625. 8X-13658，Ｒ2 = 0. 9998;Y = 2682. 9X-10253，Ｒ2 =
0. 9999;Y = 3012. 2X-11223，Ｒ2 = 0. 9999。
图 1 垂盆草颗粒标准曲线图
Fig. 1 Linear regression trend of Chuipencao granules
结果表明，槲皮素、山奈素和异鼠李素进样量分别在
32. 36 ～ 426. 43 μg、11. 56 ～ 136. 87 μg 、10. 45 ～ 155. 68 μg 范围
内与峰面积呈良好的线性关系。
图 2 阴性样品(A)、对照品(B)和样品(C)和 HPLC色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of negative sample(A)，
mixed standard (B)and sample(C)
—002—
生化药物技术 中国生化药物杂志 2016 年第 4 期 总第 36 卷
2. 2 稳定性试验 槲皮素、山奈素和异鼠李素峰面积的
ＲSD分别为 0. 4%、0. 3%和 0. 5%(n = 6)，表明供试品溶液在
10 h内稳定。
2. 3 精密度试验 槲皮素、山奈素和异鼠李素峰面积的
ＲSD分别为 0. 8%、0. 4%和 0. 9%(n = 6)，表明仪器的精密度
良好。
2. 4 加样回收率试验 槲皮素、山奈素和异鼠李素的回收
率，结果见表 1-3。
表 1 山奈素回收率测定结果(n = 6)
Tab. 1 Ｒesults of recovery test of kaempferide(n = 6)
编号
取样量
(g)
样品中含
量(mg)
加入量
(mg)
测出总量
(mg)
回收率
(%)
平均回收
率(%)
ＲSD
(%)
1 1. 112 5 0. 261 3 0. 263 5 0. 51 8 99. 05
2 1. 263 1 0. 283 5 0. 223 5 0. 498 5 98. 32
3 1. 056 4 0. 223 6 0. 235 4 0. 458 8 99. 96
4 1. 113 5 0. 243 6 0. 301 2 0. 542 1 99. 50
5 1. 142 1 0. 251 3 0. 253 1 0. 501 2 99. 37
6 1. 351 5 0. 310 3 0. 243 1 0. 552 1 99. 77
99. 3 0. 4
表 2 槲皮素回收率测定结果(n = 6)
Tab. 2 Ｒesults of recovery test of quercetin(n = 6)
编号
取样量
(g)
样品中含
量(mg)
加入量
(mg)
测出总量
(mg)
回收率
(%)
平均回收
率(%)
ＲSD
(%)
1 1. 112 5 0. 752 5 0. 752 4 1. 503 2 99. 89
2 1. 263 1 0. 768 5 0. 745 2 1. 510 2 99. 77
3 1. 056 4 0. 741 2 0. 768 4 1. 495 8 99. 09
4 1. 113 5 0. 758 8 0. 745 6 1. 503 1 99. 91
5 1. 142 1 0. 756 8 0. 768 2 1. 513 6 99. 25
6 1. 351 5 0. 772 3 0. 768 1 1. 538 9 99. 90
99. 6 0. 3
表 3 异鼠李素回收率测定结果(n = 6)
Tab. 3 Ｒesults of recovery test of isorhamnetin(n = 6)
编号
取样量
(g)
样品中含
量(mg)
加入量
(mg)
测出总量
(mg)
回收率
(%)
平均回收
率(%)
ＲSD
(%)
1 1. 112 5 0. 251 6 0. 261 6 0. 501 3 97. 68
2 1. 263 1 0. 285 4 0. 291 3 0. 561 4 97. 35
3 1. 056 4 0. 249 8 0. 316 4 0. 554 6 97. 95
4 1. 113 5 0. 259 8 0. 291 5 0. 546 9 99. 20
5 1. 142 1 0. 260 1 0. 315 6 0. 569 8 98. 98
6 1. 351 5 0. 302 6 0. 298 8 0. 598 8 99. 57
98. 5 0. 8
2. 5 相对校正因子的计算 山奈素和异鼠李素的校正因
子分别为 0. 721 和 1. 901，ＲSD 分别为 0. 3% 和 0. 2%，均小于
1. 0%，表明相对校正因子重现性很好。
2. 6 相对校正因子的重现性考察
2. 6. 1 高效液相色谱仪及色谱柱考察:色谱柱和色谱仪这
2个因素对相对校正因子的影响较小(ＲSD均小于要求的 5%)，
说明一测多评法可以运用在检测垂盆草颗粒中槲皮素、山奈素
和异鼠李素成分中，以槲皮素为内标参考物，利用相对校正因子
0. 720 和 1. 905 分别来计算样品中山奈素和异鼠李素的含量。
见表 4。
表 4 高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子的影响
Tab. 4 High performance liquid chromatograph and chromatographic column on
the influence of relative correction factor
高效液相色谱仪 色谱柱
相对校正因子
山奈素 异鼠李素
Agilent 1260infinity Sunfire C18 0. 723 1. 901
Thermo C18 0. 716 1. 901
SHIMADZU C18 0. 716 1. 892
SHIMADZU LC-10tvp Sunfire C18 0. 726 1. 908
Thermo C18 0. 724 1. 900
SHIMADZU C18 0. 722 1. 912
Waters 2695-2489 Sunfire C18 0. 715 1. 910
Thermo C18 0. 718 1. 903
SHIMADZU C18 0. 721 1. 921
平均值 0. 720 1. 905
ＲSD(%) 0. 520 0. 420
2. 6. 2 色谱峰专属性考察:使用通过考察的色谱条件，利
用不同色谱仪和色谱柱进行测定分析，山奈素和异鼠李素相对
保留时间的 ＲSD 分别为 0. 4%和 0. 6%，表明相对位置较为固
定，重现性较好，并通过相应出峰的光谱图来确定各成分的同一
性，可以认为本一测多评法能作为垂盆草颗粒标准制定的参考
依据。见表 5。
表 5 不同色谱仪及色谱柱对相对保留时间的影响
Tab. 5 Different chromatographic column chromatograph and the
influence of the relative retention time
高效液相色谱仪 色谱柱
相对保留时间
山奈素 异鼠李素
Agilent 1260infinity Sunfire C18 1. 716 1. 892
Thermo C18 1. 713 1. 901
SHIMADZU C18 1. 709 1. 911
SHIMADZU LC-10tvp Sunfire C18 1. 715 1. 912
Thermo C18 1. 713 1. 915
SHIMADZU C18 1. 707 1. 905
Waters 2695-2489 Sunfire C18 1. 721 1. 900
Thermo C18 1. 712 1. 916
SHIMADZU C18 1. 718 1. 914
平均值 1. 714 1. 907
ＲSD(%) 0. 240 0. 410
2. 7 样品测定 采用 2 种方法所得的 10 批垂盆草颗粒中
2种成分含量测定值的 ＲSD值均小于 1. 0%，可以认为 2 种方法
测得的结果基本一致;采用外标法实测含量与一测多评计算的
含夹角余弦值进行比较［3］，夹角余弦值分别为 0. 999 8 和 0. 999
9，表明 2 种方法测得的含量没有显著性差异，一测多评法可以
作为该品种的分析方法。见表 6。
—102—
中国生化药物杂志 2016 年第 4 期 总第 36 卷 生化药物技术
表 6 样品的测定结果
Tab. 6 The determination results of the samples
样品
槲皮素含
量(mg /g)
山奈素含量(mg /g)
外标法 一测多评法
异鼠李素含量(mg /g)
外标法 一测多评法
1 0. 806 3 0. 252 3 0. 252 1 0. 294 5 0. 301 3
2 0. 809 8 0. 241 5 0. 241 3 0. 281 5 0. 282 4
3 0. 812 5 0. 243 5 0. 243 6 0. 286 5 0. 284 3
4 0. 792 5 0. 264 6 0. 266 6 0. 302 1 0. 294 6
5 0. 752 4 0. 243 5 0. 243 5 0. 312 2 0. 315 2
6 0. 773 4 0. 246 5 0. 240 2 0. 295 4 0. 301 5
7 0. 762 5 0. 241 2 0. 243 2 0. 284 6 0. 284 0
8 0. 791 5 0. 268 4 0. 268 1 0. 264 1 0. 268 1
9 0. 752 5 0. 234 6 0. 230 1 0. 235 4 0. 236 0
10 0. 739 2 0. 230 0 0. 228 9 0. 261 2 0. 263 5
3 讨论
在实验过程中，通过反复实验比对，2015 版《中国药典》一
部中垂盆草药材［6］项下色谱条件和样品配制方法可以作为本实
验的参考。在样品提取方式的选择上，分别考察了超声和回流 3
种供试品提取方法，结果超声提取不完全，采用回流提取时，3 种
成分含量均有很大程度的提高，并且回流 2 h时各成分基本提取
完全。提取溶媒的选择方面，实验结合 3 种成分的溶解特性，分
别以水、甲醇、50 甲醇水、甲醇-20%盐酸溶液(5∶1)混合溶液对
样品进行提取，结果采用甲醇-20%盐酸溶液(5∶1)混合溶液时
提取最完全。
在流动相选择时，本实验分别采用乙腈-0. 2%磷酸溶液和甲
醇-0. 4%磷酸溶液系统进行比较，结果采用乙腈-0. 2%磷酸溶液
时，山奈素和异鼠李素分离达不到要求;采用甲醇-0. 4%磷酸溶
液系统则能实现各成分的基线分离，理论塔板数也较前者有所
提高，峰形较好，故以甲醇-0. 4%磷酸溶液作为流动相。
一测多评法(QAMS)可在待测成分对照品不易得到或不稳
定等情况下，使用一种对照物质、利用相对校正因子同时测定多
成分的含量，目前，QAMS法已在中药材及饮片质量评价中广泛
应用［7-12］。此种方法不仅大大地节省了检验成本，同时也极大地
简化了实验操作，有效提高了工作效率和实验准确性，方法有效
可行，可以为制定本药品标准提供参考。
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81-86.
(编校:王冬梅)
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本研究考察提取次数、提取时间和料液比三因素对绿原酸
提取率的影响，利用 Box-Behnken 效应面法进行实验设计，并按
照各试验点条件测出相应提取率，采用二元多次方程拟合因素
与响应值之间的函数关系，通过二元多次模型来推测最佳工艺
条件。BBD 效应面法不仅考察因素与响应值之间作用，还能考
察各因素间的相互作用，方法简便合理，试验次数较少，与正交
试验和均匀设计相比较，更加直观、合理，精密度和准确度也大
大地提高。采用模型推测最佳方法实验所得提取率和预测值接
近，进一步验证方法的准确性。
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(编校:谭玲)
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生化药物技术 中国生化药物杂志 2016 年第 4 期 总第 36 卷