全 文 ：银翘解毒口服液对流感病毒 H9 感染 8<:I小鼠 ;J
细胞活性及 :H;4

含量的影响
马荣! 许扬*! 毕明刚*!! 郭鹏*!
,河北北方学院! 河北 张家口 $%$*7%*,中国医学科学院 药用植物研究所! 北京 $$7)#
$摘要%!目的&研究银翘解毒口服液对流感病毒H9 感染的R$G细胞缺陷小鼠!8<:I;J细胞活性及 :H;4

含量的影
响) 方法&除正常对照组外$其余小鼠在感染流感病毒鼠肺适应株 H9 后$分为模型组&阳性药组&银翘解毒口服液!a^ I
g$$$g$$*$g$ D.ZD
e剂量组$按组别灌胃$分别于感染后第 $)$$% 天采用乳酸脱氢酶释放法检测脾脏;J细胞活性*双抗
体夹心3G<4U`:83法动态观察血清:H;4

含量的变化) 结果&银翘解毒口服液治疗后$小鼠脾脏;J细胞活性和血清中:H;4

含量均有所提高$并且体现出一定的量效关系$a^ I$g$$*$g$ D.ZDe剂量组对两者的调节作用强于 a^ Ig$ D.ZDe剂量
组) 从感染时相上看$;J细胞活性从第 ) 天开始升高$到第 天达最大值$第 % 天有所回落*而血清 :H;4

含量第 ) 天达峰
值$并持续至第 天$第 % 天有所下降) 结论&银翘解毒口服液能够提高流感病毒感染小鼠脾脏;J细胞活性和血清:H;4

含
量$并且对两者具有不同的时效影响)
$关键词%!银翘解毒口服液*甲型流感病毒*8<:I小鼠*;J细胞活性*干扰素4
7
$稿件编号%!*$$7$$$)
$基金项目%!国家科技部w十一五w支撑课题重点项目子课题
!*$$#G3:$(G$&4*
$通信作者%!!毕明刚$博士$副研究员$主要从事中药药理和免疫
药理的研究$RMS# !$$#*(7&(#%$U4/BNS# /D\N2N/ASBQ,B-,-1*!郭
鹏$博士$助理研究员$U4/BNS#ADT.2N/ASBQ,B-,-1
!!银翘解毒口服液是复方银翘散改变剂型后的制
剂) 银翘散是中医临床治疗流行性感冒最常用的方
剂之一) 现代药理学研究表明$银翘散具有显著的
解热镇痛&抗炎&抗病毒&抗菌&抗过敏以及提高免疫
力等作用+4), ) 新近研究表明银翘散中的黄酮类和
木脂素类化合物是其抗病毒的 * 类有效成分+&, ) 如
黄酮类化合物主要通过抑制流感病毒神经氨酸酶的
活性及膜融合间接发挥抗病毒作用+, ) 木脂素类
化合物如牛蒡苷$能直接灭活或抑制流感病毒+#, )
8<:I!OMdMCM-./\N1MQ N//T1.QMPN-NM1-5小鼠系近
交系<,G,4% 小鼠第 # 号染色体单个隐性基因突
变所致的免疫缺陷小鼠$小鼠 R淋巴细胞和 G淋巴
细胞同时缺陷$但巨噬细胞和 ;J细胞数量及功能
不受影响) 本课题组前期以 R细胞缺陷小鼠为模
型$研究了银翘散对 G细胞和 ;J细胞等免疫功能
的影响$本实验选取 8<:I小鼠作为动物模型$进一
步排除机体抗病毒感染过程中获得性免疫应答的因
素$研究其感染流感病毒后脾脏 ;J细胞活性和血
清中:H;4

含量$以反映银翘解毒口服液!a^ I在
抗流感病毒过程中对免疫系统的影响)
!材料
U!药物及病毒株!银翘解毒口服液!河北华威
制药有限公司$批号 $%$)$*病毒唑!天津药业集
团新郑股份有限公司$批号 $%$#$7) 3型流感病
毒鼠肺适应株H9!3=H9==&%493$中国预防医学
科学院病毒研究所$由中国中医科学院中药研究
所提供$鸡胚传代后$血凝滴度为 i#&$$ e%$ h冻
存备用) 小鼠:H;4

U`:83试剂盒!欣博盛生物技
术有限公司) <5@.R.67# ;.14CBQN.B-@NdM-5@.@.6N-N4
@5BOOB5试剂盒!EC./MDB$美国) Y*$$*$3红细胞
裂解液!华特生生物技术有限公司)
U!细胞株!a3<4 细胞) j4HG8 >E9:4#&$
培养基传代培养$于传代后 *& k&( ?使用)
U&!动物及分组!& 周龄 8<:I小鼠$雄性$共 %*
只$体重 # k7 D$购于北京维通利华实验动物有限
公司$许可证号 8中国中医科学院中药研究所生物安全实验室!3G4
8 4`*动物室) 按体重随机分组原则$将小鼠分为对
照组&模型组&阳性对照组!病毒唑 $g$% D.ZDe以
及 a^ I低!g$ D.ZDe &中!$g$ D.ZDe &高
!*$g$ D.ZD
e
剂量组) 每组 ) 只) 小鼠自由进食
进水$控制温度!** p* h$湿度! p* j )
.#&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
U_!仪器!KI84( 微孔板扫描酶标仪 !美国
GN.RMZ 公司* B`\.PTDM&$$>高速低温离心机!德
国YMCBMTO公司*IU94
2
型自动酶标洗板机!北京
拓普分析仪器有限责任公司)
!方法
U!模型制备及给药!各组小鼠乙醚轻度麻醉后$
对照组滴鼻生理盐水$其余各组滴鼻感染流感病毒
H9$每只 )$

)` 各组按感染病毒 $)$$% Q & 个
时相分别按体重于 ? 后灌胃给药$其中对照组和
模型组均给予等体积生理盐水)
U!取材!小鼠于感染 *&$%*$*$$#( ? 后$分别
摘眼球取血$分取血清$置e*$ h保存备用*无菌摘
取脾脏$制备脾脏单细胞悬液$j4HG8 >E9:4#&$
培养基调整细胞浓度)
U&!;J细胞活性检测!a3<4 细胞作为靶细胞$
用 j4HG8 >E9:4#&$ 培养基洗涤 次$ $$$ C.
/N1
e离心 /N1$用 >E9:4#&$ 完全培养基重悬细
胞) 小鼠脾脏细胞作为效应细胞) ;J细胞活性的
检测应用;.14CBQN.B-@NdM-5@.@.6N-N@5BOOB5试剂盒检
测) 操作按说明书进行) 使用酶标仪在 &7$ 1/波
长下读取各孔4$计算;J细胞活性)
U_!血清 :H;4

含量的检测!采用双抗体夹心
U`:83法) 按照试剂盒说明书进行操作) 使用酶标
仪在 &7$ 1/波长下读取各孔 4) 通过标准曲线计
算:H;4

的含量$方程 9f$g$$$ *( Jl$g$%( $
G
*
f$g77# ))
U$!数据处理!实验数据以
#
?p&表示) 组间显著
性检验采用 8E88)g$ 软件L1M4+B53;L[3进行统
计学分析$>o$g$ 为有统计学意义)
&!结果
&U!a^ I对流感病毒 H9 感染 8<:I小鼠脾脏
;J细胞活性的影响!病毒感染后第 天$各组 ;J
细胞活性无明显变化) 感染第 ) 天$模型组 ;J细
胞活性较对照组明显降低!>o$g$*各给药组与
模型组相比$;J细胞活性均显著升高!>o$g$$
a^ I) 个剂量组呈剂量依赖关系) 感染第 $% 天$
模型组的 ;J细胞活性继续降低!>o$g$*各给
药 组 与 模 型 组 比$ ;J 细 胞 活 性 显 著 提
高!>o$g$)
对照组;J细胞活性在感染后第 $)$$% 天等
& 个时间点无明显变化) 模型组从第 ) 天开始呈现
显著下降的趋势$第 天降至最低水平$且与感染第
)天相比$有极显著性差异!>o$g$) 阳性药组;J
细胞活性呈现明显的上升趋势$第 ) 天活性最强$第
$%天随时间延长有所降低$接近对照水平*第 $% 天
与前一时间点相比具有显著性差异!>o$g$)
a^ I各给药组;J细胞活性在第 )开始升高$第 天
达峰值$第 % 天开始降低$均接近正常组水平$且除
a^ Ig$ D.ZD
e剂量组外$其余各组与第 天相比$
均具有显著性差异!>o$g$) 见表 )
表 !a^ I对H9 感染 8<:I小鼠不同时间点;J细胞活性的影响!
#
?p&$)f) j
组别 剂量=D.ZDe Q ) Q Q % Q
对照 e ))g$7 p*g% )#g*7 pg## ))g( pg$) )g pg)&
模型 e )$g( p*g&
*%g$ p$g7
$)
#g7) pg$

#g)& p$g#

病毒唑 $g$% ))g#) pg&&
(g# p*g)7
*$&
#g( p*g(
*
&$g%( p*g*&
*$)
a^ I g$ )&g* p$g%*
&g&7 pg%
*$)
&%g7$ pg*%
*
)%g)( p$g#
*
$g$ )&g& p)g)
&#g#7 pg#
*$)
g* p*g#(
*
)%g) p$g)&
*$)
*$g$ )g&% p$g%* &%g& p&g%
$g7 p$g*)
*
))g*# p$g7
*$)
!!注#与对照组相比>o$g$* 与模型组相比*>o$g$* 同一组与前一时间点相比)>o$g$$& >o$g$)
&U!a^ I对血清 :H;4

的影响!病毒感染后第
天$模型组:H;4

含量显著高于对照组!>o$g$*
各给药组:H;4

含量显著低于模型组!>o$g$)
感染第 )$$% 天$模型组 :H;4

含量均高于对照组
!>o$g$*除 a^ Ig$ D.ZDe剂量组外$各给药
组:H;4

含量显著高于模型组!>o$g$$a^ I)
个剂量组呈剂量依赖关系)
对照组:H;4

含量在感染后第 $)$$% 天 & 个
时间点之间无明显变化) 模型组:H;4

含量在各时
间点均高于正常组$随时间推移$:H;4

含量依次降
低) 各给药组:H;4

含量变化大体相似$均在感染
第 ) 天达峰值$a^ Ig$ D.ZDe剂量组在第 $% 天
逐渐降低$其他各给药组的峰值持续到第 天$此后
有所降低) 其中$a^ I$g$$*$g$ D.ZDe剂量组在
各时间点与阳性药组的作用强度相似$a^ Ig$ D.
ZD
e剂量组的作用强度相对较弱) 见表 *)
.%&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
表 *!a^ I对H9 感染 8<:I小鼠不同时间点血清:H;4

含量的影响!
#
?p&$)f) 1D.`
e
组别 剂量=D.ZDe Q ) Q Q % Q
对照 e *g)) p$g%$ g$& pg g(( p$g$ g( p$g%$
模型 e
*$g#$ p$g77

*$g#* pg$

(g77 p$g&* &g*7 pg$(
病毒唑 $g$%
&g77 p$g(
)
*(g)7 p$g7%
)$&
*%g&7 pg(
*&g) pg$
)
a^ I g$
*g$$ p$g#%
)
*g#) pg* %g(# pg*$ g#7 p$g%*
$g$
&g% p$g%(
*
*%g# p$g)7
)$&
*(g$$ p$g($
)
**g($ p$g&(
)$&
*$g$
)g7 p$g#
)
*7g)$ pg*
)$&
*(g* p$g(#
)
*)g$% p$g%(
)$&
!!注#与对照组相比>o$g$* 与模型组相比*>o$g$$)>o$g$* 同一组与前一时间点相比&>o$g$)
_!讨论
机体的抗病毒免疫是一个复杂的效应机制)
8<:I小鼠其细胞免疫和体液免疫严重缺陷$天然地
排除了抗病毒免疫中细胞免疫和体液免疫效应机制
的影响$从而相对独立地反映非特异性免疫应答在
抗病毒过程中的效应机制)
;J细胞是非特异性免疫应答中主要的效应细
胞$在抗病毒过程中发挥着尤为重要的作用) 有文
献报道 8<:I小鼠 ;J细胞活性为普通小鼠的 &
倍+%, $以 8<:I小鼠作为模型研究;J细胞的功能活
性能够更清晰地反映其变化趋势) 本实验的结果显
示$实验中动物感染流感病毒后$;J细胞活性明显
降低$第 天达最低值) 药物干预后$各给药组 ;J
细胞活性均升高$阳性药组于第 ) 天 ;J细胞活性
达到最大值$a^ I各剂量组于第 天达最大值$体
现出中药作用相对缓慢的特点*a^ I能够提高小鼠
脾脏;J细胞的活性$但具体机制尚不清楚$有待进
一步研究)
活化的 ;J细胞可分泌大量的细胞因子$如
:H;4

$R;H4
&
$F94<8H等$通过细胞因子发挥间接
的杀伤靶细胞作用) :H;4

是抗病毒的主要细胞因
子$在非特异性免疫中$:H;4

能够活化 9L=9
8
和
;J细胞$直接或通过活化 :H;4
&
和 :H;4
!
基因$发
挥抗病毒作用) 本实验结果显示$小鼠感染流感病
毒后$:H;4

含量出现先增多后减少的趋势$验证了
流感病毒具有拮抗 :H;4

的作用+(, ) a^ I$g$$
*$g$ D.ZD
e剂量干预后$均可不同程度升高血清
:H;4

含量$且其作用强度在各时间点与阳性药组
基本持平$说明 a^ I对 :H;4

的分泌具有促进作
用$作用时间亦与病毒唑相似)
活化的;J细胞和分泌的 :H;4

之间具有协同
作用$从而形成了免疫放大效应机制) 进一步分析
a^ I对;J细胞活性和:H;4

血清含量影响在时效
上的差异$发现:H;4

含量在第 ) 天达峰值$持续至
第 天$而;J细胞活性从第 ) 天开始增加$在第
天达峰值$两者变化趋势虽大体相似$但在时效上存
在一定时间差) 由于 8<:I小鼠 R$G细胞缺陷$因
此其体内的 :H;4

主要由 ;J细胞分泌$因此可推
测 a^ I影响;J细胞分泌:H;4

的作用要早于 ;J
细胞的杀伤作用$:H;4

增加后又进一步增强了 ;J
杀伤活性) 同时$本课题前期研究证明小鼠肺脏流
感病毒载量于感染第 ) 天达到峰值+), $结合本实验
结果$说明机体免疫系统激活的时间基本与病毒进
入体内&复制增殖的时间同步$但免疫效应较病毒复
制的时间略有滞后$提示在病毒载量降低后的较短
时间内$机体仍有较强的免疫应答)
本实验通过检测 8<:I小鼠脾脏 ;J细胞活性
和血清中:H;4

含量的变化$探讨抗流感病毒过程
中非特异性免疫应答的机制) 通过上述讨论可以看
出$a^ I对小鼠脾脏 ;J细胞活性及血清 :H;4

含
量具有直接而显著的促进作用) 本课题前期研究表
明 a^ I能够降低小鼠肺脏病毒载量+), $故推测
a^ I可能通过增强机体免疫应答的强度进而发挥
抗流感病毒的作用)
$参考文献%
+,!刘亚娴$ 霍炳杰$ 张莉$ 等,银翘散在不同煎煮时间下对免疫
抑制小鼠的免疫调节作用+V,,中医杂志$ *$$($ &7 !*#
*,
+*,!孙丽平,银翘散主要药物活性成分调节流感病毒感染小鼠免
疫失衡的实验研究+I,,沈阳#辽宁中医药大学$*$$%,
+),!时宇静$ 赵晔$ 姜晶$ 等,银翘散对流感病毒感染小鼠模型肺
组织病毒载和:H;4

/>;3表达的影响+V,,中国药学杂志$
*$$($ &)!7# &%,
+&,!石钺$ 石任兵,银翘散抗流感病毒有效部位各组分变化及归
属分析+V,,药学学报$ *$$%$ &*!*# 7*,
+,!:1BYNC.0N$ :NQBYNQM.,` N1BCN1 /.1.B-M@B@MPC./:(.-%!06+.E6%N
-*1%A#-%6++V,,E?5@.-?M/NO@C5$7($ *$!# %#,
+#,!高阳$ 董雪$ 康廷国$ 等,牛蒡苷元体外抗流感病毒活性+V,,
.(&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$
中草药$ *$$*$ ))!(# %*&,
+%,!>.\MC@V` BTW.T$ JB@?CN1M38N/1.dN@-?$ FB\CNMSNM9HTS.A$ M@
BS,31 M6AB1QMQ A.ATSB@N.1 .P1B@TCBSZNSMC-MSON1 /N-M+N@? OM4
dMCM-./\N1MQ N//T1.QMPN-NM1-5!8<:I SB-Z CMBCB1DM4/M1@B1Q
M6ACMOON.1 .PR-MSCM-MA@.CDM1MO+V,,U6A 9MQ$ 7(#$ #&
!#%7%,
+(,!FB-Z 9]$ 3S\CM-?@>3$ ]CB1.R$ M@BS,:1PSTM1WB3dNCTO;8
@BCDM@O@?MT\NbTN@N1 SNDBOMR4>:9* @.MdBQMCM-.D1N@N.1 \5@?M
?.O@dNCBS>;3OM1O.C>:F4:+V,,&)7,
*J?RBI@J].AV.-@ F?B@N.JR-B.@A@E-//.VG.F@A3^ R?/P.-L./.BD -AFI?EG,
R@AR?ABE-B.@A@J2:3+

.A;02>,@GI?.AJ?RB?FLD .AJ/G?AY- P.EGI:<
93>.1D

$ K]aB1D
*
$ G:9N1DDB1D
*
!
$ F]LEM1D
*
!
!;K*P*%C#0!( 7)%8*0&%!2$ Z(.)1=%.O#6 $%$*7$ (%).* * @)&!%!6!*#AB*,%%).->-.)!3*8*-#$+*)!$
(%)*&*4.,*+2#AB*,%.-5%*)*&.), >*O%)1 7)%#) B*,%.-#-*1*$ I*%=%)1 $$7)$ (%).
+4LIBE-RB,!6L[?RB.P?# R.M6AS.CM@?MQ51B/N-MPM-@O.PaN1bNB.QM@.6NP-B@N.1 .CBSSNbTNQ !a^ I .1 ;J-MSS5ONON1 OASMM1
B1Q OMCT/-.1-M1@CB@N.1 .P:H;4

N1 8<:I/.TOMN1PM-@MQ \5N1PSTM1WB3dNCTOH9,DC.TAOCB1Q./S5,U6-MA@1.C/BS-.1@C.S$ .@?MC/N-M+MCMN1@CB1BOBS5N1O@NSMQ +N@? R<:I.PdNCTO,R?CMMQ.OBDMDC.TAO.Pa^ I
!g$$$g$$*$g$ D.ZD
e
+MCMCMOAM-@NdMS5PMQ +N@? a^ I,E.ON@NdM-.1@C.SDC.TA +BOBQ/N1NO@CB@MQ .CBS5+N@? $g$% D.ZD
e
.PCN\B4
dNCN1,;.C/BS-.1@C.SB1Q /.QMSDC.TA +MCMPMQ +N@? A?5ON.S.DN-BSOBSN1M,3P@MC$ )$ B1Q % QB5OnN1PM-@N.1$ OASMM1OB1Q OMCT/+MCM
-.SM-@MQ,R?M1 @?M;J-MSS5ONO+BOQM@M-@MQ \5 I`YCMSMBOMZN@B1Q @?M-.1-M1@CB@N.1 .P:H;4

+BOM6B/N1MQ \5U`:83BOOB5,
8?IG/B# <.1@M1@O.P:H;4

CMB-?MQ @.AMBZ dBSTM.1 @?M)@? QB5B1Q T1@NS@?M@? QB5,` B@MC$@?MSMdMS.P:H;4

CM@TC1MQ @.1.C/BSSMd4
MS,R?MdBCNB@N.1 @M1QM1-5.PB-@NdN@5.P;J-MSN1 OASMM1 +BOB--.CQN1D+N@? @?B@.P:H;4

,GT@N@CMBC-?MQ @?M/B6N/T/dBSTMT1@NS
@?M@? QB5,R?MB-@NdN@5.P;J-MSS5ONON1 @?CMMDC.TAO.Pa^ I+BO+MSB\.dM@?B@N1 /.QMSDC.TA,:1 BQQN@N.1$ @?MCBAMT@N-B-@N.1 .P
\.@? $g$ D.ZD
e
B1Q *$g$ D.ZD
e
.Pa^ I@CMB@/M1@DC.TAO+BO\M@MC@?B1 @?B@.Pg$ D.ZD
e
,0@AR/GI.@A# R?MQB@BO?.+MQ
@?B@OMCT/-.1-M1@CB@N.1 .P:H;4

B1Q ;J-MSS5ONO+MCMN/AC.dMQ \5a^ IB@QNPMCM1@@N/M$ +?N-? +BOQM/.1O@CB@MQ a^ I-.TSQ AMC4
P.C/+MSN1 N//T1MO5O@M/,
+ ?^D Z@EFI,!aN1bNB.QM@.6NP-B@N.1 .CBSSNbTNQ* N1PSTM1WB3dNCTOH9* 8<:I/.TOM* ;J-MSS5ONO* :H;4

F@.# (a_)`OR[R,,((
$责任编辑!张宁宁%
.7&.
第 ) 卷第 期
*$$ 年 # 月
!!!!!! ! ! ! ! ! !!!! ! ! ! !
[.Sg)$ :OOTM!
VT1M$ *$$