全 文 ： 论　著
漏芦对大鼠原代肝细胞细胞色素 P4501A1
酶活性及其mRNA表达的影响
　　贵阳医学院生物化学与分子生物学教研室(550004)　吴　宁　雷霆雯　许庆忠　吴承龙*
　　摘　要　目的　研究漏芦对细胞色素 P450A1 酶活性及其 mRNA 水平的影响 。方法 以大鼠
原代肝细胞为研究对象 ,实验组分别加入不同浓度(15. 6 , 31. 2 , 62. 4 mg /ml)药物处理 48 小时 , 用氨
基比林 N-脱甲基酶(aminopy rence N-deme thy lase , ADM)活性反映 CYP1A1 酶活性;采用逆转录聚合
酶链反应(RT-PCR)测定药物作用前后酶基因 mRNA 表达的相对水平变化。结果 漏芦作用后 ,
C YP1A1酶活性及相应 mRNA 的表达呈浓度依赖性抑制。 药物在 15. 6 , 31. 2 , 62. 4 mg /ml 对
C YP1A1酶活性的抑制率分别为18. 1%, 46. 9%, 55. 1%;对 CYP1A1m RNA 表达水平的抑制率分别
为 14. 8%, 18. 1%, 31. 0%。结论 漏芦浓度依赖性抑制 CYP1A1 酶活性 ,在转录水平下调大鼠肝细
胞 CYP1A1 的表达。
　　关键词　CYP1A1 酶活性　　RT-PCR　　漏芦
The ef fects of Rhaponticum uniflorum(L.)DC. on the activities of cytochrome P4501A1 and mRNA
expression in primary hepatocytes in rat Wu N ing , Lei Tingwen , Yu Qingzhong , et al. Biochemistry
Molecular B iology Teaching and Research section , Guiyang Medical College , Guiyang 550004
Abstract　Objective　To study effects o f Rhaponticum uniflorum (L.)DC. on the activities of cy-
to chrome P4501A1 and m RNA expre ssion. Methods Rat hepatocy tes sandwich culture s we re treated
Rhaponticum uniflo rum(L.)DC. In diffe rent concentrations(15. 6 , 31. 2 , 62. 4 mg /ml) fo r 48 hour.
The enzymes activities o f CYP1A1 w as reflected the activities of liver microsomal aminopy rece N-dem-
ethy lase(ADM). The level changes in the mRNA expression after medica tion w ere tested by RT-
PCR. Results Af te r treatment with the medicine , ther e w as concentration-dependent inhibition in bo th
enzymes activity and mRNA level o f CYP1A1 compared w ith the cont rol. The rates o f the inhibito ry
effect to CYP1A1 activcity w ere 18. 1%、46. 9%、55. 1% re spectively , and to mRNA level w ere
14. 8%、 18. 1%、 31. 0%. Conclusion Rhaponticum uniflo rum(L .)DC inhibits the enzymes activity of
C YP1A1 and dow n-regulates CYP1A1 expre ssion a t the t ranscriptive levels.
Key words　CYP1A1　Enzymes activity　　Rhaponticum unif lo rum (L .)DC
　　注:本课题系贵州省科技基金项目(E2001-4)
*本院微生物教研室
　　中图分类号:R318. 04　　文献标识码:A　　文章编号:1000-744X(2007)06-0438-04
　　细胞色素氧化酶 P450(cy tochrome P450 , CYP
450)是一类结构和功能相关的超家族基因编码的同
工酶 ,其主要位于肝微粒体中 ,参与许多内外源性化
合物在体内的 I 相生物转化 ,在毒理学和药理学研
究中有重要意义[ 1] 。体内外研究表明多种 CYP450
酶活性可因某些药物 、环境因子 、食物成分的影响发
生改变。CYP450酶活性可以增加 ,即发生酶诱导 ,
也可以降低 ,即发生酶抑制[ 2] 。祁州漏芦为菊科植
物[ Rhaponticum unif lorum(L. )DC. ]的根 ,其主要
成分为挥发油 ,具有清热解毒 、消肿排脓等功效。在
临床上漏芦是一味常用中药 ,常配对其它药物防治
肿瘤 ,目前漏芦对肝脏药物代谢酶细胞色素 P450
有无影响尚未见报道。本文研究漏芦对细胞色素
P450酶系中的 CYP1A1 活性的改变 ,并通过 RT-
PCR了解酶活性改变的机理 ,为探讨其在肿瘤防治
中的作用提供实验依据 。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　实验动物　Wistar 大鼠(贵阳医学院实验
动物管理中心),雌雄不限 , 180 ～ 200 g 。
1. 1. 2　药品与试剂　祁州漏芦(购于贵阳中医学
院 ,经贵阳医学院药学院鉴定为真品);标准胎牛血
清 , DMEM 培养基(美国 Gibco 公司);percol l ,
Trypsin 1∶250(华美生物工程公司);鼠尾胶 、 Ⅰ 、
Ⅱ型胶原酶 ,氨基比林 , Trizo l试剂 , olig o(dT)16 ,焦
炭酸二乙脂(DEPC), RNA 酶抑制剂 ,M-MLV 逆转
录酶 ,PCR扩增试剂(上海生工生物工程技术服务
有限公司);烟胺腺嘌呤磷酸二核酸(NADP)(美国
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AMRESCO 公司), 6-磷酸葡萄糖二钠(美国 Sigma
公司),6-磷酸葡萄糖脱氢酶(美国 Wor thing ton 公
司);RT-PCR引物(上海生工生物工程技术服务有
限公司合成)CYP1A1 引物:上游:5′-CTGGT TCT-
GGATACCCAGCTG-3′, 下游:5′-CCTAGGGTTG-
GTTACCAGG-3′,PCR产物片段长度 331bp;内对照
(β-actin)引物:上游:5′-GCCCAGAGCAAGACAGG-
TAT-3′, 下游:5′-GGCCATCTCCTGCTCGAAGT-3′,
PCR产物片段长度 513 bp;其它化学试剂均为分析
纯。
1. 1. 3　药物制备　取 100 g 粉状的漏芦加入 800
ml双蒸水煎煮 40 min ,过滤 ,滤渣再加入 500 ml双
蒸水继续煎煮 40 min ,过滤 ,合并 2次滤液 ,浓缩至
100 ml ,3 000 r /min离心 15 min ,取上清液(相当于
1 g 生药 /ml),用微孔滤器过滤除菌 ,分装后 4 ℃冰
箱保存备用。
1. 2　方法
1. 2. 1　肝细胞分离和培养　参考两步胶原酶循环
灌注法[ 3] ,采用“胶原蛋白凝胶三明治” [ 4]培养。
1. 2. 2　实验分组　分为低 、中 、高药物浓度组(按生
药总量计算),药物分别按 1∶64 、1∶32 、1∶16倍稀
释(用含 3%胎牛血清的 DMEM 稀释),使其终浓度
分别为 15. 6 , 31. 2 , 62. 4 mg /ml ,每组设 6 个复孔;
另设对照组 1个 ,加入含 3%胎牛血清的 DMEM 培
养液 。
1. 2. 3　药物作用　将新鲜分离出的肝细胞以 2×
105 个细胞 /cm2 接种于 6孔培养板上 ,细胞培养 24
h后 ,实验组分别加入不同浓度的漏芦 ,对照组加入
等容积含 3%胎牛血清的 DMEM 培养液于细胞孵
育体系中继续培养 48 h ,收集肝细胞进行酶学分析
和 RT-PCR。
1. 2. 4　CYP1A1活性测定　超声细胞粉碎仪破碎
细胞制备匀浆 ,钙沉淀法制备微粒体[ 5] 。通过测定
氨基比林 N-脱甲基酶(ADM)活性反映 CYP1A1酶
活性的大小[ 6] 。
1. 2. 5　大鼠肝细胞总 RNA 提取及鉴定　按上海
生工公司 T rizol试剂说明书提供的方法提取肝脏
总 RNA ,紫外分光光度法测定 RNA 纯度 ,电泳鉴
定总 RNA的完整性。
1. 2. 6　逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)　按 M-
MLVReverseTranscriptase说明书(上海生工生物
工程技术服务有限公司)逆转录合成第一链互补脱
氧核糖核酸(cDNA),然后通过特异性引物 PCR扩
增大鼠肝细胞中的CYP1A1和内对照 β-act in基因 。
PCR扩增反应参照文献[ 7] , 稍加改动 。总体系
25μl ,预变性 94 ℃5 min ,变性 94 ℃30 s ,退火56 ℃
1 min ,延伸 72 ℃1 min ,终末延伸 72 ℃7 min ,30个
循环。PCR产物经 2%琼脂糖凝胶分离并与 DNA
M arker(标准分子量)比较鉴定 ,在凝胶成像分析系
统照相观察结果并记录 。计算 CYP1A1 基因与 β-
actin基因扩增条带表达量像素灰度的比值 ,并以此
比值作为 P450 酶基因 mRNA 表达的相对水平指
标 。
1. 3　统计学分析　采用SPSS 10. 0统计软件 ,实验
数据用 x±s表示。用方差分析进行多组数据间的
比较 ,用最小显著差法(LSD)进行不同药物浓度组
与对照组间比较。
2　结　果
2. 1　漏芦对大鼠肝细胞 CYP1A 1酶活性的影响　
与对照组相比 , 低浓度组 、中浓度组 、高浓度组
CYP1A1酶活性差异有统计学意义(P <0. 05),均
明显受到抑制 ,且呈浓度依赖性抑制 ,抑制率分别为
18. 1%、46. 9%、64. 7%。结果见表 1。
表 1　漏芦对大鼠肝细胞微粒体 CYP1A1 酶活性影响
( x±s , n=8)
组别 药物浓度(mg /ml) CYP1A1nm ol /(min mg)
对照组 0 0. 411 2±0. 076 6
低浓度组 15. 6 0. 336 8±0. 053 1*
中浓度组 31. 2 0. 218 3±0. 035 4*
高浓度组 62. 4 0. 184 5±0. 036 7*
　　与对照组比较 , *P<0. 05
2. 2　总 RNA 电泳鉴定完整性　检查 RNA 的完整
性一般采用电泳的方法 ,真核生物完整的总 RNA
其 28sRNA的量是 18sRNA 的 1. 5 ～ 2倍 ,5sRNA
很少或没有 。本实验提取的 RNA 样品经电泳鉴定
其完整性好 。结果见图 1。
图 1　大鼠肝细胞总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图
1 , 2 , 3 , 4分别表示对照组 ,低浓度组 ,中浓度组 ,高浓度组
2. 3　CYP1A1基因的 RT-PCR结果
2. 3. 1　不同浓度药物组 RT-PCR电泳图　见图 2。
484 Guizhou Medical Journal , 2007 , Vol. 31 , No . 6
图 2　大鼠肝细胞 CYP1A1RT-PCR电泳图
2. 3. 2　漏芦对大鼠肝细胞 CYP1A1mRNA 表达的
影响　各实验组肝细胞 CYP1A1mRNA 表达水平
和对照组比较 ,差异有统计学意义(P <0. 05),均明
显受到抑制 ,且呈浓度依赖性抑制 ,药物在低 ,中 ,高
浓度组对 CYP1A1mRNA 表达水平抑制率分别为
14. 8%、18. 1%、31. 0%。结果见表 2 。
表 2　漏芦对大鼠肝细胞微粒体 CYP1A1mRNA表达的影响
( x±s , n=8)
组别 药物浓度(m g /ml) CYP1A1 /β-act in
对照组 0 0. 940 7±0. 058 0
低浓度组 15. 6 0. 801 3±0. 017 9*
中浓度组 3. 12 0. 770 7±0. 018 3*
高浓度组 62. 4 0. 649 1±0. 011 8*
　　注:*与对照组比较 P<0. 05
3　讨　论
利用原代肝细胞培养建立体外培养或孵育系统
基本保留了肝脏原有的代谢功能和细胞分化状态 ,
特别是保留有药物代谢酶(细胞色素 P450)的活性 ,
适合所有由 P450代谢的化学物质的代谢研究。但
肝细胞细胞色素 P450 对体外培养条件很敏感 ,一
般条件下活性很快丧失 。“胶原蛋白凝胶三明治”培
养体系能很好维持细胞色素 P450 的活性 ,是评价
细胞色素 P450 酶诱导剂与抑制剂的理想体外模
型 。
CYP1A 与肿瘤的关系十分密切 ,许多化学致癌
物需经 CYP1A 代谢活化后才能发挥其致癌作用 ,
目前许多学者认为 CYP1A 水平是化学致癌作用的
有效指征[ 8] 。CYP1A1主要代谢多环芳香烃等多种
致癌剂的氧化 ,大量研究表明烟草及环境中的多环
芳烃是肺癌发生的主要危险因素 。多环芳烃类化学
致癌物多为无活性的间接致癌物 ,经过 CYP1A1催
化氧化成具有强致癌活性的亲电子环氧化物 ,诱发
癌变。因此 CYP1A1 酶的诱导活性成为决定多环
芳烃致癌的关键[ 9] 。本实验结果表明:低 、中 、高药
485 贵州医药 2007 年 6 月第 31卷第 6期
物浓度组 CYP1A1酶活性及相应 mRNA 的表达水
平和对照组比较 ,差异均有显著的统计学意义 ,且呈
浓度依赖性抑制 。结果提示:漏芦抑制 CYP1A 1酶
活性的机理可能是通过抑制 CYP1A1基因 mRNA
表达水平 ,减少酶蛋白合成 ,从而降低酶活性 。漏芦
通过抑制 CYP1A1酶活性 ,减少了多环芳烃等多种
致癌物的氧化 ,提示其在化学性预防肿瘤方面有一
定的作用 。
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短篇报道
多发性脑结核瘤并肾损害一例报告
　　贵阳医学院第二附属医院(凯里 556000)　　陈茂仁　
　　中图分类号:R529. 4　　文献标识码:B　　文章编号:1000-744X(2007)06-0486-01
　　患者男性 , 44岁。 1 年前无明显诱因出现头昏 、头痛 、语
言不清 、尿频 、上肢微颤 , 不能站立 , 间断呕吐 , 抽搐 , 口吐白
沫 ,门诊头颅 C T 检查 ,发现颅内有 3. 8 cm 及 3. 4 cm 两个圆
形占位性病灶 ,以“颅内多发性转移瘤”收住院。 患者 4 年前
因咳嗽 ,咯血及胸痛在贵州省结核病医院就诊 , 诊断急性粟
粒性结核 ,抗结核治疗 1 个月好转出院。 3 年前因“双膝关节
滑膜炎”用青 、链霉素及强的松治疗 1 个月而愈。 2 年前因亚
急性血行播散型肺结核 , 结核性脑膜炎抗结核治疗 2 个月 ,
症状消失出院 。入院体检:生命体征正常 , 神志恍惚 , 嗜睡
状 ,体形肥胖。双侧瞳孔等大等圆 , 直径约 3 mm , 对光反射
存在 ,右侧鼻唇沟变浅 , 颈项强直 2 指 , 心肺正常 , 右上肢肌
力 2 级 , 下肢 3 级 , 肌张力减退 , 右侧布氏征及克氏征均阳
性。眼底检查:双眼视乳头水肿 , 脑电图异常 , 血 、大便常规 、
肝功能 、电解质 、X线胸片和颈椎片及 B 超肝胆脾胰心均正
常 ,双肾大小形态正常 ,双肾盂结构紊乱。尿常规 RBC 3 ～
5 /HP ,WBC 2 ～ 3 /HP , 血沉 20 mm /1h , 肾功能 BUN 8. 6
mol /L , Crl 16 μmol /L ,脑脊液潘氏试验阳性 ,细胞总数 0. 6
×106 /L ,蛋白 1. 44 g /L , 糖 2. 52 mmol / L , 氯化物 123. 5
mmol /L 。经抗结核 、抗癫痫 、降颅内压等治疗病情好转。 10
个月后 CT 检查 , 见颅内原占位病灶缩小为 2. 4 cm 及 2. 0
cm。最后确认:(1)多发性脑结核瘤;(2)继发性癫痫;(3)双
肾结核。住院治疗 15 个月症状消失 , 随访 2 年未见复发。
　　脑结核瘤因其临床表现及检查无特征性 , 早期诊断困
难 ,误诊率较高 , 自应用 CT 检查以来 , 脑结核瘤的诊断有了
进展 ,与脑血管造影 、脑同位素扫描等方法比较 , CT 检出脑
结核瘤最敏感。脑结核瘤强化扫描时大致可呈 3 种类型:盘
状 、环状或不规则团块状。盘状者为密度均匀的圆形 、椭圆
形影像;环状者为一环形高密度影像 ,形似戒指 , 少数情况下
环呈串珠样 , 是脑结核瘤区别于其它疾病的一个特征性改
变。不规则团块状者是由数个结核瘤融合而成 , 有时能分辨
出构成这种团块的盘状或环状影像。平扫病灶常显示不清 ,
易误诊为其它颅内占位性病变 , 本例 CT 误诊可能因未强化
扫描所致。临床上本病分为单纯性脑结核瘤和结核性脑膜
炎合并脑结核瘤两型。
本病诊断主要根据病史 , 临床表现及血沉 、结核菌素试
验 、脑脊液检查 , 胸部 X 线照片及颅脑 CT 扫描等检查综合
判断。但因结核性脑膜炎病理改变多样化 ,因此不能完全根
据临床表现判断有无合并脑结核瘤 , 故对结核性脑膜炎有偏
瘫 、单瘫 、癫痫或其它不能用结核性病膜炎解释的症状 ,应用
CT 检查。脑结核瘤应与脑脓肿 、神经胶质瘤等颅内病变鉴
别。
本病治疗首先应正规抗结核治疗 , 常能使绝大多数脑结
核瘤在 1～ 4 个月内缩小 , 3～ 12 个月内消失。单纯性脑结核
瘤并用糖皮质激素可迅速减轻结核瘤周围水肿 、降低颅内
压 、改善症状 , 对内科治疗无效或病情恶化及癫痫不能控制
者应手术治疗。
486 Guizhou Medical Journal , 2007 , Vol. 31 , No . 6