全 文 ：收稿日期:2006-06-11
基金项目:国家自然科学基金项目(39960008;30360007);兵团科技攻关项目(NKB025DXNK01SW)
作者简介:祝建波(1967-),男 ,山东烟台人 ,副教授 ,硕士 ,主要从事基因工程方面研究;周鹏为通讯作者。
小果雪兔子的组织培养
祝建波1 , 2 ,王　重3 ,周　鹏1
(1.中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室 ,海南 海口　 571101;
2.石河子大学兵团绿洲生态农业重点实验室 ,新疆石河子　 832003;
3.石河子大学 生命科学学院 ,新疆 石河子　832003)
　　摘要:小果雪兔子分布于新疆帕米尔高原 , 是一种濒临灭绝植物。利用组织培养的方法研究和保存珍稀的种质
资源 ,是一种有效途径。以小果雪兔子无菌苗下胚轴为外植体 ,在含有 6_BA(0.2 mg/L)和NAA(2 mg/ L)的 MS 固体培
养基上 , 20 d 后可诱导出紫红色愈伤组织。当经 4℃处理的愈伤组织转移到含 6_BA(2 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)+水解
乳蛋白(250 mg/L)的MS 培养基上 , 25 d后在愈伤组织上即可诱导出芽 , 出芽率为 240%, 继代培养后形成丛生苗 ,增殖
率可达3 ～ 5 倍。将2 ～ 3 cm长的幼苗 , 转移到 IAA(0.5 mg/L)+活性炭(0.5%)的 1/2MS固体培养基上 , 20 d即可从茎
基部生根 ,生根率 74%。
关键词:小果雪兔子;组织培养
中图分类号:S949.783.5　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2006)06-0059-04
Tissue Culture of the Alpine Plant Saussurea simpsoniana
ZHU Jian_bo1 , 2 ,WANG Zhong3 , ZHOU Peng1
(1.National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops ,Haikou　571101 ,China;
2.Key Laboratory of Oasis Ecology Agriculture of Xinjiang Bingtuan , Shihezi　832003 ,China;
3.Biology College of Shihezi University ,Shihezi　832003 , China)
Abstract:Saussurea simpsoniana was a kind of plant which was close to die out.It is an effective approach that re-
searched and preserved the sources of species by tissue culture.In this experiment , Saussurea simpsoniana callus was in-
duced from the hypocotyls of sterile seedling , which collected from the Pamirs in XinJiang and was cultured on solid MS
medium contained 0.2 mg/L 6_BA and 2 mg/L NAA for 20 days.Only pink Callus had differentiation capability.Ad-
ventitious buds were induced from pink Callus ,which were disposed in 4℃, on solidMS medium contained 6_BA 2mg/L
and NAA 0.2 mg/L and 250mg/L Lactalbumin Hydrolysate for 25 days , the buding rate was 240%.Cluster shoots were
set up through subculturing.The propagation times were up to 3-5.When the shoot developed 2-3 cm Length , they
were cultured onMS medium supplemented with 0.5 mg/L IAA and 0.5% active carbon for 20 days.Roots were formed
from cauline base , then the rate of rooting was up to 74%.
Key words:Saussurea simpsoniana;Tissue culture
　　小果雪兔子(Saussurea simpsoniana)属菊科(Com-
positae)凤毛菊属(Saussurea DC)雪兔子亚属(subgen.
Eriocoryne)植物 ,是通称雪莲的一种 ,为我国名贵中草
药。雪莲是一种极其珍贵的抗逆资源 ,蕴含有丰富的
抗寒基因 ,研究其抗寒机理 ,克隆其抗寒基因 ,对于植
物抗寒育种具有重要意义[ 1] 。小果雪兔子生于高海
拔4 900～ 5 000m高山荒漠石坡 ,生境特异 ,人工栽培
困难 ,加上长期以来对雪莲资源的掠夺开发 ,已使这
一珍贵资源濒临灭绝 。目前 ,国内外利用组织培养技
术保存和快速繁殖珍稀动植物已成为种质研究的重
要途径[2～ 5] ,但在新疆境内仅发现在帕米尔高原中巴
边界禁区有少量分布的小果雪兔子还未见报道 ,因此
本试验旨在研究解决这一珍稀植物资源的保存和快
速繁殖进行了初步的探讨。
我国雪莲植物有 40多种及 3个变种 ,因为其良
好的药用价值 ,一直是人们研究的重点[ 6] 。到目前
华北农学报·2006 , 21(6):59-62
为止 ,已有关于新疆雪莲(Saussurea inuoluorat)[ 7 ～ 9] 、
水母雪莲(Saussurea medusa)[ 10 , 11] 、苞叶雪莲(Saus-
surea obvallata)[ 12] 、绵头雪莲(Saussurea laniceps)[ 13] 、
雪兔子(Saussure gossypihora)[ 14]组织培养研究的相
关报道 ,而本试验对在新疆境内的帕米尔高原首次
发现的一种小果雪兔子进行了再生体系建立的初步
探索 。
1　材料和方法
1.1　材料来源
采自帕米尔高原塔什库尔县红其拉甫海拔
4 900 m的小果雪兔子种子由石河子大学生命工程
学院阎平教授提供。
1.2　试验方法
1.2.1　材料处理　将采集的小果雪兔子种子先经
过低温处理(放在冰箱中-20℃,48 h),然后取出经
70%酒精消毒 10 s ～ 1 min , 0.1%升汞消毒 5 ～ 15
min ,无菌水洗 4 ～ 5次 ,每次 2 ～ 3 min 。
1.2.2　无菌苗的获得　将高压消毒的滤纸片放入
1/2MS附加 6_BA 0.5 mg/L ,琼脂5.5 g/L ,pH 5.8的
无蔗糖的培养基中 ,然后将消毒的种子接种于无蔗
糖培养基上 ,放至培养箱中培养 ,温度控制在 15 ～
20℃,7 d后萌发出无菌幼苗 。
1.2.3　诱导愈伤组织　将培育出的无菌苗胚轴和
子叶切成数段 ,接种于基本培养基 MS 附加不同浓
度6_BA 与 NAA 激素 , 6_BA 0.2 mg/L 和 NAA 0.5 ,
1.0 ,1.5 ,2.0mg/L 组成的4种培养基 。蔗糖30 g/L ,
琼脂5.5 g/L ,pH 5.8的培养基上诱导愈伤组织。培
养条件:温度为 18 ～ 20℃,光照时间每日 14 ～ 16 h ,
光照强度 1 500 ～ 2 000 lx 。由于小果雪兔子采种困
难 ,用于试验的小果雪兔子子叶和下胚轴不足 ,所以
接种样本量较小 。
1.2.4　愈伤组织芽的分化　以 20℃培养为对照 ,
将培育出的愈伤组织经低温 4℃处理培养 7 d后 ,选
用MS 基本培养基+蔗糖 30 g/L、琼脂 5.5 g/L 、
pH 5.8 、水解乳蛋白 250 mg/L ,并以不同浓度的6_BA
与NAA搭配 ,6_BA 0 ,0.5 ,1.0 ,1.5 ,2.0 ,4.0 mg/L 与
NAA 0 ,0.2 mg/L 组成 11 种组合 ,以选出最适宜的
培养基。培养条件:50 mL 三角瓶内含 20 mL 固体
培养基 ,每瓶接种愈伤组织鲜重(0.25±0.2)g ,温
度为 18 ～ 20℃,放置光照培养箱中 ,光照时间每日
14 ～ 16 h ,光照强度 1 500 ～ 2 000 lx ,每隔 20 d 继代
一次 。
1.2.5　再生芽继代培养和生根培养　将再生的丛
生芽从愈伤组织上取下 ,然后接种于 MS , 3/4MS 和
1/2MS 基本培养基中 ,附加水解乳蛋白 250 mg/L+
6_BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L ,pH 为 5.8 ,琼脂 5.5
g/L ,蔗糖 30 g/L。接种后于光照培养箱中培养 ,培
养箱温度(昼/夜)控制在 20/18℃。调查丛生苗的
增殖率和生长状态;将高度 2 ～ 3 cm 的无根苗经
4℃培养 5 d ,转移至1/2MS+IAA(0.5 ,1 ,1.5 mg/L)
+0.5%活性炭的生根培养基上 ,调查生根率。
2　结果与分析
2.1　小果雪兔子种子无菌苗的建立
小果雪兔子种子在 1/2MS附加6_BA 0.5mg/L ,
无蔗糖培养基上萌发 ,酒精消毒20 ～ 30 s ,升汞消毒
时间为 7 ～ 8 min为宜 。在接种时 ,将高压灭菌过的
滤纸(1 cm×1 cm)放在此培养基上 ,再将经过消毒
的小果雪兔子种子接种于滤纸上 ,经过 7 d 后种子
萌发 。由于种子成熟度不好 ,接种 45 粒种子 ,萌发
17粒 ,萌发率 37.8%。
2.2　不同浓度的 6_BA , NAA对小果雪兔子愈伤组
织诱导率的影响
将子叶展开的无菌幼苗的子叶和下胚轴 , 按
0.5 cm大小切块或切段 ,接种于不同浓度的 6_BA ,
NAA的培养基中(表 1),继代培养 20 d观察。结果
表明:在设计的激素范围内 ,无菌幼苗的子叶和下胚
轴在MS 附加 6_BA 0.2 , NAA 2.0 mg/L , 诱导率最
高。子叶的的诱导率为 56%,下胚轴的诱导率为
100%。其他激素组合的培养基中 ,愈伤组织的诱导
率相对较低。
2.3　不同浓度的 6_BA与 NAA搭配对愈伤组织生
长的影响
将诱导的愈伤组织 ,选用MS 基本培养基 ,附加
不同浓度 6_BA和 NAA ,配成 5种组合(表 2),每组
接种 5瓶 ,每瓶(50 mL 三角瓶内含 20 mL 固体培养
基)接种愈伤组织鲜质量(0.25±0.2)g 。继代培养
20 d 。实验表明:6_BA 在 0.2 mg/L 水平 ,在 0.2 ～
2.0 mg/L范围内 ,随着 NAA水平的提高 ,愈伤组织
生长逐步增加。其中在 MS + 6_BA 0.2 mg/L +
NAA 2.0 mg/L 的培养基上生长速度较快 ,质量增加
较多 。当在NAA 2.5 mg/L水平时 ,愈伤组织开始出
现褐化现象。在 NAA在 0.2 mg/L 水平时 ,随着 6_
BA浓度的增加 ,愈伤组织生长减缓 ,并开始有芽的
分化 。
60　 华　北　农　学　报 21卷
表 1　不同浓度的 6_BA , NAA对雪莲愈伤组织诱导率的影响(20 d)
Tab.1　The effects of various medium on inducing rate of Saussurea inuoluorat callus
培养基(mg/L)
Medium
接种外植体数
Explant number
诱导愈伤数
Callus number
愈伤组织诱导率(%)
Inducing ratio
子叶
Cotyledon
下胚轴
Hypocotyl
子叶
Cotyledon
下胚轴
Hypocoty l
子叶
Cotyledon
下胚轴
Hypocotyl
MS+ 6_BA 0.2 +NAA 0.5 12 15 6 8 50 53
MS+ 6_BA 0.2 +NAA 1.0 10 12 4 9 40 75
MS+ 6_BA 0.2 +NAA 1.5 10 12 5 10 50 83
MS+ 6_BA 0.2 +NAA 2.0 9 10 5 10 56 100
MS+ 6_BA 0.2 +NAA 4.0 9 8 4 6 44 75
表 2　不同浓度的 6_BA , NAA 浓度对
愈伤组织生长的影响
Tab.2　The effects of　different 6_BA and NAA
concentration on growth of Saussurea inuoluorat callus
细胞分裂素
6_BA(mg/L) 生长素NAA(mg/L) 愈伤组织鲜质量(g)Weight of callus
0 0.2 少数愈伤死亡
0.2 0.5 3.42
0.2 1.0 3.68
0.2 1.5 3.66
0.2 2.0 3.76
0.2 2.5 少数愈伤组织发褐
0.5 0.2 愈伤组织生长缓慢并呈颗粒
1.0 0.2 少数芽产生 , 畸形
2.0 0.2 较多芽产生 , 畸形
2.4　低温处理对愈伤组织器官分化的影响
继代的愈伤组织存在白色 、淡绿色和紫红 3种
类型 。根据文献报道[ 15] ,只有紫红色的愈伤组织具
有分化能力 。将正常培养和经 4℃低温处理 7 d的
紫红色愈伤组织接种至MS+0.5 ～ 4.0 mg/L 6_BA+
0.2 mg/L NAA培养基上都有产生不定芽的能力 。
紫红色的愈伤组织培养 14 d后 ,愈伤组织紫红色加
深 ,质地变得紧密 ,并开始出现绿色芽点 ,在MS+2.0
mg/L 6_BA+0.2mg/L NAA培养基上的芽点最多。20
d后将带芽点的愈伤组织块转接到 2.0 mg/L 6_BA+
0.2 mg/L NAA 上继续培养 ,不经低温处理的紫红色
愈伤组织虽能产生较多的芽点 ,但芽点畸形 ,且不能
正常伸长。经 4℃处理过的紫红色愈伤组织不仅能
诱导出密集的芽点 ,且继续培养芽点能较快长出叶片
形成叶丛 ,并长大成芽(表3)。
表 3　低温处理对愈伤组织器官分化的影响
Tab.3　The influence of　low temperature on
inducing callus differentiation
激素组合(mg/ L)
Hormone Combination
粉红色愈伤组织 Pink callus
20℃ 4℃
6_BA 0.5+NAA 0.2 无分化 芽点少 ,正常芽
6_BA 1.0+NAA 0.2 芽点少 ,畸形芽 芽点少 ,正常芽
6_BA 2.0+NAA 0.2 芽点多 ,畸形芽多 芽点多 ,正常芽
6_BA 4.0+NAA 0.2 无分化 无分化
表 4　不同浓度的 6_BA ,NAA浓度对愈伤组织再生芽的影响
Tab.4　The effects of different 6_BA and NAA concentration on inducing Adventitious buds of callus
6_BA(mg/ L) NAA(mg/L) 接种愈伤组织数(块)
Callus explant number
愈伤组织再生芽数
Bubs number
出芽率(%)
Inducing ratio
0 0 30 0 0
0 0.2 30 0 0
0.5 0 30 0 0
0.5 0.2 30 29 96.6
1.0 0 30 24 80.0
1.0 0.2 30 17 56.0
1.5 0 30 31 100.0
1.5 0.2 30 59 196.6
2.0 0 30 48 160.0
2.0 0.2 30 72 240.0
4.0 0.2 30 0 0
2.5　不同浓度的 6_BA与 NAA组合对愈伤组织再
生芽诱导率的影响
愈伤组织同上 ,经 4℃低温处理后 ,选用 MS基
本培养基+水解乳蛋白 250 mg/L ,并以不同浓度的
6_BA与NAA搭配(表4),每组接种 6瓶 ,每瓶接种愈
伤组织 5块。结果表明:25 d后 ,在 MS+水解乳蛋
白 250mg/L +6_BA 2.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L的培
养基上 , 生成再生芽的数目最多 , 总出芽率可达
240%。而在其他组合的培养基中 ,愈伤组织生成再
生芽的数目相对较少。表明愈伤组织适宜在 MS+
水解乳蛋白 250 mg/L +6_BA 2.0 mg/L +NAA 0.2
mg/L 的培养基上形成再生芽 。
6期 祝建波等:小果雪兔子的组织培养 61　
2.6　再生芽继代培养和生根培养
再生的丛生芽继代培养MS , 3/4 MS 和 1/2 MS
基本培养基中 , 附加水解乳蛋白 250 mg/L +
6_BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L , pH 5.8 ,琼脂 5.5
g/L ,蔗糖 30 g/L ,所有处理丛生芽都能继续分化增
殖 ,增殖倍数都可达 3 ～ 5倍 。但在 MS 培养基中 ,
从生芽生长较慢 ,而 1/2 MS中丛生苗培养 30 d后 ,
叶片很容易白化。只有在 3/4MS培养基中 ,多次继
代 ,生长状况良好。
将高度 2 ～ 3 cm 的无根苗接种至 1/2MS+IAA
(0.5 ,1 ,1.5 mg/L)+0.5%活性炭的生根培养基上 ,
在 IAA 0.5 ～ 1.5 mg/L 范围内 ,幼苗培养 20 d 左右
开始都在基部长出乳白色根 ,但随着 IAA 浓度升
高 ,在幼苗基部的会形成较大的愈伤组织块 。其中
以 IAA 0.5 mg/L 形成的量最小 ,生根率达 74%,单
株根数介于 4 ～ 8条 。小果雪兔子适应在较低温度
条件下生长 ,移栽至室外后 ,在≥25℃条件下很难生
存 ,移栽至室外 14 ～ 21 d后 ,全部死亡 ,移栽成活率
为0 。
3　讨论
根据当前的研究资料表明[ 6～ 17] ,雪莲的组织培
养主要以MS 为基本培养基 ,在愈伤组织诱导和芽
的分化中最适合的细胞分裂素为 6_BA。而对生长
素种类要求不严格 ,主要以NAA为主。使用的糖源
一般是蔗糖。适合诱导愈伤组织的外植体类型主要
是下胚轴和叶片 ,诱导的愈伤组织有形态上的差异 ,
而只有紫红色疏松型的愈伤组织才能分化成苗 ,分
化的方式主要是不定芽 ,增殖方式基本上以丛生芽
为主 。
小果雪兔子是喜低温植物 ,无论是愈伤组织还
是组培苗都需在较低温度下才能生长良好。超过
25℃愈伤组织逐渐变褐 ,组培苗枯死 ,较大温差也是
促进其生长的有利因子 。本研究也表明 ,小果雪兔
子在超过 20℃时 ,叶片极易黄化死亡 ,而且生根苗
移栽后难以在室温下培养存活 。在雪兔子亚属中的
水母雪莲[ 11 ,15] 、雪兔子[ 14] 、小果雪兔子不论是不定
芽的分化还是根的诱导 ,都需要经过一定条件的低
温处理才能正常分化 ,而雪莲亚属中的新疆雪莲可
在较高的温度下进行器官分化[ 18 , 19] ,其原因究竟跟
脱分化过程中失去了对低温的严格要求 ,还是跟雪
莲的不同亚属之间存在着不同的生理差异 ,有待于
进一步研究。
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