全 文 :白鲜碱对 HepG2 细胞的毒性作用及其机制
郭晓培1,李艾芳1,张宝旭1,2,王 旗1,2
(1. 北京大学公共卫生学院毒理学系,北京 100191;2. 国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室,
北京 100191)
摘要:目的 研究白鲜碱的肝细胞毒性作用及其毒性机制。方法 白鲜碱 2. 5 ~ 800 μmol·L -1与
HepG2 细胞作用24 h,用 MTT法检测细胞存活率并计算 IC50值,用乳酸脱氢酶( LDH) 释放实验检测细胞
膜损伤。白鲜碱 25 ~100 μmol·L -1与 HepG2 细胞作用 4,24 或 48 h,用试剂盒方法分别检测细胞培养液
中丙氨酸转氨酶( ALT) 、天冬氨酸转氨酶( AST) 、谷胱甘肽 S-转移酶( GST) 和谷氨酰转肽酶( GGT) 活性。
用倒置显微镜观察细胞形态变化; 激光共聚焦扫描显微镜检测细胞线粒体膜电位的变化。结果 白鲜碱
25 ~800 μmol·L -1与 HepG2 细胞作用 24 h 对 HepG2 细胞存活的抑制作用随着浓度的增加而降低
( r =0.965,P <0. 05) ,IC50值为( 283 ±27) μmol·L
-1。与溶剂对照组相比,白鲜碱 12. 5 ~50 μmol·L -1作
用 24 h,HepG2 细胞 LDH释放率显著升高( P <0. 01) 。白鲜碱 100 和 200 μmol·L -1可引起 HepG2 细胞
形态发生明显变化,细胞皱缩脱落,细胞数目减少,并使 HepG2 细胞线粒体膜电位下降 ( P < 0. 05,P <
0. 01) 。白鲜碱 100 和 200 μmol·L -1与 HepG2 细胞作用 24 h可使细胞培养液中 ALT和 AST活性显著升
高,并呈浓度依赖性( r =0.995,P <0.05 和 r =0.996,P <0. 05) ,线粒体膜电位亦明显下降( r =0.978,P <
0. 05) 。与溶剂对照组相比,白鲜碱 100 和 200 μmol·L -1与 HepG2 细胞作用 4 h,细胞培养液中 GST活性
明显升高 ( P < 0. 05 ) ; 作用 24 h,GST 活性升高呈浓度依赖性 ( r = 0. 987,P < 0. 05) 。白鲜碱
200 μmol·L -1作用 48 h导致 HepG2 细胞培养液中 GGT活性升高( P <0. 05) 。结论 较高浓度的白鲜碱
(≥100 μmol·L -1 )具有潜在的肝毒性,细胞膜损伤和线粒体损伤可能是其肝毒性作用机制之一。
关键词:白鲜碱; HepG2 细胞; 细胞毒性
中图分类号:R965,R285. 1 文献标志码:A 文章编号:1000-3002(2013)01-0095-06
DOI:10. 3867 / j. issn. 1000-3002. 2013. 01. 018
白鲜皮是芸香科植物白鲜 (Dictamnus
dasycarpus)的根皮,为常用的传统中药。白鲜碱
(dictamnine)是白鲜皮的主要成分之一,又称白鲜
胺或白藓碱,属呋喃喹啉类生物碱,在白鲜皮中含量
约 0. 1%[1]。白鲜碱能抑制血小板聚集、松弛血管
并降低血压等,具有抗菌、抗病毒和治疗皮肤湿疹和
皮肤瘙痒的作用[2 -4]。2008 年,Jang等[5]报道,韩
国农村地区患者连续服用白鲜碱水煎剂每日 5 ~ 6
次,连续数日,出现急性肝炎,提示白鲜皮具有潜在
急性肝毒性。本实验室研究发现,ig给予 ICR小鼠
白鲜 皮 水 煎 剂,小 鼠 血 清 中 丙 氨 酸 转 氨 酶
(alanine transaminase,ALT)、乳酸脱氢酶(lactate
基金项目:北京市自然科学基金项目(7122105) ;北京
大学 985 项目(BMU20100119)
作者简介:郭晓培(1984 - ) ,女,硕士研究生,主要从
事药物毒理学研究,E-mail:gxpbjdx@126. com
通讯作者:王 旗,E-mail:wangqi@bjmu. edu. cn,
Tel: (010)82801527
dehydrogenase,LDH)和碱性磷酸酶活性及总胆红
素明显升高,并具有一定的剂量效应关系;较高剂量
白鲜皮给药 48 h后,小鼠肝组织出现大面积中心性
坏死。白鲜皮中主要成分之一的白鲜碱单独给药达
到一定剂量,也可致 ICR小鼠发生急性肝损伤,ALT
和 LDH活性与对照组相比明显升高(待发表)。上
述体内实验结果表明,白鲜碱具有潜在的肝毒性,可
能是白鲜皮中的毒性成分。HepG2 细胞来源于人
肝胚细胞瘤,其所含的生物转化代谢酶与人正常肝实
质细胞具有同源性,其分化程度较高,并且保留了较
完整且活性稳定的生物转化代谢酶,是研究药物肝毒
性常用的细胞模型之一[6 -7]。本研究用 HepG2细胞
研究白鲜碱的肝毒性作用及其毒性机制。
1 材料与方法
1. 1 细胞、药物、主要试剂和仪器
HepG2细胞,北京协和细胞资源中心。白鲜碱,
中国药品生物制品检定所(批号:200301,纯
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度≥98%) ;阳性对照盐酸胺碘酮(amiodarone,AD)
和盐酸普萘洛尔(propranolol hydrochloride,PPH) ,
天津一方科技有限公司;羰基氰化氯苯腙(carbonyl
cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP) ,北京百
灵威化学技术有限公司。Triton X-100 和罗丹明
123,Sigma公司;MEM 培养基,北京清大天一生物
科技 有 限 公 司;胰 蛋 白 酶、MTT 和 HEPES,
Amresco公司;ALT、天冬氨酸转氨酶(aspartate
aminotransferase,AST)、LDH、谷胱甘肽 S-转移酶
(glutathione S-transferase,GST)和谷氨酰转肽酶
(glutamyltranspeptidase,GGT)活性测定试剂盒,
南京建成生物工程有限公司。Multiskan MK3 酶标
仪,美国 Thermo 公司;TE2000-S 倒置显微镜和
DXM1200F数字摄像机,日本 Nikon 公司;SW-CJ-
1F超净工作台,苏州安泰空气技术有限公司。
1. 2 MTT法测定细胞存活率
将 HepG2 细胞培养在含 10%胎牛血清、青霉
素100 kU·L -1和链霉素 100 kU·L -1、含 Earle盐和
L-谷氨酰胺的 MEM 培养基中,置于 37℃,5%CO2
培养箱,24 ~48 h 换液,每 2 ~3 d 传代 1 次。用无
水乙醇溶解白鲜碱,再用不含血清的 MEM培养基稀
释至所需浓度。取对数生长期的 HepG2 细胞(3 ~
5)×105 L -1接种于 96 孔培养板上,每孔200 μl。待
12 h细胞完全贴壁以后,吸去上清液,分别加入不同
浓度的白鲜碱 200 μl,其终浓度分别为 25,50,100,
200,300,400,500 和 800 μmol·L -1,正常对照组为
细胞加入等体积无血清培养基,溶剂对照组用等体积
的1%无水乙醇代替白鲜碱,作用24 h。每组设5个
复孔。用 MTT 法测定细胞存活率。细胞存活率
(%)=加药组 A490 nm /正常对照组 A490 nm ×100%。
1. 3 LDH释放率测定
细胞处理同 1. 2,白鲜碱的终浓度分别为 2. 5,
5,12. 5,25,50,100 和 200 μmol·L -1,每个浓度
4 个复孔,细胞置于 37℃,5% CO2 培养箱中培养
24 h,吸取细胞上清液 20 μl,然后每孔加入 2%
Triton X-100 溶液 200 μl,裂解细胞 1 h,吸取每孔
裂解液20 μl,按照试剂盒说明书的方法分别测定细
胞培养上清液中 LDH的含量和细胞裂解液中 LDH
的含量,LDH 释放率(%)=细胞上清液中 LDH 含
量 /(细胞上清液 LDH含量 +细胞裂解液中 LDH 含
量)×100%。
1. 4 细胞形态观察
取对数生长期的 HepG2 细胞(3 ~5)×107 L -1
接种于 6 孔培养板上,每孔 1500 μl。待 12 h 细胞
完全贴壁后,吸去上清液,分别加入白鲜碱 1500 μl,
终浓度分别为 25,50,100 和 200 μmol·L -1,另设正
常对照和溶剂对照组。于 37℃,5%CO2 培养箱培
养 24 h后,倒置显微镜下观察细胞形态的变化并
拍照。
1. 5 细胞培养液中 ALT,AST,GST 和 GGT 活性
测定
细胞培养同 1. 2。白鲜碱的终浓度分别为 25,
50,100 和 200 μmol·L -1,每个浓度 4 个复孔,于
37℃,5%CO2 培养箱中培养。测定 ALT,AST,GST
和 GGT活性的阳性对照分别为 AD 25 μmol·L -1,
AD 25 μmol·L -1,Triton X-100 80 μmol·L -1和 PPH
125 μmol·L -1。培养时间分别为 24 h;24 h;4 和
24 h及 4,24和 48 h。培养结束后,吸取上清液,按
照 ALT,AST,GST和 GGT试剂盒方法进行处理后,
用酶标仪分别在 510 nm(ALT,AST 和 GST)或
410 nm(GGT)处测定每孔 A值,计算细胞培养液中
ALT,AST,GST和 GGT含量。
1. 6 线粒体膜电位的测定
取对数生长期的 HepG2 细胞,消化后种于共
焦小皿中,细胞密度为 1 ×105 L -1,每孔 500 μl,待
12 h细胞完全贴壁后,吸出培养液,加入白鲜碱,终
浓度分别为 25,50,100 和 200 μmol·L -1,正常对照
和溶剂对照组同 1. 2,作用 HepG2 细胞 24 h,阳性
对照为 CCCP 20 μmol·L -1作用 30 min,PBS清洗
2 次,加入终浓度为 2 mg·L -1的罗丹明 123 负载液
500 μl,孵育 20 ~30 min 后,PBS 清洗 2 次覆盖贴
壁细胞,激光共聚焦扫描显微镜下观察线粒体膜电
位的变化。
1. 7 统计学分析
实验结果数据以x ± s 表示,应用 SPSS 16. 0
软件进行单因素方差分析(ANOVA) ,组间均数比
较采用 t检验,P <0. 05 认为具有统计学差异。
2 结果
2. 1 白鲜碱对 HepG2 细胞存活率的影响
如图 1所示,与正常对照和溶剂对照组相比,不
同浓度的白鲜碱与 HepG2 细胞作用 24 h,细胞存活
率随着浓度的增加而降低(r = 0. 965,P < 0. 05) ,
800 μmol·L -1可使细胞存活率降至 10%以下。用
Origin8.0软件拟合计算 IC50为(283 ±27)μmol·L
-1。
2. 2 白鲜碱对 HepG2 细胞膜的损伤
由表 1 看出,白鲜碱在 12. 5 ~ 50 μmol·L -1时
引起 HepG2 细胞膜损伤,LDH 释放率较溶剂对照
组显著升高(P < 0. 01) ,但随着白鲜碱浓度增加,
LDH释放率反而降低,与溶剂对照组无显著差异。
·69· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 2 月第 27 卷第 1 期 Chin J Pharmacol Toxicol,Vol 27,No 1,Feb 2013
Fig. 1 Effect of dictamnine on survival of HepG2 cells.
HepG2 cells were incubated with dictamnine 25,50,100,200,
300,400,500 and 800 μmol·L -1 for 24 h. The cell viability was
examined by MTT assay. NC:normal control;SC:solvent(1%
ethanol)control. Cell viability(%)= A490 nm of drug group /A490 nm
of NC group. x ± s,n =5.
Tab. 1 Effect of dictamnine on lactate dehydrogenase
(LDH)release in HepG2 cells
Group LDH release rate /%
Normal control 8. 2 ±2. 8
1% Ethanol 7. 0 ±1. 5
Dictamnine 2. 5 5. 8 ±1. 1
5 10. 4 ±0. 9
12. 5 18. 8 ±1. 7**
25 23. 4 ±0. 8**
50 13. 3 ±2. 1**
100 7. 1 ±2. 1
200 3. 8 ±0. 9
HepG2 cells were incubated with dictamnine 2. 5,5,12. 5,25,
50,100 and 200 μmol·L -1 for 24 h. The release of LDH was
measured by using LDH assay kit. x ± s,n = 4. ** P < 0. 01,
compared with 1% ethanol group.
2. 3 白鲜碱对 HepG2 细胞形态的影响
如图 2 所示,HepG2 细胞形状无规则,处于增
长期时,细胞增殖明显,呈片状生长。白鲜碱作用
HepG2 细胞 24 h,与正常对照和溶剂对照组相比,
细胞数目明显减少;白鲜碱浓度为 100 和
200 μmol·L -1时,细胞死亡漂浮的数量更多,细胞
皱缩,散开,脱落。
2. 4 白鲜碱对 HepG2 细胞 ALT 和 AST 活性的
影响
由表 2 看出,白鲜碱与 HepG2 细胞作用 24 h,
与溶剂对照组相比,阳性对照 AD 25 μmol·L -1组
HepG2细胞培养液中ALT和AST活性明显升高
Fig. 2 Effect of dictamnine on morphological changes of
HepG2 cells (×100). See Tab. 1 for the cell treatment. The
morphological changes of HepG2 cells were observed under a
contrast microscope. A:normal control;B:1% ethanol;C - F:
dictamnine 25,50,100 and 200 μmol·L -1,respectively.
Tab. 2 Effect of dictamnine on alanine transaminase
(ALT)and aspartate aminotransferase (AST)activity in
HepG2 cells
Group ALT /U·L -1 AST /U·L -1
Normal control 13. 64 ±0. 14 12. 2 ±2. 8
1% Ethanol 14. 49 ±1. 09 14. 0 ±1. 1
Amiodarone 18. 69 ±0. 11 * 15. 3 ±1. 0*
Dictamnine 25 13. 91 ±0. 19 26. 0 ±2. 8*
50 13. 94 ±0. 49 28. 7 ±5. 7*
100 17. 88 ±1. 19* 49. 9 ±9. 4**
200 28. 76 ±1. 64* 103. 0 ±5. 6**
See Tab.1 for the cell treatment. Amiodarone:25 μmol·L -1 . x ± s,
n =4. * P <0. 05,**P <0. 01,compared with 1% ethanol group.
(P <0. 05) ;白鲜碱 100 和200 μmol·L -1组 ALT 活
性显著升高(P < 0. 05) ,具有浓度依赖关系(r =
0.995,P <0. 05) ;白鲜碱 25 ~ 200 μmol·L -1均使
AST 活性升高,且具有浓度依赖性(r = 0. 996,
P <0. 05)。
2. 5 白鲜碱对 HepG2 细胞 GST活性的影响
如表3所示,阳性对照 Triton X-100 80 μmol·L -1
与 HepG2 细胞作用 4 和 24 h,与其对应的溶剂对
照(0. 4%DMSO)组相比,GST 活性明显升高(P <
0.05,P < 0. 01)。白鲜碱 25 和 50 μmol·L -1与
·79·中国药理学与毒理学杂志 2013 年 2 月第 27 卷第 1 期 Chin J Pharmacol Toxicol,Vol 27,No 1,Feb 2013
HepG2 细胞作用4 h,GST活性与其对应的溶剂对照
(1%乙醇)组相比无明显变化;100 和 200 μmol·L -1
时,GST 活性明显升高(P < 0. 01);白鲜碱 50 ~
200 μmol·L -1与 HepG2细胞作用 24 h,GST 活性均
明显升高(P <0.05,P <0. 01)。
Tab. 3 Effect of dictamnine on glutathione S-transferase
(GST)activity in HepG2 cells
Group
GST /kU·L -1
4 24(h)
Normal control 0. 00 ±0. 02 0. 00 ±0. 05
1% Ethanol 0. 05 ±0. 03 0. 67 ±0. 02
0. 4%DMSO 0. 29 ±0. 02 0. 52 ±0. 04
Triton X-100 2. 47 ±0. 02* 9. 26 ±0. 00**
Dictamnine 25 -0. 15 ±0. 05 1. 10 ±0. 01
50 0. 13 ±0. 08 5. 21 ±0. 01#
100 3. 23 ±0. 03## 7. 96 ±0. 01#
200 3. 28 ±0. 08## 18. 38 ±0. 01##
Triton X-100 was 80 μmol·L -1 and its solvent was 0. 4%DMSO.
x ± s,n =4. * P <0. 05,**P <0. 01,compared with 0. 4%DMSO
group;#P <0. 05,##P <0. 01,compared with 1% ethanol group.
2. 6 白鲜碱对 HepG2 细胞 GGT活性的影响
由表 4 可见,与 1%乙醇溶剂对照组相比,阳性
对照 PPH 和白鲜碱与 HepG2 细胞分别作用 4 和
24 h,GGT 活性均无明显变化。与 HepG2 细胞作
用 48 h,与溶剂对照组相比,PPH 和白鲜碱
200 μmol·L -1组 GGT活性明显升高(P <0. 05)。
Tab. 4 Effect of dictamnine on glutamyl transferase
(GGT)activity in HepG2 cells
Group
GGT /U·L -1
4 24 48(h)
Normal control 0. 00 ±0. 01 0. 00 ±0. 03 0. 00 ±0. 02
1% Ethanol -3. 43 ±0. 02 -2. 01 ±0. 09 0. 15 ±0. 01
PPH 0. 35 ±0. 01 2. 73 ±0. 07 14. 50 ±0. 03*
Dictamnine 25 -3. 78 ±0. 01 -2. 77 ±0. 03 2. 33 ±0. 03
50 -4. 89 ±0. 07 -0. 14 ±0. 04 2. 73 ±0. 05
100 -4. 94 ±0. 03 1. 03 ±0. 14 4. 53 ±0. 07
200 -4. 65 ±0. 11 3. 90 ±0. 05 8. 45 ±0. 12*
PPH:propranolol hydrochloride,125 μmol·L -1 . 珔x ± s,n = 5.
* P <0. 05,compared with 1% ethanol group.
2. 7 白鲜碱对 HepG2 细胞线粒体膜电位的影响
由图 3 和表 5 所示,白鲜碱与 HepG2 细胞作
用 24 h,罗丹明 123 的荧光强度随着白鲜碱浓度的
增加而逐渐下降,呈一定的浓度依赖关系(r =
0.978,P <0. 05) ,表明白鲜碱浓度越大,线粒体膜
电位下降越多,线粒体膜损伤越严重。
Fig. 3 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane
potential in HepG2 cells determined with rhodamine 123
(OI:×40;NA =1. 25). See Tab. 1 for the cell treatment. OI:
oil immersion;NA:numerical aperture. A:normal control;B:1%
ethanolo;C:carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP)
20 μmol·L -1 for 30 min;D -G:dictamnine 25,50,100 and 200
μmol·L -1 for 24 h.
Tab. 5 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane
potential (ΔΨ)in HepG2 cells
Group ΔΨ(fluorescence intensity)
Normal control 77 ±7
1% Ethanol 76 ±7
CCCP 60 ±3 *
Dictamnine 25 72 ±3
50 63 ±4
100 57 ±3 *
200 39 ±4**
See Fig. 3 for the cell treatment. x ± s,n =3. * P <0. 05,**P <
0. 01,compared with 1% ethanol group.
·89· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 2 月第 27 卷第 1 期 Chin J Pharmacol Toxicol,Vol 27,No 1,Feb 2013
3 讨论
近年含有白鲜皮的中药复方如青黛丸、消银片、
克银丸、白癜风胶囊、湿毒清胶囊和痔血胶囊等均有
造成不同程度肝损伤的报道,引起各方面的关注。
本研究观察白鲜皮的主要成分之一白鲜碱的肝细胞
毒性。MTT结果表明,白鲜碱对 HepG2 细胞作用
24 h,IC50值为(283 ± 27)μmol·L
-1,此结果与
Schempp等[2]报道白鲜碱对人 Jurkat 细胞光毒性
作用的 IC50为 245 μmol·L
-1相近;但郭娜等[3]报道,
白鲜碱对人脾细胞毒性作用的 IC50≥1024 mg·L
-1
(约5. 14 mmol·L -1) ;由此表明白鲜碱对不同类型
细胞的毒性不同。LDH 是反映外源性化合物引起
细胞膜损伤的指标。本研究结果表明,白鲜碱在
12. 5 ~50 μmol·L -1时使 HepG2 细胞 LDH 释放率
增加,高于 50 μmol·L -1时细胞的 LDH 释放率与溶
剂对照组相比无明显差异,这可能与细胞形态皱缩
和数目减少有关。显微镜下观察细胞形态的改变也
发现,随着白鲜碱浓度的增加,细胞皱缩,脱落,细胞
数目迅速减少,漂浮的死亡细胞越来越多。
MTT实验检测的是线粒体内琥珀酸脱氢酶
(succinate dehydrogenase,SDH)的活性,SDH 是
线粒体内膜的结合酶,为反映线粒体活性的一种标
志酶。白鲜碱对 HepG2 细胞存活的影响呈浓度依
赖关系,提示 HepG2 细胞线粒体活性随白鲜碱浓
度的增大而降低,这与本研究检测的线粒体膜电位
随白鲜碱浓度的增大而下降趋势是一致的。肝是体
内含酶最丰富的器官,也是酶代谢的主要场所,当肝
受损伤时,肝细胞膜通透性增加,肝细胞内的酶外
漏,导致血清中酶的活性增高。ALT 存在于细胞
质,AST主要存在于线粒体。已有研究表明,AD 对
HepG2细胞的毒性与其引起 ALT 和 AST 活性变化
有关[8 -9]。因此本研究选用 AD作为检测 HepG2 细
胞培养液中 ALT 和 AST 活性的阳性对照。本研究
结果表明,白鲜碱较高浓度(100 和 200 μmol·L -1)
能引起 HepG2 细胞培养液中的 ALT 活性升高,而
白鲜碱低浓度 25 μmol·L -1即导致 AST 活性升高,
并呈浓度依赖关系,且 AST 活性升高幅度比 ALT
更明显。此结果表明,白鲜碱可引起线粒体中的
AST外泄,伴随细胞质中的 ALT漏出。
HepG2 细胞的特点为主要表达Ⅱ相代谢酶,
GST 是体内生物转化重要的Ⅱ相代谢酶之一。
GST 亦称为胆红素结合蛋白,由于其分子质量较
ALT小,易穿过受损的细胞膜溢出胞外,在肝细胞
膜受损时其升高先于 ALT 的升高,反映细胞毒性更
加敏感。GGT在肝中主要在肝细胞线粒体产生,而
且对肝毒性的特异性高。因此,本研究深入探讨白
鲜碱对 HepG2 细胞 GST 和 GGT 活性的影响。
Gerets 等[10]报道,一定剂量的 Triton X 100 能引起
HepG2 细胞中 α-GST 活性升高。也有研究报道,
一定浓度的 AD 作用于细胞后,肝细胞受到较严重
损伤时,GGT 活性特异性地升高[11]。本研究中不
同浓度的白鲜碱分别作用 4 和 24 h,较高浓度白鲜
碱100 和 200 μmol·L -1可使 HepG2 细胞培养液中
的 GST活性升高。作用时间延长至 48 h,可使细
胞培养液中 GGT 活性升高。该结果提示,白鲜碱
在达到一定浓度和时间后,可造成 HepG2 细胞中
GST和 GGT 的释放,GST 活性的敏感性更高,作
用短时间即受到影响。
综上所述,白鲜碱对 HepG2 细胞具有毒性,白
鲜碱的毒性作用涉及线粒体活性的变化和细胞膜损
伤,伴随多种酶活性的改变。
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Cytotoxic effect of dictamnine on HepG2 cells
and its possible mechanism
GUO Xiao-pei1,LI Ai-fang1,ZHANG Bao-xu1,2,WANG Qi1,2
(1. Department of Toxicology,School of Public Health,Peking University,Beijing 100191,China;
2. Key Laboratory of State Administration of TCM for Compatibility Toxicology,
Beijing 100191,China)
Abstract:OBJECTIVE To study the dictamnine-induced hepatotoxicity in vitro and to explore its
mechanism. METHODS HepG2 cells were exposed to dictamnine 2. 5 - 800 μmol·L -1 for 24 h,and
cell viability was examined by MTT assay. Cell membrane injury was examined by detecting the release
rate of lactate dehydrogenase (LDH) ,and the morphological changes were observed under a contrast
microscope. The activities of alanine transaminase (ALT) ,aspartate aminotransferase (AST) ,glutathi-
one S-transferase (GST)and glutamyltranspeptidase (GGT)in HepG2 cell cultures were measured
using enzyme-labeled instrument,respectively. The mitochondrial membrane potential was measured by
laser scanning confocal fluorescence microscope. RESULTS HepG2 cell viability was significantly re-
duced following exposure to dictamnine 25 -800 μmol·L -1 for 24 h in a concentration-dependent manner
(r =0.965,P <0. 05) ,and IC50 value was (283 ±27)μmol·L
-1 . The LDH release rate of HepG2 cells
was significantly increased after exposure to dictamnine 12. 5 - 50 μmol·L -1 for 24 h (P < 0. 01). The
morphology of HepG2 cells after 24 h exposure to dictamnine 100 and 200 μmol·L -1 was changed great-
ly. The cells wrinkled up and dropped. Compared with control group,ALT and AST activities in HepG2
cell culture were significantly increased (P <0. 05)in a concentration-dependent manner (r =0. 995,P <
0. 05 and r =0. 996,P <0. 05)following exposure to dictamnine 100 and 200 μmol·L -1 for 24 h,and the
mitochondrial membrane potential markedly declined(r =0.978,P <0. 05). After exposure to dictamnine
100 and 200 μmol·L -1 for 4 h,GST activity in HepG2 cell culture was significantly increased(P <0. 05) ;
and for 24 h,GST activity in dictamnine 50,100 and 200 μmol·L -1 groups was also increased in a con-
centration-dependent manner (r = 0. 987,P < 0. 05). After exposure to dictamnine 200 μmol·L -1 for
48 h,GGT activity in HepG2 cell culture was increased (P <0. 05). CONCLUSION Dictamnine at
higher concentrations(≥100 μmol·L -1)has potential hepatotoxicity. The cell membrane damage and
mitochondrial membrane damage may be involved in the dictamnine-induced hepatotoxity mechanism.
Key words:dictamnine;HepG2 cells;cytotoxicity
Foundation item:The project supported by Beijing Natural Science Foundation of China (7122105) ;and Peking
University 985 Grant (BMU20100119)
Corresponding author:WANG Qi,E-mail:wangqi@bjmu. edu. cn,Tel: (010)82801527
(收稿日期:2012-05-13 接受日期:2012-11-21)
(本文编辑:齐春会)
·001· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 2 月第 27 卷第 1 期 Chin J Pharmacol Toxicol,Vol 27,No 1,Feb 2013