全 文 ：收稿日期:2005-08-04
基金项目:中药质量评价商用软件的开发与应用 ,广州市攻关项目(2004Z3-E5011)
作者简介:蔡泽凡(1979—),男 ,广东陆丰人 ,硕士研究生 ,研究方向:中药现代化(E-mail:caizefan@163.com)。
文章编号:1003-6199(2006)01-0106-04
指纹图谱应用于田基黄的鉴定研究
蔡泽凡 ,张　峰 ,朱学峰
(华南理工大学自动化科学与工程学院 ,广东 广州　510640)
　　摘　要:利用高效液相色谱建立了田基黄的色谱指纹图谱 。根据色谱指纹图谱各个谱峰的相对保留时
间值α和相对面积 Sr对色谱指纹图谱进行分析对比研究 , 建立一个快速 、简易鉴别田基黄样品的色谱指纹
图谱分析方法。该法为中药样品的鉴定提供较全面的信息。
关键词:HPLC (高效液相色谱);色谱指纹图谱;田基黄
中图分类号:TP391.41　　　　　文献标识码:A
The Research of the Identification of Hypericum Japonicum Thumb
by High Performance Liquid Chromatographic Fingerprint
CAI Ze-fan ,ZHANG Feng ,ZHU Xue-feng
(College of Automation Science &Engineering , South China University of Techno logy , Guangzhou　510640 , China)
　　Abstract:This paper introduces a method to distinguish Hypericum japonicum Thumb.It established a chromatographic fin-
gerprint method for fast and simple identification of Hypericum japonicum Thumb based on the rela tive retention time and relative
peak area.This method provides useful information for identification of traditional Chinese medicines , and is a development for the
application of HPLC in sample analysis and identification of complex components.
Key words:high perfo rmance liquid chromatography;chromatographic fingerprint;hypericum japonicum thumb
1　引言
田基黄(Hypericum japonicum Thumb.)又名
地耳草 ,民间别名有小元宝草 、雀舌草 、七层塔等 ,
为藤黄科植物地耳草的全草 ,一年生小草本[ 1] 。
广布长江流域及以南各省区;缅甸 ,印度 ,斯里兰
卡 ,日本 ,大洋洲 。生于田野较湿处 。全草入药 ,能
清热解毒 ,止血消肿 ,治肺炎 ,跌打损伤及疮毒 。药
用中田基黄用得很广 ,正确的辨别田基黄是用药安
全的关键。中药指纹图谱质控技术是中药质量标
准现代化的突破口 ,将现代分析科学的优秀成果与
中医药整体综合观有机融合 ,有效地运用了全面质
量管理的理念 ,能对中药复杂体系特性做出科学的
表达 。可用于成品质量 、工艺操作 、原料药材的质
量控制和监测 ,使其符合 GAP 的质量要求[ 2] 。本
文正是利用了中药指纹图谱质控技术的特点 ,采用
HPLC 指纹图谱对田基黄进行鉴定 ,并取得了良好
的效果。
2　田基黄样品的选取
为了使鉴定结果能全面反映实际情况 ,我们从
药材的产地 、品种 、栽培 、加工等方面进行考虑 ,选取
了田基黄的15个样品 ,同时还特意选取了容易被人
们误认为是田基黄的遍地金样品 ,如表1所示。
3　田基黄 HPLC指纹图谱的获得
本实验对田基黄 15个样品及 1个遍地金样品
第 25卷第 1期
2 0 0 6 年 3月
计　算　技　术　与　自　动　化
Computing Technology and Automation
Vol.25 , No.1
　Mar.2 0 0 6
的HPLC指纹图谱进行了实验 ,这些样品和HPLC
表 1　15 个田基黄样品和一个遍地金样品
编号 产地 来源 备注
1 广西桂林 2002.8 购于广西桂林药材站 饮片
2 广西桂平 2002.8 购于广西桂平 长约 40cm
3 广西梧州 2002.7采集 长约 35cm
4 广西来宾 2002.8采集 长约 37cm
5 广东东莞 2003.8采集 饮片
6 广东湛江 2003.8采集 长约 30cm
7 广东韶关 2003.8采集 长约 22cm
8 江西万安 2003.7采集 长约 40cm
9 广东惠州 2003.9采集 长约 25cm
10 浙江温州 购于浙江温州 饮片
11 湖南邵阳 2003.7采集 饮片
12 云南昆明 购于云南昆明 饮片
13 云南蒙自 购于云南蒙自 长约 15cm
14 广东花都 2003.10采集 长约 30cm
15 广东揭阳 2003.8采集 长约 15cm
16
遍地金 ,人们误把其
当作田基黄
指纹图谱均由中山大学现代中药质量研究开
发中心提供。
3.1　色谱分析条件
用十八烷基硅烷键合相硅胶为填充剂
(250mm×4.0mm , 5μm);二元线性梯度洗脱:A为
0.05mol/ L 磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调 pH3.0), B
为乙腈 , 0 min(A:96%, B:4%)※100 min(A:
73%,B:27%);检测波长:300nm;温度:28℃。理
论板数按异槲皮苷计算应不低于 100000 ,分离度
不小于 1.5。
3.2　HPLC指纹图谱的获取
精密吸取对照品 、供试品溶液各 10μl ,分别注
入液相色谱仪 , 测定 , 即得 。(注:在正式获取
HPLC指纹图谱之前已经经过了稳定性测试和重
复性测试 。)
田基黄典型的 HPLC指纹图谱如图 1所示。
图 1　田基黄的典型 HPLC指纹图谱
4　田基黄 HPLC指纹图谱的分析
4.1　HPLC指纹图谱的预处理
4.1.1　基线漂移的抑制
由于色谱分析条件的漂移和外部噪声等 ,
HPLC 指纹图谱或多或少地存在基线漂移的情况 ,
给定量分析(特别是在利用峰面积作为计算相似度
时)带来偏差 。为了消除 HPLC 指纹图谱的基线
漂移造成的影响 ,我们采取了多分辨分析的方法对
指纹图谱进行小波变换 ,从而有效地抑制了指纹图
谱的基线漂移[ 3] 。小波变换是一种新的变换分析
方法 ,具有通过变换充分突出问题某些特征的特
点 ,享有“数学显微镜”的美誉[ 4] 。我们所进行的
初步研究证明了该法的有效性。
4.1.2　谱峰的识别
消除了指纹图谱的基线漂移之后 ,再对指纹图
谱的谱峰进行识别及分离。我们采取了先找波谷
再找波峰的方法 ,把谱峰一个一个的找出来 ,并存
储在一个矩阵中 ,以供后面进一步的数据处理。
4.1.3　毛刺及小峰的剔除
由于 HPLC 指纹图谱存在很多毛刺以及小
峰 ,在没有进行剔除之前 , 识别出来的谱峰多至
200-400多个 ,这不仅给分析带来了很多不便 ,而
且 ,还会导致计算和分析的错误 ,因此必须把毛刺
及小峰进行有效的剔除 。
首先 ,计算出指纹图谱的总面积 ,以及各个谱
峰的面积;
然后 ,把各个谱峰的面积和对应图谱的总面积
进行比较 ,把比值小于某一个阈值的谱峰剔除 ,通
过多次实验比较 ,根据保留有效信息 、去除多余信
息的原则 ,并使田基黄样品的相似度尽量大 、非田
基黄样品的相似度尽量小 ,我们最终选定的阈值是
0.3%。
在进行了剔除之后 ,剩下的谱峰数量在 20 多
至 30多之间 ,并且这些谱峰保留了田基黄色谱指
纹图谱的主要信息 ,说明这个数量已经足够分析的
需要 。
4.2　求取 HPLC指纹图谱的共有模式
4.2.1　确定内参照峰
根据田基黄指纹图谱的特性 ,选择一个在所有
田基黄指纹图谱都存在 、而且其峰高明显比周围的
峰要高得多的峰作为内参照峰 ,在此 ,我们选择的
峰是已知成分槲皮苷 ,如图 1所示 。
107第 25卷第 1期 蔡泽凡等:指纹图谱应用于田基黄的鉴定研究
4.2.2　归一化
把内参照峰的保留时间和峰面积定为 1 ,将其
它峰的保留时间和峰面积分别除以内参照峰的保
留时间和峰面积 ,可以求得各个峰的相对保留时间
和相对峰面积值 ,也即各个峰的归一化值。
4.2.3　求 HPLC指纹图谱的共有模式
按照文献[ 5] 的介绍方法 ,求取田基黄指纹图
谱的共有模式。由于色谱分析条件的细微变化和
外部噪声等 ,HPLC指纹图谱各个成分在洗脱过程
中 ,其保留时间存在一定的漂移 ,因此 ,在本实验
中 ,我们从实际情况出发 ,在 15个田基黄的指纹图
谱中 ,把相对保留时间差值的绝对值小于 0.018的
峰视为相同的峰 ,把在 n(n=75%×田基黄样品的
个数 15)个样品中都存在的峰视为特征峰 ,这些特
征峰构成了田基黄 HPLC 指纹图谱的共有模式 。
在实验中我们求得的特征峰的个数为 17 ,其相对
保留时间α以及相对面积 Sr如表 2 、3所示。
表 2　田基黄样品的 HPLC 指纹图谱的分析
特征峰的α
特征峰的 Sr
0.1927 0.2429 0.3288 0.4118 0.4429 0.6251 0.5162 0.6843 0.7086
0.0187 0.1019 0.0266 0.0096 0.0070 0.0071 0.0070 0.1737 0.0116
样品编号 样品各个共有峰的 S r
1 0.0430 0.0530 0.0213 0.0143 0.0112 0.0086 0.0078 0.3484 0.0063
2 0.0077 0.0803 0.0334 0.0149 0.0051 0 0.0106 0.3556 0.0041
3 0.0281 0.0797 0.0415 0.0105 0.0031 0.0039 0.0082 0.3630 0.0085
4 0 0.0572 0.0481 0.0087 0.0036 0 0.0105 0.3657 0.0122
5 0.0065 0.1423 0.0288 0.0187 0.0165 0.0045 0.0031 0.2012 0.0043
6 0 0.1228 0.0428 0.0116 0.0056 0 0 0.2344 0.0098
7 0 0.1427 0.0241 0.0100 0.0045 0 0 0.2615 0
8 0.0127 0.0759 0.0695 0.0167 0.0047 0.0052 0.0183 0.2685 0.0120
9 0 0.1460 0.0273 0.0082 0.0030 0.0038 0.0034 0.1757 0.0039
10 0 0.1762 0.0391 0.0137 0.0032 0 0.0053 0.2669 0.0069
11 0.009 0 0 0.0032 0 0 0 0.3334 0.0192
12 0.0115 0.1165 0.0604 0.0135 0.0080 0.0068 0.0082 0.3055 0.0090
13 0.0262 0.0715 0.0525 0.0105 0.0049 0.0030 0.0159 0.3659 0.0162
14 0.0201 0.1574 0.0520 0.0148 0 0.0062 0 0.3310 0
15 0 0.0532 0.0345 0.0065 0.0127 0.0142 0.0058 0.2866 0.0139
16 0.0547 0.0353 0 0.0044 0 0.0174 0 0 0.0146
总峰数 11 15 14 16 13 10 11 15 14
表 3　田基黄样品的 HPLC 指纹图谱的分析(接表 2)
特征峰的α
特征峰的 Sr
0.7713 0.8415 0.8826 0.9266 1 1.1195 1.1604 1.3059
0.0162 0.0248 0.0878 0.0092 0.1481 0.0062 0.0070 0.0167
样品编号 样品各个共有峰的 S r
1 0.0151 0.0450 0.0557 0.0057 0.1173 0.0033 0.0085 0.0306
2 0.0088 0.0284 0.1481 0.0110 0.1797 0 0.0076 0.0077
3 0.0133 0.0585 0.0957 0.0144 0.1721 0.0038 0.0044 0.0089
4 0.0273 0.0297 0.1014 0.0084 0.1797 0.0100 0.0112 0.0111
5 0.0111 0.0382 0.0739 0.0143 0.2776 0.0077 0 0.0166
6 0.0077 0.0322 0.0947 0.0103 0.2955 0 0.0036 0.0153
7 0.0103 0.0262 0.1382 0.0053 0.2204 0 0.0082 0.0293
8 0.0101 0.0123 0.1159 0.0199 0.2141 0 0.0078 0.0153
9 0 0.0184 0.15100 0.0055 0.3053 0.0040 0 0.0199
10 0.0101 0.0335 0.0924 0.0143 0.2527 0 0 0.0084
11 0.0135 0.0082 0.0772 0.0031 0.2185 0.0087 0.0068 0.0302
12 0.0091 0.0151 0.1210 0.0097 0.1862 0 0.0051 0.0135
13 0.0159 0.0418 0.0687 0.0073 0.1885 0.0034 0.0076 0.0085
14 0.0091 0.0125 0.0570 0.0084 0.1407 0.0063 0.0049 0.0155
15 0.0191 0.0287 0.0397 0.0039 0.1595 0.0076 0.0074 0.0335
16 0.013 0 0.0311 0.0074 0 0 0.0045 0.0316
总峰数 15 15 16 16 15 8 13 16
108 计算技术与自动化 2006年 3月
4.3　求取田基黄 HPLC指纹图谱的相似度
4.3.1　共有峰的识别
把田基黄各个样品的指纹图谱的谱峰和对应
特征峰进行比较 ,把对应的相对保留时间差值的绝
对值小于 0.016 ,且相对面积相差不大于 2倍的峰
视为共有峰 。各个样品的共有峰的相对面积如表
2 、3所示 。其中 , 0表示在该样品中不存在对应的
特征峰 ,16号样品为遍地金 ,从表可以看出 ,它少
了 7个特征峰。
4.3.2　相似度的求取
我们以共有峰的相对面积作为参数 ,采取夹角
余弦法求取田基黄指纹图谱的相似度。
假设对照指纹图谱即共有模式中有 N 个特征
谱峰 ,可用一个 N 维矢量X 0 =[ x 01 , x 02 , …, x 0N]
表示该共有模式 ,其中 x 0i 为第 i 个谱峰的相对面
积值 ,待测样品的指纹图谱用另一矢量 X =[ x 1 ,
x2 , …, xN ] 表示。在 N 维矢量空间中 ,可以根据两
矢量间夹角的余弦函数计算共有模式样品 X 0和待
测样品 X 两个指纹图谱间的相似度 ,计算公式如
式(1)所示[ 6] 。
r(X 0 , X)= ∑
N
i=1
x 0i · x i
∑N
i=1
x 20i · ∑N
i=1
x 2i
(1)
用此方法 ,可以计算得到 16个样品的相似度 ,
其结果如表 4所示 。
表 4　16 个样品的相似度
样品编号
共有模式 1 2 3 4 5 6 7 8
相似度 1.0000 1.0000 0.9178 1.0000 0.9793 0.9332 0.9018 0.8747 0.9380
样品编号
9 10 11 12 13 14 15 16
相似度 0.9002 0.8425 0.9498 0.9380 1.0000 0.9526 0.9982 0.7860
5　结果分析
从表 4可以看出 ,如果以>=90%作为合格的
标准 ,则田基黄的 15个样品中识别为合格的有 13
个 ,识别率为:13/15=86.7%。另外两个相似度为
87.47%、84.25%的样品 ,它们虽然也很接近合格
的标准 ,但从相似度的计算来鉴别 ,则属于质量较
差的样品 。另外 16号样品是容易被误认为是田基
黄的遍地金 ,其相似度仅为 78.60%,因此 ,从其相
似度可以很容易判别其不是田基黄 。
从以上的分析可以看出 ,进行 HPLC 指纹图
谱分析和计算是鉴别田基黄药材的一种行之有效
的方法。
参考文献
[ 1] 　辛义周 ,张希成 ,唐文照.地耳草的化学成分及药理作用研究
进展[ J] .山东医药工业 , 2003 , 22(2):28.
[ 2] 　陈新民.中药指纹图谱技术的发展现状及应用[ J] .重要研究
与信息 , 2004 , 6(3):37.
[ 3] 　袁海龙 ,雷长海 ,肖小河 ,等.小波变换校正茵陈注射液 HPLC
指纹图谱基线的研究[ J] .中国新医药 , 2003 , 2(9):13～ 14.
[ 4] 　冉启文.小波变换与分数傅立叶变换理论及应用[ M] .哈尔
滨:哈尔滨工业大学出版社 , 2001.
[ 5] 　洪莜坤 ,王智华.中药数字化色谱指纹谱[ M] .上海:上海科
学技术出版社 , 2003.
[ 6] 　陈闽军 ,程翼宇 ,林瑞超.中药色谱指纹图谱相似性计算方法
的研究[ J] .中成药 , 2002 , 24(12):906.
109第 25卷第 1期 蔡泽凡等:指纹图谱应用于田基黄的鉴定研究