全 文 ：中国药房 2007年第 18卷第 33期 China Pharmacy 2007 Vol.18 No.33 · 2591·
·中药检定 ·
HPLC 指纹图谱鉴别滇黄芩与黄芩
熊春媚 1 *,马银海 2 ,张 萍 1 ,郭亚东 1 #(1.昆明医学院药学院 ,昆明市 650031;2.昆明师范高等专科学校化
学系 ,昆明市 650031)
中图分类号 R282.4;R927 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2007)33-2591-03
摘 要 目的:建立高效液相色谱指纹图谱 , 鉴别不同产地的滇黄芩与 《中国药典》 收录的黄芩 。方法:采用反相高效液相色谱
(RP -HPLC)法 ,色谱柱为 Zorbax SB-C 18(250mm×4.6mm , 5μm),流动相为乙腈(含 1.0%甲酸)-水(含 1.0%甲酸),梯度洗
脱 ,流速为 1.0mL ·min -1 ,检测波长为 274nm ,柱温为 30℃。结果:不同产地的滇黄芩指纹图谱相似度较好 ,不同产地的黄芩之间
指纹图谱相似度也较好;但滇黄芩与黄芩的相似度仅为 0.859 , 存在较大差异 。结论:本方法为深入研究滇黄芩与黄芩的质量标准
打下了基础 。
关键词 滇黄芩;黄芩;高效液相色谱指纹图谱;鉴别
Identif ication of Scutellaria amoena CH Wright and Scutel laria baicalensis Georgi with HPLC Finger -
prints
XIONG Chunmei , ZHANG Ping , GUO Yadong(School o f Pha rmacy , Kunming M edical College , Kunm ing
650031 ,China)
MA Yinhai(Dept.of Chemist ry , Kunming N ormal School of H igher Learning , Kunm ing 650031 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To identify diffe rent o rig in of Scutellaria amoena CH W right and Scutel laria baicalensis Georg i
indexed in China Pharm acopeia by HPLC fingerprints.METHODS:RP -HPLC m ethod w as adopted in w hich the samples
w ere separated on Zorbax SB-C 18(250mm×4.6mm , 5μm)co lumn at a colum n temperature of 30℃.The gradient elution w as
per formed on the mobile phase which consisted of acetonitrile(cont air ing 1.0%methanoic acid) -water (cont aining 1.0%
methanoic acid)a t a flow rate o f 1.0mL ·min -1.The de tection w ave leng th w as set a t 274nm.RESULTS:The fingerprints o f
Scutellaria amoena CH Wrigh t that from diffe rent places w ere o f g reat resem blance , so w ere the fingerp rints betw een
Scutellaria baicalensis Georg i tha t f rom dif ferent places , bu t the fingerprints betw een S cute llar ia amoena CH Wrigh t and
Scutellaria baicalensis Georgi w ere o f significant diffe rence , with resem blance of only 0.859.CONCLUSION :The
RP -HPLC fingerprint serves as basis fo r the fur the r study o f the quality cr ite ria o f S cutellaria amoena CH Wright and
Scutellaria baicalensis Georg i.
KEY WORDS S cute llar ia amoena CH Wright;S cutellaria baicalensis Georg i;HPLC Fingerprints;Identifica tion
*硕士研究生。研究方向:药物分析。E-mail:may -xcm@
sina.com
#通讯作者:教授。研究方向:药物分析。电话:0871-5338764。
E-mail:yadong -guo@yahoo.com.cn
黄芩是常用中药 , 为唇形科植物黄芩 S cute llaria
baicalensis Georg i 的干燥根 [1 ] 。 我国有些地方还将根断面为
黄色的黄芩属(Scutella ria)植物作黄芩药用 , 主要有北方一些
地区习用的粘毛黄芩(Scutellaria v iscidula Bge.)、甘肃黄芩
(S cute llar ia rehderiana Diels.)以及西南一些地区习用的滇
黄芩(Scutellaria amoena CH Wrigh t)等 。其中 ,滇黄芩是西
南地区药用黄芩的主流品种 , 分布于云南 、贵州等省 , 资源丰
富 ,最早记载于《滇南本草》 ,称其“味苦 ,性寒 。上行泻肺火 ,下
降泻膀胱火 , 归肺 、胆 、脾 、大肠 、小肠经 , 有清热燥湿 、泻火解
毒 、止血安胎等功效”。
黄芩贮藏时间较长后 , 不易与滇黄芩相区别 。曾有报道用
薄层色谱、紫外光谱对其进行鉴别 [2～4 ] , 用高效液相色谱(HPLC)
法则仅从其有效成分黄芩苷的含量高低上进行区分[ 5 ～7 ]。笔者
采用反相高效液相色谱(RP -HPLC)法 ,对云南 8个地方产的
滇黄芩与《中国药典》收录的黄芩(包括 1批甘肃黄芩)进行了
指纹图谱研究 , 旨在为深入研究滇黄芩与黄芩质量标准提供基
础 。
1 材料
1.1 仪器
1100型高效液相色谱系统 , 包括四元梯度泵 、自动进样
器 、柱温箱 、紫外检测器(美国Agilent 公司);中药指纹图谱相
似度评价系统(国家药典委员会编);CP -224S型电子分析天
平(德国 S ar torius公司)。
1.2 试药
乙腈(色谱纯 , 美国M allinckrodt Baker公司);水为超纯
水 , 其余试剂均为分析纯;黄芩苷 、黄芩素对照品(供含量测定
用 , 中国药品生物制品检定所 , 批号分别为:110715-200212 、
111595-200301)。
1.3 样品
所有药材均为市售品 , 经云南白药集团天紫红药业有限公
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司李凤蓉工程师鉴定为唇形科植物黄芩及同属植物滇黄芩的
干燥根 。不同产地的滇黄芩药材与不同批号的黄芩药材来源分
别详见表 1 、表 2 。
表 1 滇黄芩样品来源
Tab 1 Origins of Scutel laria amoena CH Wright samples
编号 产地或批号 药材性状
1 云南昆明 黄褐色 ,有皱纹;饮片
2 云南丽江 黄褐色 ,有皱纹;饮片
3 云南马街 黄褐色 ,有皱纹;饮片
4 云南曲靖 黄褐色 ,有皱纹;饮片
5 云南杨林 黄褐色 ,有皱纹;饮片
6 云南富民 黄褐色 ,有皱纹;饮片
7 云南玉溪 黄褐色 ,有皱纹;饮片
8 YC09-61(天紫红药业提供) 黄褐色 ,有皱纹;饮片
表 2 黄芩样品来源
Tab 2 Origins of Scute llaria baicalensis Georgi samples
编号 批号或产地 药材性状
1 YC03-59 棕黄色 ,有稀疏的疣状细根痕;饮片
2 YC200403104 棕黄色 ,有稀疏的疣状细根痕;饮片
3 YC20040482 棕黄色 ,有稀释的疣状细根痕;饮片
4 YC20040289 棕黄色 ,有稀疏的疣状细根痕;饮片
5 YC11-21 棕黄色 ,有稀疏的疣状细根痕;饮片
6 YP20051101 棕黄色 ,有稀疏的疣状细根痕;饮片
7 YP20060101 棕黄色 ,有稀疏的疣状细根痕;饮片
8 甘肃黄芩 棕黄色 ,有稀疏的疣状细根痕;饮片
2 试验部分
2.1 色谱条件与系统适应性试验
色谱柱:Zorbax SB-C 18(250mm ×4.6mm , 5μm);柱温:
30℃;流动相:1%甲酸乙腈溶液(A)-1%甲酸水溶液(B),线
性梯度洗脱 (详见表 3);流速:1.0mL ·min -1;检测波长:
274nm ;进样量:10μL 。黄芩苷和黄芩素对照品的平均理论塔板
数分别为 120 364 、110 021。
表 3 流动相梯度洗脱安排
Tab 3 Mobile phase in a gradient mode
时间/min 流动相A/ % 流动相B/ %
0～ 15 15 85
15～ 55 15～ 30 85～ 70
55～ 85 30～ 85 70～ 15
85～ 100 85 15
2.2 溶液的制备
2.2.1 供试品溶液的制备:精密称取药材粉末 0.5g , 加入
50mL70%乙醇 , 置于 100mL 圆底烧瓶中 , 回流 3h , 放冷 , 过
滤 ,置于 100mL容量瓶中 ,用少量的 70%乙醇反复洗涤瓶壁和
残渣 ,合并滤液 ,定容至刻度 ,取 1mL滤液 ,置于 10mL容量瓶
中 ,用甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,过 0.45μm微孔滤膜 ,即得 。
2.2.2 对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷 、黄芩素对照品
适量 , 分别用甲醇配制成含黄芩苷 0.102mg ·mL -1 、黄芩素
0.72mg ·mL -1的对照品溶液 。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验:取黄芩苷对照品溶液 , 连续进样 6次 , 记
录黄芩苷的保留时间和峰面积积分值 。结果 , 黄芩苷的保留时
间和峰面积的 RSD 分别为 0.07%和 1.97%,表明仪器精密度
良好 ,分析结果稳定 、可信 。
2.3.2 重现性试验:取滇黄芩 1号根粉末 6份 , 精密称定 , 按
照“ 2.2.1”项下方法制备供试品溶液 ,分别进样 ,记录色谱图 。
结果 , 黄芩苷相对保留时间和相对峰面积的 RSD 分别为
0.09%和 2.91%;其它 15个共有峰的相对保留时间的 R SD
为 0.01%～ 0.19%,相对峰面积的 RSD 为 0.25%～ 4.95%。
2.3.3 滇黄芩指纹图谱的稳定性试验:取滇黄芩 1号的供试
品溶液 ,分别在 0 、6 、12 、24 、36、48h进样 。结果 , 48h内黄芩苷
相对峰面积的 RSD =2.04%;其它 15个共有峰相对峰面积的
RSD 为 1.38%～ 4.98%,表明供试品溶液在 48h内稳定 。
3 指纹图谱分析及各项技术参数测定
3.1 共有峰的确定
滇黄芩与黄芩对照药材的 HPLC指纹图谱见图 1。
由图 1可知 , 1 ～ 11号及 S1 、S 2(其中 S 1为黄芩苷 , S 2为黄
芩素)共 13个峰在黄芩与滇黄芩药材中 , 均在相同的相对保留
时间处出现 , 因而标定这 13个峰为滇黄芩与黄芩的共有指纹
峰;Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ和 Ⅰ′、Ⅱ′、Ⅲ′分别为滇黄芩与黄芩的特有峰 。在
相对保留时间 33 ～ 35min范围内 , 即在 4号峰与 5号峰之间 ,
滇黄芩指纹图谱有明显的 2个色谱峰 Ⅰ和Ⅱ , 且Ⅱ含量不低 ,
占总峰面积的 10%左右 , 而 Ⅰ的峰面积占总峰面积的 2%左
右;但对于黄芩药材的指纹图谱来说 ,在此时间区域内 ,并无明
显的色谱峰出现 。在内标黄芩苷出峰后至 55min之间所出的指
纹峰 ,在峰面积上 ,滇黄芩与黄芩药材都有着明显的区别 。
3.2 相似度的计算
3.2.1 滇黄芩指纹图谱的相似度计算:8个产地滇黄芩指纹
图谱的叠加详见图 2。其中 , S1 ～ S 8分别为滇黄芩 1 ～ 8号的指
纹图谱;R为对照图谱 。由图 2可知 ,1 ～ 16号峰在 8批样品中
都在相同的相对保留时间处有峰出现 , 其指纹峰面积之和占总
峰面积大于 90%,因而标定此 16个峰为共有指纹峰 。
以图 2中的 S1号指纹图谱为参照指纹图谱 , 8批样品指纹
图谱的平均值为对照指纹图谱模板(图中的 R),根据峰匹配的
结果 , 将待测指纹图谱中所有峰的峰面积积分值与对照模板的
峰面积积分值进行整体相似性计算 。结果 , 8个产地滇黄芩的
相似度分别为:0.994 、 0.970 、 0.994 、 0.956 、 0.979 、 0.996 、
0.995 、0.992 ,平均相似度为 0.976 。
3.2.2 黄芩指纹图谱相似度的计算:8个产地黄芩指纹图谱
的叠加详见图 3。其中 , S1 ～ S 8分别为黄芩 1 ～ 8号的指纹图
谱 。以 S 1为参照指纹图谱 , 8批样品指纹图谱的平均值为对照
指纹图谱模板 , 根据峰匹配的结果 , 将待测指纹图谱中所有峰
的峰面积积分值与对照模板的峰面积积分值进行整体相似性
计算 。结果 , 8个产地黄芩与对照指纹图谱的相似度分别为 :
图 1 对照药材的HPLC指纹图谱
A.滇黄芩;B.黄芩
Fig 1 HPLC fingerprints of control articles
A.Scu tellar ia amoena CH Wright;B.Scutel lar ia baicalensis Geor-
gi
中国药房 2007年第 18卷第 33期 China Pharmacy 2007 Vol.18 No.33 · 2593·
表 4 指纹图谱分析结果
Tab 4 Fingerprint ing result s
滇黄芩 黄芩峰号 相对保留时间相对峰面积比峰号 相对保留时间相对峰面积比
1 0.336 8 0.028 6 1 0.334 3 0.021 1
2 0.458 6 0.122 3 2 0.449 4 0.071 1
3 0.567 3 0.081 5 3 0.559 6 0.051 6
4 0.614 8 0.033 1 4 0.605 4 0.007 4
Ⅰ 0.842 5 0.022 5 Ⅰ′ 0.918 7 0.014 1
Ⅱ 0.864 5 0.298 1 5 0.977 9 0.018 1
5 0.979 0 0.060 2 S 1 1.000 0 1.000 0
S 1 1.000 0 1.000 0 6 1.106 8 0.018 5
6 1.101 6 0.059 0 7 1.154 6 0.073 3
7 1.148 6 0.122 6 Ⅱ′ 1.192 0 0.023 6
8 1.238 7 0.600 0 8 1.245 3 0.130 0
9 1.335 8 0.335 8 Ⅲ′ 1.268 9 0.012 8
Ⅲ 1.629 2 0.071 9 9 1.344 9 0.434 0
10 1.793 1 0.084 1 10 1.796 1 0.068 5
11 2.091 6 0.010 7 11 1.581 2 0.018 0
S 2 2.173 1 0.043 1 S 2 2.200 5 0.030 1
0.998 、0.999 、0.999 、0.999 、0.998 、0.998 、0.970 、0.988 ,平均
相似度为 0.994。
3.2.3 滇黄芩与黄芩指纹图谱相似度的计算:用中药色谱指
纹图谱相似度评价系统以 8批滇黄芩生成的对照指纹图谱作
为参照 , 计算不同产地黄芩指纹图谱所生成的对照指纹图谱的
相似度 。结果 ,黄芩与滇黄芩的相似度为 0.859。
3.2.4 分析 。由上可以看出 , 滇黄芩之间的平均相似度为
0.976 , 具有明显的相似性;黄芩之间的平均相似度为 0.994 ,
具有明显的相似性 。但是 , 同属植物黄芩与滇黄芩的相似度却
为 0.859 ,小于 0.9 ,它们之间存在明显的差异 。8批滇黄芩与 8
批黄芩的相对保留时间的 RSD 均小于 2%;而相对峰面积由
于产地不同 , 各成分的含量存在较大差异:滇黄芩中共有峰和
特有峰的相对峰面积的 RSD 在 9.74%～ 44.77%之间 , 黄芩
中共有峰和特有峰的相对峰面积的 RSD 在 3.98%～ 70.69%
之间 。指纹图谱分析结果详见表 4。
4 讨论
试验中曾比较等度洗脱和各种梯度洗脱对指纹图谱的影
响 。结果发现 ,等度洗脱时 ,无论改变流动相的组成或比例 ,色
谱峰均不能达到好的分离;改用梯度洗脱后 , 样品中不同极性
组分均获得了较好的分离 。通过调整梯度洗脱的条件 , 使样品
中的组分尽可能地被洗脱出来 , 并达到较好的基线分离 , 最后
确定了表 3中的洗脱条件 。结果 , 90min内各组分基本全部出
峰 , 16个共有峰均达到了较好的基线分离 。
经紫外光谱扫描 , 黄芩苷和黄芩素在 274nm 左右波长处
均有最大吸收 , 经过对样品的 HPLC 图谱进行对比 , 并考察了
210 、240 、274nm 波长对色谱图的影响 , 最后选定 274nm为检
测波长 。
根据相似度的计算可以看出 , 各产地的滇黄芩药材指纹图
谱中主要峰群的整体图貌基本一致 , 但各成分含量的相对比值
有较大的差别 , 滇黄芩之间的平均相似度为 0.976 , 具有明显
的相似性;黄芩之间的平均相似度为 0.994 , 亦具有明显的相
似性;甘肃黄芩与正品黄芩的相似度为 0.970 , 有明显的相似
性 , 故在计算的过程中把它归为正品黄芩来计算。但是同属植
物黄芩与滇黄芩的相似度却为 0.859 , 滇黄芩中的 3个特有峰
占到了总峰面积的 10%以上 , 由于相似度小于 0.90 ,可判断黄
芩与滇黄芩之间存在明显的差异 。另外 ,在黄芩的共有峰中 ,6 、
7 、8 、9号峰的峰面积呈梯度上升 , 9号峰为这 4个峰中峰面积
最大的峰;而滇黄芩的 6 、7 、8 、9号共有峰中 , 8号峰为峰面积
最大的峰 。可见 , 根据相似度的计算 、共有峰和特有峰的确定 ,
可较简单地鉴别黄芩与滇黄芩 。
鉴于中药中所含成分的复杂性 , 且每一种中药的成分还会
因产地 、品种、采摘季节 、气候条件 、炮制等多种因素的影响而
不同 , 故将 HPLC分离分析技术与计算机解析技术结合起来 ,
判定样品之间或样品与对照品指纹图谱的相似程度 , 通过不同
的特征峰来标示中药的化学成分及含量分布情况 , 从而全面控
制药材的质量 ,对《中药材生产质量管理规范》(GAP)种植提供
依据 。
参考文献
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(收稿日期:2006-11-15 修回日期:2007-05-12)
图 2 8个产地滇黄芩指纹图谱的叠加
Fig 2 HPLC fingerprints of Scutellaria amoena CH
Wright from 8 product ion areas
图 3 8个产地黄芩指纹图谱的叠加
Fig 3 HPLC fingerprints of Scutel laria baicalensis
Georgi from 8 production areas