全 文 ：理化检验-化学分册　　　　　PTCA (PA RT B:CHEM.ANAL.)　　　　　2010年　第 46卷　　1
工作简报
山蜡梅叶颗粒的高效液相色谱指纹图谱定性
及定量分析
欧阳婷 , 麦　曦＊
(南昌大学 医学院药学系 , 南昌 330006)
摘　要:应用高效液相色谱法建立可同时对山蜡梅叶颗粒进行鉴别和有效成分含量测定的色谱
指纹图谱。以 Cosmosil C18色谱柱为分离柱 ,甲醇与甲酸混合溶液进行梯度洗脱 ,检测波长为
365 nm 。成分芦丁 、槲皮素和山奈素的质量浓度均与峰面积呈线性关系 ,线性范围分别为4.6 ～
110.4 ,1.0 ～ 24.0 , 1.5 ～ 36.0 mg ·L -1 。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004 版进行分
析 ,20批样品平均相似度为 95%以上。颗粒剂中三个成分的含量分别为芦丁含量(130±20)μg ·
g
-1 ,槲皮素含量(35±10)μg ·g-1 ,山奈素含量(60±10)μg · g-1 。建立的山蜡梅叶颗粒的色谱
指纹图谱 ,为质量控制提供新方法 。
关键词:山蜡梅叶颗粒;高效液相色谱法;色谱指纹图谱;定性与定量分析
中图分类号:O652.63　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-4020(2010)01-0054-03
Qualitative and Quantitative Analysis of Shanlameiye
Granules by HPLC Fingerprint Atlas
OUYANG Ting , MAI Xi＊
(Department of P harmacy , Med ical College , Nanchang University , Nanchang 330006 , China)
Abstract:HPLC was applied to the establishment o f chromatog raphic fing er print atlas for qualitativ e and
quantitative analy sis of the “ Shanlameiye” g r anules for its efficacious components.The Cosmosil C18 co lumn w as
used fo r the separation and solutions of methano l and dil.fo rmic acid mixed in different propo r tions w ere used in the
gr adient elution.Three components (i.e., rutin , quercetin and kaempfer ol) in the g ranules were found and
determined at the w aveleng th o f 365 nm with UV-detec to r.Linear r elationships betw een value s of peak ar ea and
mass concentration w ere found in the r anges of 4.6 -110.4 mg · L-1(for rutin), 1.0 -24.0 mg · L-1(for
que rcetin)and 1.5-36.0 mg · L-1(fo r kaempfer ol).Values o f av erage similarity of samples f rom 20 batche s as
analyzed by the estimation sy stem fo r similarity of TCM′s by chroma to g raphic finge r print atlas , (2004 Edition)
were found to be ove r 95%.Contents of the 3 components w ere found to be 130±20 , 35±10 and 60±10 μg · g-1
respectiv ely.The chromatog raphic fing erprint atlas established w as found to be feasible fo r quality contro l in the
production of “Shanlameiy e” g ranules.
Keywords:Shanlameiy e g ranules;H PLC;Fingerprint a tlas;Qualitative and quantitative analy sis
　　高效液相色谱(HPLC)指纹图谱在中药制剂的
质量控制及质量评价中有着广泛的应用 ,是中药现
收稿日期:2009-05-07
基金项目:江西省自然科学基金课题(2007GZY1101)
作者简介:欧阳婷(1981-),女 ,江西赣州人 ,硕士研究生 ,研究
　方向为药物分析。
＊联系人
代化的一个重要组成部分。山蜡梅叶颗粒以山蜡梅
叶为原料 ,具有辛凉解表 、清热解毒的功能 ,用于风
热感冒 、发热 、恶寒和咽痛等症状[ 1] 。现文献报道中
仅对山蜡梅叶颗粒的两个有效成分槲皮素和山奈素
进行含量测定[ 2] 。为了全面地进行质量控制 ,并对
生产工艺进行实时监控 ,更有效地提高方法的技术
内涵 ,本工作建立了稳定 、可靠的山蜡梅叶颗粒
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理化检验-化学分册 欧阳婷等:山蜡梅叶颗粒的高效液相色谱指纹图谱定性及定量分析
HPLC指纹图谱 ,同时对山蜡梅叶颗粒的有效成分
进行鉴别和含量测定 ,可以作为生产质量控制的有
效检测方法。
1　试验部分
1.1　仪器与试剂
Shimadzu LC-10A TVP 高效液相色谱仪 ,配紫
外(UV)检测器和 CLASS-VP 色谱工作站;单通道
可调移液器;旋转蒸发仪 。
对照品混合溶液:取芦丁(质量分数 90.5%)、
槲皮素(质量分数 97.3%)、山奈素(质量分数
95.9%)3种对照品各 9.2 , 2.0 ,3.0 mg ,分别置于
3个 25 mL 棕色容量瓶中 ,用甲醇溶解并稀释至刻
度 ,作为储备溶液 。临用前分别移取 1 mL ,置于
10 mL容量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,即得芦
丁 、槲皮素和山奈素质量浓度分别为 36.8 , 8.0 ,
12.0 mg ·L-1的对照品混合溶液。
甲醇为色谱纯 ,乙酸乙酯和甲酸为分析纯 ,水为
二次重蒸水。
1.2　色谱条件
Cosmosil C18 色谱柱(4.6 mm ×250 mm ,
5μm);流动相:A为甲醇 , B为甲酸(0.5+99.5)溶
液 ,梯度洗脱:0 ～ 10 min ,25%A 升至 30%A;10 ～
30 min , 30% A 升至 40% A;30 ～ 40 min , 40% A
升至 50% A;40 ～ 60 min , 50% A 升至 60% A ,
60 ～ 70 min , 60% A 降至 40% A;流量 1 mL ·
min-1 ;检测波长为 365 nm;柱温为 25 ℃;进样量
10 μL。
1.3　试验方法
将山蜡梅叶颗粒研细 ,称取 2.000 0 g ,加甲醇
50 mL ,浸泡 1 h 后 ,回流 1 h后 ,过滤 ,挥干甲醇 ,加
水 30 mL 使残渣溶解后 ,每次用乙酸乙酯 30 mL 萃
取 ,萃取 3次 ,挥干乙酸乙酯 ,用甲醇(50+50)溶液
溶解并移至 10 mL 容量瓶中 ,稀释至刻度 ,摇匀 ,用
0.45 μm 微孔滤膜滤过 ,取续滤液 ,在色谱条件下进
行分离测定。
2　结果与讨论
2.1　试验条件的优化
2.1.1　提取时间和提取溶剂
分别采用超声提取 、索氏提取和加热回流提取
处理样品 ,结果表明:加热回流提取样品色谱图化学
成分信息量最大 、分离度最高 。将样品用甲醇浸渍
1 h后再回流 1h ,可将样品中的化学成分充分提取
出来 。
采用不同比例的甲醇 、乙酸乙酯和氯仿都不能
得到较多化学成分信息的色谱图 ,而采用甲醇和乙
酸乙酯依次提取和纯化能将多种成分提取出来 ,较
为完整地反映出样品的指纹特征 。
2.1.2　流动相和检测波长
试验分别采用甲醇-水 、甲醇-甲酸(0.5+99.5)
溶液和乙腈-甲酸(0.5+99.5)溶液 3组流动相系统
进行试验 ,结果表明:以甲醇-水为流动相 ,各组分分
离不理想 ,以甲醇-甲酸(0.5+99.5)溶液和乙腈-甲
酸(0.5+99.5)溶液为流动相 ,各组分均可基线分
离 ,因甲醇价廉 ,选择甲醇-甲酸(0.5+99.5)溶液为
流动相。
试验分别以 285 ,305 , 325 ,345 , 365 , 385 nm 为
检测波长进行测定 ,结果表明:在波长 365 nm 处出
现的色谱峰最多 、峰形较好 、分离度高 ,且基线平稳 ,
选择 365 nm 作为山蜡梅叶颗粒中各组分的检测
波长 。
2.1.3　检测时间
延长测试时间至 2 h , 70 min 后未出现滞后峰 ,
将检测时间定为 70 min 。
2.2　色谱行为
将对照品混合溶液和供试品溶液 ,按色谱条件
进样分析 ,得 HPLC 指纹图谱 ,见图 1。其中对照品
图谱中的 1 ,2 , 3号峰分别是芦丁 、槲皮素和山奈素 ,
结合 3种对照品溶液进行定性 ,样品中 4 , 8 , 9号峰
分别为芦丁 、槲皮素和山奈素。
图 1　对照品混合溶液(a)与山蜡梅叶颗粒样品溶液(b)的色谱图
Fig.1　Ch romatogram s of mixed solution of reference
sub stan ces(a)and sample s olution of shanlameiye g ranu les(b)
2.3　指纹图谱的建立
运用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱
相似度评价系统 2004A 版 ,对山蜡梅颗粒叶样品进
行了指纹图谱相似度分析和匹配分析研究 ,归纳出
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理化检验-化学分册 欧阳婷等:山蜡梅叶颗粒的高效液相色谱指纹图谱定性及定量分析
20批样品的 HPLC 指纹图谱具有 9个共有的特征
指纹峰 ,如图 2所示 。所生成的对照谱如图 3所示 。
图 2　20批山蜡梅叶颗粒 HPLC指纹图谱共有模式
Fig.2　Common pattern of th e ch rom atographic finger print at las
of samples of “ Shanlameiye” granules from 20 batches
图 3　山蜡梅叶颗粒对照色谱指纹图谱
Fig.3　Reference fingerp rin t at las of shanlam eiye g ranules
2.4　标准曲线
移取适量的对照品溶液于 10 mL 容量瓶中 ,用
甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,配成系列标准溶液。在色谱
条件下对系列标准溶液平行测定 3次。以对照品溶
液的质量浓度为横坐标 ,峰面积的平均值为纵坐标 ,
分别绘制芦丁 、槲皮素和山奈素的标准曲线 ,并计算
线性回归方 程 , 芦丁的线性 范围为 4.60 ～
110.40 mg ·L-1 ,线性回归方程为 y =19.99 x -
4 166.50(r =0.999 7);槲皮素的线性范围为
1.00 ～ 24.00 mg ·L-1 ,线性回归方 y =40.01 x -
4 091.50(r =0.999 7);山奈素的线性范围为
1.50 ～ 36.00 mg · L -1 , 线性回归方程为 y =
39.97 x-17 798.00(r=0.999 4)。
2.5　精密度 、稳定性和重复性
取样品粉末 2.000 0 g ,按试验方法进行提取 ,
在色谱条件下连续进样6次 ,记录色谱图 。对所得
的色谱峰进行了相对保留时间和相对峰面积精密度
考察 ,经分析相对保留时间的相对标准偏差均小于
1%,相对峰面积的相对标准偏差均小于 3%,表明
精密度良好。
取样品粉末 2.0000g ,按试验方法进行提取 ,分
别于 0 ,2 , 4 ,8 , 12 ,24h 进样 ,记录色谱图 ,经分析色
谱峰相对保留时间的相对标准偏差均小于 1%,相
对峰面积的相对标准偏差均小于 3%,表明稳定性
良好 。取 6份样品粉末各 2.000 0 g ,按试验方法进
行分离测定 ,经分析色谱峰相对保留时间相对标准
偏差均小于 1%,相对峰面积相对标准偏差均小于
3%,表明重复性良好。
2.6　样品分析
取山蜡梅叶颗粒剂 20 批 ,按试验方法进行测
定 ,结果表明:20 批颗粒剂的芦丁质量分数为
(130±20)μg · g -1 , 槲皮素质量分数为(35 ±
10)μg ·g-1 ,山奈素质量分数为(60 ±10)μg ·
g
-1 。
取已知含量的同一批样品 9份 ,分成 3组 ,每组
3 份 , 每份 样品 称取 1.000 0 g , 分 别加 入
368.0 mg ·L -1芦丁对照品溶液 、80.0 mg ·L-1槲
皮素对照品溶液 、120.0 mg ·L-1山奈素对照品溶
液各 0.8 mL ,挥干溶剂 ,按试验方法进行测定 ,结果
表明:3种物质的回收率均大于 98.0%。
2.7　相似度的计算结果
运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A
版对 20批山蜡梅叶颗粒样品的指纹图谱进行相似
度分析 ,以批号为 0707008的样品图谱为参照谱 ,采
用均值数法生成 20批山蜡梅颗粒的对照指纹图谱 ,
相似度评价结果均大于 95%,表明样品生产厂家工
艺稳定 ,样品相似程度高[ 3] 。
参考文献:
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[ S] .
[ 2] 　刘耀明 , 冯淑香 , 肖炳坤.山蜡梅颗粒的质量标准研究
[ J] .中药新药与临床药理 , 2003 , 5(14):185-188.
[ 3] 　国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究的技
术要求(暂行)[ J] .中成药 , 2000 , 10(22):671-675.
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