全 文 ：收稿日期:2015-07-14
基金项目:“2012年中医药行业科研专项项目实施方案———甘肃省代表性区域中药资源保护利用”(201207002-02);“2012 年中医药部门公共卫
生专项———甘肃省 2012年国家基本药物所需中药原料资源调查和监测项目”天祝藏族自治县中药资源普查(2013GSZYZYPC-15)。
作者简介:管国倩(1991-),女,在读硕士研究生。 研究方向:天然药用植物研究。
通信作者:李建银(1976-),男,讲师,理学硕士。 研究方向:中、藏药及其复方物质基础研究。 E-mail:lijy@ lzu. edu. cn
藏药灌木亚菊质量标准研究
管国倩,王　 云,刘亚婷,杨　 颖,马志刚,李建银
(兰州大学药学院,甘肃　 兰州　 730000)
摘要:目的　 初探灌木亚菊的质量标准,为其资源的开发利用提供科学依据。 方法　 参照标准测定灌木
亚菊干燥失重、灰分、水溶性浸出物、95%乙醇浸出物,并建立了薄层色谱(TLC)鉴定方法以及测定灌木亚菊
中特有成分 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃含量的高效液相色谱(HPLC)法。 结果　 灌
木亚菊的干燥失重均值为 4. 51% ,水溶性浸出物均值为 12. 55% ,95%乙醇浸出物均值为 6. 60% ,总灰分均
值为 11. 33% ,酸不溶性灰分均值为 4. 65% ;HPLC法测定的结果表明 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,
5]十三-烯烃在 0. 047 ~ 0. 750 g / L范围内呈良好的线性关系,并且具有良好的重现性,可用于灌木亚菊中
2β-(2,4 -己二炔酮) -l,6 -二螺环[4,5]十三-烯烃的含量测定,其平均含量为 0. 360 6 mg / g,RSD 为
0. 63% 。 结论　 该标准可用于灌木亚菊的质量控制。
关键词:灌木亚菊;高效液相色谱;薄层色谱;质量标准
中图分类号:R284. 2　 文献标志码:B　 文章编号:1003-8450(2016)02-0055-04
DOI:10. 16841 / j. issn1003-8450. 2016. 02. 19
　 　 灌木亚菊[Ajania fruticulosa (Ledeb. ) Poljak. ]
为菊科亚菊属植物,生于荒坡及荒漠草原,于甘肃、
内蒙古、青海、新疆等地分布广泛、蕴藏丰富。 灌木
亚菊具有清肺热、止咳、清热解毒等功效,用于治疗
肺热咳嗽、惊风、风湿麻木、阑尾炎等[1]。 灌木亚菊
作为藏药,在民间使用广泛,且在甘肃的蕴藏量丰
富,迄今为止未见灌木亚菊含量测定的相关报道,药
典中无记载,也无地方规定等资料参考。 为充分利
用该物种资源,依据药典标准测定了灌木亚菊中的
干燥失重、灰分、水溶性浸出物、95%乙醇浸出物的
相关指数,并建立了检测灌木亚菊化合物单体 2β-
(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃含量
的高效液相色谱(HPLC)法[2],建立了较完整的灌
木亚菊的质量控制标准。
1　 材料与试药
1. 1　 仪器
电热板(常州国华仪器有限公司),Diamonsil -
C18 反相色谱柱(250 mm×4. 6 mm,5 μm),e2695 -
2998 型高效液相色谱仪(美国 WATERS 公司),烘
箱(上海科恒仪器有限公司), 1 / 105 分析天平
(OHAUS)。
1. 2　 试药
乙醇,分析纯,批号 20130813,规格 500 mL,天
津百世化工公司;氯仿,分析纯,批号 20140813,规
格 500 mL,天津百世化工公司;乙腈,色谱纯,批号
2013110503,规格 500 mL,山东禹王实业有限公司
化工分公司;甲醇,色谱纯,批号 20120722271,规格
500 mL,山东禹王实业有限公司化工分公司;对照
品,由实验室分离得到,经鉴定确定为 2β-(2,4-己
二炔酮) -l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃(纯度 98%
以上) [3]。 灌木亚菊 [ Ajania fruticulosa ( Ledeb. )
Poljak. ]于 2014 年采自甘肃天祝藏族自治县,由兰
州大学药学院生药研究所马志刚教授鉴定。
2　 方法[4-9]与结果
2. 1　 水分
按照标准规定,取灌木亚菊全草约 3 g,置于已
恒重的称量瓶中,在 105 ℃烘箱中干燥 5 h,冷却
0. 5 h,精密测定质量,再于 105 ℃干燥 1 h,冷却。
依据减失量得到灌木亚菊中的含水量均值为
4. 51% (n=6),RSD值为 5% 。
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2. 2　 灰分
2. 2. 1　 总灰分　 按照 2015 版《药典》规定,灼烧陶
瓷坩埚至恒定质量,取 4 g 灌木亚菊全草粉末置于
坩埚中,称定质量,投放于 600 ℃的马弗炉中进行完
全灰化处理,依据残渣量得到灌木亚菊中的总灰分
含量均值为 11. 33% (n=6),RSD值为 5. 14% 。
2. 2. 2　 酸不溶性灰分　 按照 2015 版《药典》规定,
取已完全灰化的总灰分置于坩埚中,加入稀盐酸,水
浴加热,表面皿覆盖于坩埚上,以防灰分溅出,加热,
水洗涤,无灰滤纸滤过,洗涤至无氯化物反应。 酸化
后的残渣与滤纸置于陶瓷坩埚中,放入马弗炉中灼
烧至恒重,依据所剩残渣量得到灌木亚菊中酸不溶
性灰分的含量均值为 4. 65% ( n = 6),RSD 值为
8. 61% 。
2. 3　 浸出物
2. 3. 1　 水溶性浸出物　 依照 2015 版《药典》,取灌
木亚菊粉末 3 g,加水后静置 1 h,加热至沸腾,保持
微沸 1 h。 放冷后,补足减失的重量,滤过。 将滤液
置于已恒重的容器,于 105 ℃烘箱中干燥 3 h,取出
冷却 30 min,依据测定的浸膏质量得到灌木亚菊中
水溶性浸出物的含量为 12. 55% ,RSD值为 2. 32% 。
2. 3. 2　 95%乙醇溶性浸出物(热浸法) 　 与上述方
法一致,溶剂改为 95%乙醇。 测得的 95%醇溶性浸
出物均值为 6. 60% ,RSD值为 2. 71% 。
2. 4　 化学成分
2. 4. 1　 供试品溶液的制备　 精密称取灌木亚菊全
草粉末 4. 011 3 g,加氯仿 80 mL 超声提取 3 次,每
次 20 min,滤过,减压回收氯仿,残渣加色谱甲醇定
容至 5 mL容量瓶中,经 0. 22 μm微孔滤膜过滤,得
供试品溶液。
2. 4. 2　 对照品溶液的制备　 精密称取对照品 2β-
(2,4 -己二炔酮) - l,6 -二螺环[4,5]十三-烯烃
0. 037 g,色谱甲醇溶解并定容至 5 mL 的容量瓶中,
经 0. 22 μm有机滤膜过滤,得质量浓度为 0. 75 g / L
的对照品溶液。
2. 4. 3　 薄层色谱(TLC)法鉴别　 用微量吸样器吸
取少量灌木亚菊氯仿提取液与 2β-(2,4 -己二炔
酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃溶液,在 G254 荧
光薄层硅胶板上分别点样,以石油醚(60 ~ 90 ℃沸
程) -丙酮 (10 ∶ 1 )展开后,取出,晾干,紫外灯
254 nm下显紫红色荧光,10%硫酸乙醇显色,供试
品在与 2β-(2,4-己二炔酮) -l,6-二螺环[4,5]十
三-烯烃对照品相应的位置上显相同的棕色斑
点[3,6]。 见图 1。
1,供试品;2,对照品 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-
二螺环[4,5]十三-烯烃;3,供试品+对照品;
A,荧光下 TLC;B,硫酸乙醇显色后的 TLC
图 1　 灌木亚菊 TLC图
2. 5　 含量测定
2. 5. 1 　 色谱条件 　 Diamonsil - C18 反相色谱柱
(250 mm × 4. 6 mm,5 μm), 流动相为乙腈-水,梯
度洗脱 (见表 1 ),流速 1. 0 mL / min,检测波长
311 nm,柱温 30 ℃。
表 1　 梯度洗脱条件
时间 / min 乙腈 / % 水 / %
0 35 75
5 40 60
20 60 40
30 60 40
60 100 0
2. 5. 2　 溶液制备　 1)对照品溶液的制备。 称取自
制的 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-
烯烃单体 0. 037 g,甲醇定容,过滤得质量浓度为
0. 75 g / L对照品溶液,进样 20 μL。 按“2. 5. 1”项下
色谱条件测定。 见图 2。
2)供试品溶液的制备[4]。 精密称取灌木亚菊
全草粉末 4. 011 3 g,加氯仿 80 mL 超声提取 3 次,
每次 20 min,滤过,减压回收氯仿,残渣加色谱甲醇
定容至 5 mL容量瓶中,经 0. 22 μm 微孔滤膜过滤,
取已滤过的溶液(5. 48 mg / mL)1 mL,稀释 2 倍,得
供试品溶液(2. 74 mg / mL)。 进样 20 μL,按“2. 5.
1”项下色谱条件测定。 见图 3。
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图 2　 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃对照品 HPLC图
图 3　 灌木亚菊 HPLC图
2. 5. 3　 线性关系考察　 取以上对照品溶液,分别稀
释 0,1,2,4,8,16 倍,进样 20 μL,以进样质量浓度
为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)得回归方程:Y=
668 314X-310. 63 ( r=0. 999 5)。 表明 2β-(2,4-己
二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃在 0. 047 ~
0. 750 g / L质量浓度范围内呈良好的线性关系。
2. 5. 4　 精密度试验　 取对照品溶液按“2. 5. 1”项下
色谱条件连续进样 5 次,通过峰面积计算 RSD 值。
结果其 RSD值为 0. 98%,表明仪器精密度良好。
2. 5. 5　 稳定性试验　 取灌木亚菊全草提取液在 0,
4,6,8,24 h 分别进样,按“2. 5. 1”项下色谱条件,得
峰面积的 RSD值为 0. 60% ,表明灌木亚菊全草提取
液在 24 h内稳定性良好。
2. 5. 6　 加样回收率试验　 在已知含量的灌木亚菊
样品 (0. 144 8 mg / mL)中分别加入 80% ,100% ,
120%量的 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]
十三-烯烃(0. 046 88 mg / mL)。 80%量:取 5 mL样
品溶液加入 0. 8 mL 对照品溶液,定容至 10 mL。
100%量:取 5 mL 样品溶液加入 1 mL 对照品溶液,
定容至 10 mL。 120% 量:取 5 mL 样品溶液加入
1. 2 mL对照品溶液,定容至 10 mL。 分别连续测定
3 次,进样量为 20 μL,通过峰面积计算得 2β-(2,4-
己二炔酮) -l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃的平均回
收率为 99. 64% ,RSD值为 1. 74% 。 见表 2。
表 2　 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃加样回收结果
百分率 对照品加入量 / μg 理论测得量 / μg 实际测得量 / μg 回收率 / % 平均回收率 / % RSD / %
80% 0. 075 2 1. 563 0 1. 577 0 100. 90
0. 075 2 1. 563 0 1. 572 0 100. 55
0. 075 2 1. 563 0 1. 523 0 97. 42
100% 0. 093 8 1. 582 0 1. 584 0 100. 12
0. 093 8 1. 582 0 1. 575 0 99. 53 99. 64 1. 74
0. 093 8 1. 582 0 1. 525 0 96. 42
120% 0. 112 6 1. 600 6 1. 624 0 101. 44
0. 112 6 1. 600 6 1. 592 0 99. 49
0. 112 6 1. 600 6 1. 615 0 100. 92
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2. 5. 7　 灌木亚菊含量测定　 取同批灌木亚菊 5 份,
依照“2. 5. 1”项下方法测定得到峰面积,得到样品中
的 2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯
烃的平均含量为 0. 360 6 mg / g,RSD值为 0. 63%,该
方法测得的灌木亚菊含量稳定、简便、可信。
3　 讨论
3. 1　 色谱条件的探索
以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0. 05%乙酸为流动
相分别梯度洗脱,观察对照品出峰时间以及与其他
峰分离情况,最终选定以乙腈-水为流动相。
3. 2　 溶剂选择
以甲醇、95%乙醇、水、氯仿为溶剂提取得到的
灌木亚菊提取液,经测定,95%乙醇、甲醇提取未能
将样品的峰与其他峰很好地分离开,而氯仿提取的
样品能得到很好的分离,因此选用氯仿为提取溶剂。
4　 结论
2β-(2,4-己二炔酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-
烯烃在灌木亚菊中含量高,且该炔类成分是亚菊属
植物的特有成分[10],故选其为对照品。 以 HPLC 法
测定含量时,通过尝试不同提取方法、不同的流动相
比例、不同的流速、不同比例的梯度洗脱,得到的最
佳提取测定方法为:样品经氯仿提取,在乙腈-水梯
度洗脱条件下,对照品所对应的色谱峰能与其他杂
质峰明显分离。 通过方法学验证,表明此方法较稳
定,重现性好,可用于灌木亚菊中 2β-(2,4-己二炔
酮)-l,6-二螺环[4,5]十三-烯烃的含量测定。 本
文系统地研究了灌木亚菊的质量标准,为灌木亚菊
的质量控制提供了依据。
参考文献:
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[编辑:徐　 燕]
Study on the quality standard of Ajania fruticulosa
GUAN Guoqian,WANG Yun,LIU Yating,YANG Yin,MA Zhigang,LI Jianyin
(Pharmacy College of Lanzhou University,Lanzhou,Gansu,730000,China)
Abstract: Objective　 To establish the quality standard of Ajania fruticulosa and provide scientific basis for
the exploitation of this Tibetan medicine. Methods　 By consulting the standard of Chinese Pharmacopoeia,TLC
was applied to identify the drying shrinkage,ash content,water soluble extract,95% alcohol extract of Ajania fru-
ticulosa. HPLC was used to determine the effective elements of 2β-(2’,4’ -hexadiynoyl) -1,6-dioxaspiro[4,5]
deca-3-ene in Ajania fruticulosa. Results　 The mean values of drying shrinkage,water soluble extract,95% alcohol
extract,total ash and acid-insoluble ash were 4. 51% ,12. 55% ,6. 60% ,11. 33% and 4. 65% respectively. The
effective elements of 2β-(2’,4’ -hexadiynoyl) -1,6-dioxaspiro[4,5]deca-3-ene were in good line with the range of
0. 047 ~ 0. 750 g / L and had a good reproducibility. The average content of them was 0. 360 6 mg / g and RSD was
0. 63% . Conclusion　 The standard can be used for the quality control and evaluation of Ajania fruticulosa.
Key words: Ajania fruticulosa;HPLC;TLC;quality standard
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