全 文 ：为是肝细胞损伤最敏感指标，但其升高幅度与肝病严重程度不一定平
行。血清 AST /ALT的比值对肝纤维化和肝硬化等病理改变，有助于
判断肝细胞病变的程度。比值越高，说明肝细胞损害越严重〔7〕。Y、
YR组与 M组相比血清 AST /ALT的比值明显降低(P ＜ 0. 05) ，且 YR
组优于 Y组(P ＜ 0. 05) (见表 2)。
表 2 血清 ALT、AST及 AST /ALT在各组的比较 (x ± s)
组别 例数 ALT AST AST /ALT
N 6 63. 04 ± 14. 50 194. 27 ± 32. 75 2. 99 ± 0. 20
NC 10 65. 04 ± 14. 50 200. 27 ± 26. 75 3. 01 ± 0. 25
M 10 159. 50 ± 29. 85 508. 37 ± 28. 58 3. 91 ± 0. 34
Y 10 132. 82 ± 32. 25 404. 90 ± 30. 90 2. 94 ± 2. 79*
YR 10 132. 60 ± 33. 44 330. 81 ± 23. 61 2. 19 ± 1. 28＊△
注:与 M组比较，* P ＜ 0. 05;与 Y组比较，△P ＜ 0. 05
3 讨论
本实验结果显示，与模型组相比，蚓激酶组及蚓激酶微乳组一般
情况较好，肝纤维化程度明显减轻，血清 AST /ALT 的比值明显降低。
说明蚓激酶对实验性大鼠肝纤维化模型有抑制作用。同时，我们发现
蚓激酶制备成 W/O型微乳后，能明显提高疗效。
目前认为，肝纤维化是多种致病因子使肝星状细胞(HSC)激活
后，纤维生成与降解失去平衡所致，纤维生成超过了纤维降解，细胞外
基质(ECM)便过度地在肝脏沉积。有研究表明在肝纤维化的发生发
展各个阶段中纤溶酶原-纤溶酶系统发挥了重要的作用。纤溶酶是主
要的蛋白分解酶，纤溶酶既可以直接降解 ECM，也可以激活基质金属
蛋白酶(MMPs) ，参与 ECM 的降解。蚓激酶是具有纤溶活性的丝氨
酸蛋白酶，关于蚓激酶抑制肝内纤维组织的形成及其相关机制尚需进
一步研究。
前期研究表明〔5〕，蚓激酶在 pH 3 ～ 12 条件下稳定，并且在胃肠
道中不受胃肠道酶的降解作用，但是由于其亲水亲油平衡常数低，致
使蚓激酶的小肠黏膜渗透系数小，从而导致药物的吸收生物利用度
低。制备的蚓激酶微乳能显著提高疗效，说明 W/O 型微乳体系能提
高蚓激酶的小肠黏膜渗透系数，从而提高其口服吸收生物利用度。
参考文献
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·中药与天然药物·
鬼针草中矢车菊黄素的分离提取及体外抗肿瘤活性研究
付达华1，熊典虹1，张 晶2，刘志礼3(1. 漳州卫生职业学院 漳州 363000;2. 清华大学北京协和医学院医药生
物技术研究所 北京 100050;3. 南昌大学第一附属医院 南昌 330006)
摘要:目的 从鬼针草中提取抗肿瘤活性成分并确定其结构，测试其对肿瘤细胞株的增殖抑制作用。方法 以 HeLa细胞为活性成分体外筛
选模型，通过 HPLC等方法分离提取抗肿瘤活性成分;通过波谱分析技术确定其化学结构; MTT法测试活性成分对多个肿瘤细胞株的增殖抑制
作用。结果 提取到的鬼针草抗肿瘤活性成分为矢车菊黄素，其对 HeLa、U2-OS、A549、MCF-7、HepG-2 细胞株的半数抑制浓度( IC50 ) 分别为
0. 18，1. 52，0. 67，0. 85，0. 43μM。结论 首次从鬼针草中提取到矢车菊黄素，该化合物具有较强的抗肿瘤细胞增殖作用。
关键词:鬼针草;矢车菊黄素; 抗肿瘤
中图分类号:R927. 2 文献标识码:A 文章编号:1006-3765(2013)-05-0027-03
作者简介:付达华，男(1970 －)。毕业于清华大学北京协和医学院医药生物技术研究所。职称:博士，副教授。从事微生物与生化药学、肿瘤药
理研究。联系电话:0596-2559589，E-mail:fdh1002@ hotmail. com
基金项目:漳州市科技局基金项目(Z2010091)
Extraction and Isolation of Centaureidin form Bidens pilosa Linn. and eval-
uation of its Inhibitory activity on human tumor cells in vitro
FU Da-hua1，XIONG Dian-hong1，ZHANG Jing2，LIU Zhi-li3(1. Zhangzhou Health Vacational College，Zhang-
zhou 363000，China;2. Institute of Medical Biotechnology，Peking Union Medical College，Tsinghua Universi-
ty，Beijing 100050，China;3. The First-Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China)
·72·
Strait Pharmaceutical Journal Vol 25 No. 5 2013
ABSTRACT:OBJECTIVE To obtain the antitumor compound from Bidens pilosa Linn. ，determine its structure
and investigate its antiproliferative effect on human tumor cells. METHODS Extraction and isolation of antitumor
compound were performed by HPLC with the HeLa cells as the in vitro screening model. Spectrum analysis was used
to determine the structure of antitumor compound and MTT assays were performed to investigate its antiproliferative
effect on human tumor cells. RESUTLS Bioactivity-guided isolation of antiproliferative compound from Bidens pilo-
sa Linn. resulted in the obtaining of centaureidin，which IC50 values on HeLa，U2-OS，A549，MCF-7，and HepG-2
cells were 0. 18，1. 52，0. 67，0. 85，0. 43μM respectively. CONCLUSION It is the first time to obtain centaureidin
from Bidens pilosa Linn. ，which exerts high antiproliferative activity on human tumor cells.
KEY WORDS:Bidens pilosa Linn. ;Centaureidin;Antitumor
鬼针草别名鬼钗草、婆婆针、鬼骨针等，拉丁名 Bidens pilosa
Linn. ，为菊科鬼针草属一年生草本植物(见图 1) ，常见于海拔 50 ～
3100m的路边荒地、山坡及田间，国内外均有分布。性温、味苦。《中
华本草》将其功效分类为:清热解毒药、消肿药。全草含总黄酮(约
4. 035%，主要分布在叶中)、蒽醌苷、生物碱、鞣质、挥发油、炔类、苦味
质、胆碱等多种化学成分〔1〕。基于前期试验发现鬼针草提取物具抗
肿瘤细胞增殖作用，本研究拟以体外培养的肿瘤细胞为筛选模型，提
图 1 鬼针草外观图
取抗肿瘤活性组分并确定其结构。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 药材与试剂:鬼针草
购于漳州聚善堂药业有限公
司，前期实验中已获取粗提
物。DMEM高糖培养基、RPMI
1640 培养基为美国 Hyclone公
司产品;胎牛血清(FBS)为杭州四季青生物工程有限公司产
品;胰蛋白酶为美国 Amresco 公司产品;3-(4，5-二甲基噻唑-
2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)为 Sigma 进口分装; (色谱
级)甲醇为天津南开化学试剂有限公司产品;其余均为国产
分析纯。
1. 1. 2 细胞株:人宫颈癌细胞 HeLa、人乳腺癌细胞 MCF-7、
人肝癌细胞 HepG-2、人肺腺癌细胞 A549 购自于中国医学科
学院肿瘤研究所;人骨肉瘤细胞 U2-OS 购自于上海中科院生
物细胞库。
1. 1. 3 仪器与耗材:AutoSpec-3000 型质谱仪(英国Micromass
公司) ;VNS-600 型核磁共振仪(瑞士 Varian 公司) ;Nicolet
5700 傅里叶变换红外光谱仪(美国 Thermo 公司) ;LC-10ATvp
高效液相色谱仪(日本岛津) ;C18分析柱及半制备柱(瑞典
kromasil) ;RE-52 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;SW-CJ-
2F型超净工作台(苏净集团) ;MDF-75 型细胞培养箱(日本
三洋) ;Bio-Rad680 型酶标仪;96 孔细胞培养板(美国 Costar
公司)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 抗肿瘤活性成分体外筛选方法
1. 2. 1. 1 细胞培养:HeLa 细胞常规培养于 DMEM 培养基中
(含 10%胎牛血清、3%谷氨酰胺;培养条件为 5% CO2、95%
湿度、37℃)。待细胞长至约 80%满后(一般为 3d) ，弃去旧
培养基，以适量胰酶(0. 25%胰蛋白酶 ∶ 0. 02% EDTA = 1∶ 1)
消化细胞，弃去消化液，以新鲜培养基轻轻荡洗细胞，后加入
适量新鲜培养基，反复轻轻吹打后制备细胞悬液，计数，以 1
∶4 的比例传代培养。
1. 2. 1. 2 受试液的配制:取分离提取各步骤中收集的各部
分，挥去有机溶剂后冻干。取冻干品 1mg，加入 10μL DMSO
使溶解，临用前以新鲜 DMED培养基(不含血清)稀释 100 倍
制成浓度为 1000μg·mL －1的受试液。
1. 2. 1. 3 筛选方法:调整细胞密度为 5 × 104 个 /mL，接种于
96 孔细胞培养板中，每孔 180μL;每孔分别加入各受试液
20μL(每种受试液设立 3 个平行孔) ，同时设立阴性对照组
(只接种细胞，不加受试液和 DMSO)和 0. 5% DMSO 对照组;
5% CO2、95%湿度、37℃继续培养 48h。倒置显微镜下观察，
细胞数量较少、细胞形态圆形的组别即判断为活性组分组。
1. 2. 2 鬼针草抗肿瘤活性组分的分离提取:取前期实验中所
得粗提物，以乙腈溶解，用 0. 45μm 的微孔滤膜过滤后，半制
备液相色谱进行制备。样品质量浓度为 10g·L －1，色谱条
件:Kromasil C18半制备柱(250mm ×10mm，粒径 5μm) ，流动相
乙腈-水(30 ∶ 70) ，柱温 25℃，进样量 800μL，流速 3mL·
min －1，检测波长为 351nm。收集各色谱峰，冷冻干燥后以
1. 2. 1 项下方法测试各组活性，得抗肿瘤活性组分 9. 8mg。
1. 2. 3 结构确定:取活性组分进行 IR、ESI-MS、NMR，确定其
结构。
1. 2. 4 抗肿瘤活性研究
1. 2. 4. 1 MTT溶液的配制:精密称取 MTT 0. 5g，溶于 100mL
无血清培养基中，超净工作台中用 0. 22μm 微孔滤膜过滤以
除去溶液里的细菌，4℃冰箱保存备用。
1. 2. 4. 2 药液的配制:精密称取提取的矢车菊黄素 1. 8mg，
以 50μL DMSO 溶解成 0. 1mol·L －1的母液，保存备用。取
2μL母液，分别以无血清的 DMEM 高糖培养基和 RPMI 1640
培养基稀释至 200μL，使成初始浓度为 10 －3mol·L －1的药液。
分别取初始浓度药液 20μL，以相应无血清培养基按 1∶ 10 的
比例梯度稀释，共五个梯度，使成浓度分别为 10 －3、10 －4、
10 －5、10 －6、10 －7mol·L －1的药液。药液配制及稀释均在无菌
条件下操作。
1. 2. 4. 3 肿瘤细胞的体外生长抑制实验:HeLa、U2-OS 细胞
常规培养于 DMEM培养基中，A549、MCF-7、HepG-2 常规培养
于 RPMI 1640 培养基中。
·82·
海峡药学 2013 年 第 25 卷 第 5 期
取对数生长期的细胞，胰酶消化后以相应培养基制成细
胞悬液，计数，调整细胞密度为 5 × 104 个 /mL，接种于 96 孔细
胞培养板中，每孔 180μL，5%CO2、95%湿度、37℃培养 24h使
细胞贴壁。加入 1. 2. 4. 2 项中五个浓度梯度的药液，每孔加
入 20μL，使药物终浓度分别为 10 －4、10 －5、10 －6、10 －7、10 －8
mol·L －1，每个浓度设 3 个平行孔。另设阴性对照组(含细胞
但无药液)、本底组(只含培养基)、0. 5% DMSO对照组(含细
胞，无药液)。5% CO2、95%湿度、37℃继续培养 48h。取出
细胞培养板，每孔中加入 5mg·mL －1 MTT溶液 20μL，相同条
件继续孵育 4h。小心吸去各孔中上清液，加入 DMSO 150μL，
平板摇床振摇 10min，使结晶紫颗粒溶解。酶标仪测定波长
570nm时各孔光吸收。按下列公式计算不同浓度药物对各细
胞株的抑制率，并以 － log〔M〕(药物浓度的负对数)为横坐
标、抑制率为纵坐标，OriginPro 7. 5 软件拟合增殖抑制曲线，
计算矢车菊黄素对各细胞株的 IC50值。
抑制率% =〔1 － (A实验组-A本底)/(A对照组 ～ A本底)〕×
100%
1. 2. 5 数据处理:采用 SPSS 12. 0 统计软件，实验数据以 x ±
s表示。
2 实验结果
2. 1 结构鉴定 冻干后活性组分为淡黄色粉末。质谱数据
表明其(M-H)-测量值为 359，分子量为 360;1H-NMR(DMSO，
δ，600MHz) :3. 74(s，3H，3-OCH3) ，3. 85(s，3H，4-OCH3) ，
3. 79(s，3H，6-OCH3) ，6. 57(s，8-H) ，6. 95(d，J = 8. 6 Hz，5-
H) ，7. 55(d，J = 2. 2 Hz，2-H) ，7. 73(dd，J = 8. 6，2. 2 Hz，6-
H) ;13 C-NMR:55. 7 (4-OCH3) ，59. 7 (3-OCH3) ，59. 9 (6-
OCH3) ，94. 1(C-8) ，104. 6(C-10) ，112(C-5) ，115. 6(C-2) ，
120. 8(C-6) ，122. 2(C-1) ，131. 1(C-6) ，137. 4(C-3) ，147. 4
(C-3) ，149. 7(C-4) ，151. 5(C-9) ，152. 3(C-5) ，155. 5(C-2) ，
157. 3(C-7) ，178. 1(C-4) ;IR υmax(cm-1) :3574(s，O-H) ，2944
(s，C-H) ，1654，1595，1572(s，C = C) ，1366(s) ，1297(s) ，1255
(s)。推测其分子式为 C18H16 O8，分子结构(见图 2) ，为已知
图 2 矢车菊黄素的结构图
化合物矢车菊黄素。
2. 2 抗肿瘤活性测试 MTT实验
结果表明，矢车菊黄素对 Hela、U2-
OS、A549、MCF-7、HepG-2 均有较
好的增殖抑制作用，其 IC50值分别
为 0. 18， 1. 52， 0. 67， 0. 85，
0. 43μM。
3 讨论
鬼针草为我国民间常用草药，主要应用于治疗阑尾炎和小儿腹
泻，另可用于治疗疟疾、痢疾、黄疸、肝炎、偏头痛、跌打损伤、蛇虫咬
伤、气性坏疽、急性肾炎、胃痛、咽喉肿痛等，具多种药理作用。近年来
药理学研究发现鬼针草提取物具降糖降压〔2，3〕、抗肝纤维化〔4〕、抗脂
质过氧化〔5〕、抗肿瘤〔6〕等多种作用。本研究的前期实验亦发现鬼针
草提取物对 HeLa细胞及 A549 细胞具增殖抑制作用，可诱导 HeLa细
胞及 A549 细胞凋亡;故本研究以 HeLa细胞为筛选模型，筛选鬼针草
抗肿瘤活性成分。
本研究采用目前较为普遍的生物学活性引导的分离纯化方法，用
体外培养的肿瘤细胞作为筛选模型筛选天然来源的抗肿瘤活性成分。
此种筛选方法筛选目标明确，但筛选方法不够先进、筛选手段较为粗
糙。一是筛选时程长、工作量大、筛选成本高，一个流程(细胞培养-铺
板-用药-检测)顺利时都需要 1 周以上的时间;二是存在漏筛现象，含
量较少的活性组分及针对某些特殊靶点的化合物容易被漏筛;三是筛
选具有一定盲目性，筛选到的活性化合物需进一步确定其作用靶标，
很多时候只筛选到细胞毒化合物。目前很多研究机构及研究团队已
将目光转向高通量筛选和靶向性筛选。
本研究筛选得到的活性化合物经结构解析为矢车菊黄素，这是国
内第一次报道从鬼针草中提取到该化合物。该化合物为已知结构化
合物，已从欧洲、亚洲、非洲、美洲、大洋洲等的多种菊科植物中分离提
取到，并被报道具抗炎性〔7〕、扩张血管〔8〕、降血糖〔9〕、抗疟〔10〕、抗肿
瘤〔11〕、抗氧化〔12〕等多种活性，其活性与国内报道的鬼针草提取物的
药理作用基本重叠。目前关于矢车菊黄素药理作用的作用机制报道
较少，更无报道明确该化合物的作用靶点，需进一步研究以确定该化
合物的作用靶点及作用途径。
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Strait Pharmaceutical Journal Vol 25 No. 5 2013