全 文 ：收稿日期:2015－12－16 修回日期:2016－02－29
基金项目:国家林业行业公益专项(201304404)。
作者简介:张扬(1984－)，男，实验师，从事资源微生物研究。通讯作者叶建仁(1958－)，男，教授，从事林木病理学及微生物学研究。
E-mail:jrye@ njfu．com．cn。
DOI:10．13324 / j．cnki．jfcf．2016．04．003
红绒盖牛肝菌发酵条件及对杨树溃疡病的防治效果
张 扬1，2，叶建仁1，赵 阳1，马仕波1
(1．南京林业大学林学院，江苏 南京 210037;2．江西农业大学林学院，江西 南昌 330045)
摘要:为探究外生菌根真菌的发酵条件，并进行杨树溃疡病的田间防治试验。以红绒盖牛肝菌［Xerocomus chrysenteron
(Bull．:Fr．)Quél］为实验材料，分析不同的接种量、溶解氧及 pH值对其液体发酵的影响，发酵产物并用于杨树溃疡病
的田间防治。结果表明:接种量 7．2%，发酵中后期溶解氧浓度不低于 33%，培养基 pH保持 5．5左右时可有效提高红绒
盖牛肝菌菌丝生物量，且缩短了发酵周期;灌根法研究红绒盖牛肝菌对杨树溃疡病的田间防治效果，防治效果可达到
54．5%。该实验所得出的红绒盖牛肝菌发酵条件和野外防治数据可为今后该菌株田间应用提供参考。
关键词:红绒盖牛肝菌;发酵;杨树溃疡病;防治效果
中图分类号:S76 文献标识码:A 文章编号:2096－0018(2016)04－0397－07
Fermentation conditions of Xerocomus chrysenteron and its control effect
on poplar canker disease
ZHANG Yang1，2，YE Jianren1，ZHAO Yang1，MA Shibo1
(1．College of Forestry，Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037，China;
2．College of Forestry，Jiangxi Agricultural University，Nanchang，Jiangxi 330045，China)
Abstract:Xerocomus chrysenteron (Bull．:Fr．)Quél was taken as the test material to investigate the fermentation conditions of
ectomycorrhizal fungi and test to control poplar canker was conducted in the field． Meanwhile the impact of different inoculum size
concentration of dissolved oxygen，and pH on the both fermentation and mycelial biomass was analyzed and the fermentation products
were taken to control poplar canker in the field． With 7．2% of the inoculum size，more than 33% dissolved oxygen concentration at
the middle and late fermentation stages，and medium pH maintain 5．5 effectively increased mycelial biomass of X． chrysenteron，and
shortened the fermentation period． The control effect of the X． chrysenteron against the poplar canker reached 54．5% in the field by
root irrigation method． The fermentation conditions and the outdoor data from the experiment can provide reference for application of
the strain in the field．
Key words:Xerocomus chrysenteron(Bull．:Fr．)Quél;fermentation;poplar canker;control effect
外生菌根真菌红绒盖牛肝菌［Xerocomus chrysenteron (Bull．:Fr．)Quél，Xc］是与松属植物根系共生
的一种真菌，可与植物形成菌根。研究表明，红绒盖牛肝菌能扩大林木根系的吸收面积和范围，增强元
素吸收和利用［1－2］，且可分泌多种激素和各类酶来提高寄主植物的抗逆性，对植物有显著的促生长作
用［3－6］，刘辉等［7］还发现 Xc具有较好的溶磷能力，提高林木对不溶磷元素的吸收。研究表明，红绒盖
牛肝菌可与大多数杨树形成菌根，以提高对不良环境适应性和抗逆性［8－10］。
杨树溃疡病是一种杨树寄主主导型枝干病害，病原种类繁多，症状多种多样，严重影响杨树长
势［11］。如水泡型溃疡病感病品种的杨树幼林发病率高达 80%－100%，死亡率可达 30%－50%［12］。另外
杨树溃疡病发生面积广，地理分布和寄主范围也不断的扩大，已严重障碍了中国杨树人工林的发展［13］。
红绒盖牛肝菌对杨树具有显著的促生抗病效应，对幼林的成活率也有显著提高［14－16］。可目前有关红绒
盖牛肝菌发酵培养的研究报道较少，未进行工业化生产。文中对 Xc 发酵条件进行探索，并对该菌株进
行了田间防治试验，以期用于生产实践。
森林与环境学报 2016，36(4):397－403 第 36卷 第 4期
Journal of Forest and Environment 2016年 10月
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试菌株及发酵罐 菌株保存于南京林业大学资源与环境学院江苏省有害生物入侵预防与控制
重点实验室。液体发酵罐为上海国强公司生产的 50 L自动机械搅拌发酵罐。消泡剂采用有机硅消泡剂，
型号 WX-gs530，生产于苏州百斯盾化工有限公司。
1．1．2 培养基 种子培养基(1 L):土豆 200 g、蔗糖 20 g、MgSO4·7H2O 1．5 g、KH2PO4 3 g、VB1 0．05 g。
发酵培养基(1 L):蔗糖 20 g、玉米粉 20 g、黄豆粉 15 g、酵母膏 5 g、MgSO4 0．5 g、KH2PO4 1 g。
土豆、玉米粉、黄豆粉加水煮沸后过滤，去除滤渣取其汁液。
1．2 方法
1．2．1 种子液的制备 将保存的菌种接入 PDA固体平板培养基中，于 25 ℃培养 8 d，待菌丝长满平板，
在无菌条件下，用打孔器(d= 7 mm)在菌落边缘打成菌饼，再转接装有 150 mL液体培养基的 250 mL三
角瓶中扩繁，每瓶挑取 20粒菌饼。置于培养温度 30 ℃和培养转速 121 r·min－1培养条件下培养至菌丝体
旺盛期，用灭菌的匀浆机粉碎，制备成种子液。
1．2．2 取样与在线监测 每隔 5 h取样，每次取 200 mL发酵液离心(5 000×g，20 min)，弃上清，收集
菌丝体，55 ℃烘干至恒重，用电子天平准确称重。溶解氧、pH值、温度、转速、通气量等参数由发酵
罐的探头自动在线监测。
1．2．3 临界溶解氧浓度的测定 溶解氧是需氧发酵控制的重要参数，微生物在生长繁殖旺盛时，会呈
现耗氧高峰，与之相对应有个溶解氧低谷，若溶解氧低于临界溶解氧浓度，会出现供氧不足，进而影响
到真菌细胞正常生长和生物量的积累。测定这段时期的临界溶解氧浓度对整个发酵期的溶解氧控制有决
定意义。本试验采用 METTLEＲ溶解氧电极动态法测定临界溶解氧浓度［17］。
1．2．4 Xc发酵条件的优化 在实验室前期对 Xc 掌握的生物学特性条件下［18－22］，将初始发酵条件设定
如下:温度 30 ℃，罐压 0．05 MPa，装料系数 0．5，按发酵体积的 0．05%加消泡剂，接种量为 4．8%，初
始溶解氧 80%，流量 10 L·M－1，转速保持 100 r·min－1，pH值自然，培养时间为 150 h。
在初始发酵条件下，设置不同发酵条件的罐批，每批次 3个重复，研究不同发酵条件对菌丝生物量
的影响程度，找出最适发酵条件。
1．2．5 红绒盖牛肝菌 Xc野外防治试验 2010年 3月，在江苏淮安集沭选择造林地，试验林位于集沭河
旁;土壤为沙壤土;气候类型为北温带半湿润季风气候;年平均气温为 14．1－14．8 ℃，年平均降水量在
906－1 007 mm;日照时间 2 136－2 411 h。该林地地势平坦，靠近河流，林下植被稀少。造林地选用
1年生NL895 杨(P．×euramericana CL“NL895”)，该杨树苗来源于杨树溃疡病高发区苗圃。
采用随机区组设计试验，四周设置保护行，设 3个重复区，采用灌根法。株行距 4 m×8 m，设处理 1
(Xc菌剂)及处理 2(空白对照 CK)。将发酵液配制成菌剂，灌于杨树根后覆土，菌剂配比为发酵液 ∶ 水=
1．5 L ∶ 8．5 L，菌液浓度为 15%，每棵树用量 500 mL。每处理 300棵，其它管理按常规方法进行。接种30 d
后调查 1年生杨树苗溃疡病发病级别，统计杨树死亡率、病情指数及防治效果。分级标准见表 1。
表 1 野外杨树溃疡病发病分级标准
Table 1 Standards of poplar canker disease classification in the field
病级
Disease stage
分级标准
The classification standard
代表值
Central value
Ⅰ 健康，无病斑 Healthy，no disease spot 0
Ⅱ 病斑 1－25个 1－25 disease spots 1
Ⅲ 病斑 26－50个或病斑无扩展 26－50 disease spots or no extension 2
Ⅳ 病斑 51－75个或病斑扩展成片 51－75 disease spots or extended sheet outward 3
Ⅴ 整株死亡 The whole plant death 4
·893· 森 林 与 环 境 学 报 第 36卷
病情指数 =
∑(各级病树株数 × 代表值)
总树株数 × 发病最高级代表值
× 100 (1)
防治效果 =
对照病情指数 － 防治后的病情指数
对照病情指数
× 100% (2)
图 1 发酵 19－27 h期间的临界溶解氧浓度
Figure 1 Critical oxygen concentration during the
fermentation from 19 to 27 hours
2 结果与分析
2．1 Xc临界溶解氧浓度的测定
发酵第 19－25 h 为耗氧高峰期，临界溶解氧浓度在
8%－33%之间。接种后培养 22 h 耗氧达最高峰，临界溶
解氧浓度亦达最大值，为 33%，在 22 h 以后，临界溶解
氧浓度明显呈下降趋势(图 1)。
2．2 初始发酵条件的 Xc菌丝生物量
培养体系中前 24 h Xc菌丝生物量增加不明显，菌丝
生长处于延滞期，到 64 h时，可增至 6．5 g·L－1;此后进
入稳定期，菌丝体生物量保持稳定，在 80－112 h 期间，
菌体生物量始终保持在 7．4 g·L－1左右，其中在 96 h 时菌
体生物量达到最大，为 7．8 g·L－1;112 h后，菌丝生物量
开始下降，进入衰亡期(图 2)。
图 2 Xc生长参数曲线－1批
Figure 2 Several growth parameter curve of X． chrysenteron No．1 batch
试验还发现，溶解氧变化与生物量变化存在一定关系。前 24 h 菌体由于处于延滞期，生长缓慢，
生物量累积速度很慢，基本没有变化，所以耗氧量少，罐内溶解氧高达 80%左右;24－56 h 细胞进入迅
速指数生长期，生长迅速，代谢旺盛，生物量迅速增加，耗氧量大，使罐内溶解氧几乎下降到 0;56 h
之后进入稳定期，耗氧量变化不大，生物量趋于稳定。
2．3 初始发酵条件 Xc培养基中 pH值变化
在发酵培养过程中，培养基 pH值变化较大，范围为 4．5－6．5。在 56 h内，pH先是随着发酵时间的
延长而下降，最低为 4．5左右;56 h之后，pH开始逐步上升，最终可升至 6．56，发酵环境接近中性。
2．4 不同溶解氧对 Xc菌丝生物量的影响
罐批 2(图 3)与罐批 1(图 2)进行比较，其他条件都相同，但罐批 2 在溶解氧降至 0．9%时，通过提
·993·第 4期 张扬等:红绒盖牛肝菌发酵条件及对杨树溃疡病的防治效果
高通气量来增加罐内溶解氧，56 h时，罐内溶解氧又降至 0．9%，调节通气量可使溶解氧提高到 30．4%，
第 74 h时，溶解氧又降至 0．9%，再次调节通气量使溶解氧提高到 25．6%。通过调节通气量使罐批 2 的
溶解氧条件明显优于罐批 1，使菌体生物量从 7．8 g·L－1提高到 11．68 g·L－1，生物量要高于罐批 1。
图 3 Xc生长参数曲线－2批
Figure 3 Several growth parameter curves of X． chrysenteron No．2 batch
另外，罐批 2中菌体生长的延滞期短于罐批 1，罐批 2 的发酵终点约在 86 h，比罐批 1 提前了近
10 h。罐批 2和罐批 3(图 4)比较，初始转速均设为 100 r·min－1，罐批 2 当溶解氧降低到零左右，只通
过通气量提高罐内溶解氧，虽然溶解氧有所上升，但之后又会降低到零左右。说明提高通气量的措施不
能满足此阶段 Xc菌体速生长的溶解氧需要。而罐批 3 通过提高转速和通气量来调节罐内溶解氧，利用
溶解氧转速联动，将罐内溶解氧保持在 33%，以满足菌丝生长对氧的最低需求。结果表明，罐批 2中最
大生物量为11．68 g·L－1;罐批 3中最大生物量可达至 16．80 g·L－1，发酵终点在 55－60 h之间。
图 4 Xc生长参数曲线－3批
Figure 4 Several growth parameter curves of X． chrysenteron No．3 batch
·004· 森 林 与 环 境 学 报 第 36卷
2．5 不同接种量和 pH值对菌丝生物量的影响
罐批 2、3、4的接种量均为 7．2%，比罐批 1的接种量增加了 2．4%，罐批 1最大生物量为7．8 g·L－1，
明显小于罐批 2、3、4。结果表明提高接种量可以使菌丝在罐中的延滞期缩短;提高接种量能够明显地
增加菌丝生物量，且缩短发酵时间。
保持罐批 3的培养条件，在罐批 4发酵 45 h时，培养基的 pH降到 5左右时，通过酸碱蠕动泵流加
氨水，自动调节 pH至 5．5，结果表明:罐批 4的菌丝体生物量在 60 h 达到最大，为 18．36 g·L－1，生物
量比罐批 3增加了 1．56 g·L－1(图 5)。
图 5 Xc生长参数曲线－4批
Figure 5 Several growth parameter curves of X． chrysenteron No．4 batch
3 红绒盖牛肝菌对杨树溃疡病的防治效果
调查发现杨树溃疡病野外发病类型共 2 种，包括不规则黑斑和水泡型(图 6)。防治试验结果表明，
施加 Xc对杨树的成活率有显著地提高，对溃疡病有显著的防治效果，防治效果达到 54．5%(表 2)。
注:A．水泡型溃疡病;B．不规则黑斑型溃疡病。Note:A． blister;B． big erose black blotch．
图 6 田间新造林杨树溃疡病发病情况
Figure 6 Symptoms of poplar canker disease occuring on new afforestation
·104·第 4期 张扬等:红绒盖牛肝菌发酵条件及对杨树溃疡病的防治效果
表 2 Xc对杨树溃疡病的田间防治效果
Table 2 Control effect of X． chrysenteron on poplar canker disease in the field
处理
调查株数
Investigated plants
发病株数
Infected plants
死亡率
Death rate /%
感病指数
Disease index
防治效果
Control effect /%
X． chrysenteron 300 194 14．5 27．7 54．5
CK 300 236 34．2 60．9 －
4 结论与讨论
4．1 结论
从接种量、溶解氧浓度、通气量、培养基 pH 值及转速对 Xc 的发酵条件进行了初探，结果表明这
些因素都会对 Xc生物量产生影响，通过一系列实验数据得出 Xc 最适发酵工艺为装料系数 0．5，0．05%
装料体积的消泡剂，接种量 7．2%，发酵温度 30 ℃，初始溶解氧浓度 80%，初始通气量 0 L·M－1，发酵
中后期调至 10 L·M－1，初始搅拌转速 100 r·min－1，发酵过程中 pH保持 5．5左右，发酵中后期保持溶解
氧浓度在 33%左右，发酵周期 60 h。将 Xc 液体发酵产物配制成一定浓度的液体菌剂，采用灌根法对
1年生NL-895杨树幼苗溃疡病进行防治试验，田间防治效果可达到 54．5%，感病指数显著低于 CK。
4．2 讨论
杨树溃疡病是杨树枝干重要病害之一，此病害有多种类型，主要由葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)、
疡壳孢属(Dothichiza)、腐皮壳属(Valsa)等真菌引起［23］，发展速度快，面积广，特别是杨树幼林发生
为害较重，与病原菌生物学特性、杨树栽培、树势衰弱及健康情况密切相关，近年此病害发生较为严
重，特别是幼树时期，从而造成造林失败［13］。据报道，在发病严重的地区，林木发病率可达 96．1%－
100%，感病指数为 68．7－95．8［12］。近年来，植物病害生物防治取得长足发展，研究深度和广度也逐年
增加，筛选出了一批高效的生防细菌和真菌［23－24］。杨蕾等从土壤中筛选出对杨树溃疡病有高效生物防
治效果的拮抗真菌木贼镰刀菌，对杨树离体组织溃疡病防治效果可达 76．04%［25］，并且对杨树内生菌进
行筛选，发现内生真菌黄绿木霉对杨树溃疡病有良好防治效果，防治效果达到 76．47%［26］，一系列研究
表明微生物资源中存在着众多对杨树溃疡病具有防治效果的菌株，这是一种控制杨树溃疡病可行
性方法。
外生菌根真菌 Xc能改善杨树根系构型，提高杨树的光合作用和细胞酶活性，增强杨树 N、P、K等
营养元素的吸收，在温室试验中发现 Xc 对杨树溃疡病等病害具有较好防治效果，促进杨树的生
长［14－15］，研究发现 Xc属好氧性微生物，在其发酵过程中供氧不足会抑制菌体的生长代谢，在以收集
Xc菌体为目的的深层发酵中，进入指数期后应增加通气量以满足菌体迅速生长的需要，另外转速过高
培养基会产生大量的泡沫，影响菌体生长，在提高溶解氧浓度时也相应提高通气量，尽量保持转速不要
过高。本试验只是在实验室条件下对发酵条件进行优化，而生防菌制剂的生防作用的发挥与制备工艺、
使用方法和菌剂使用时温度、湿度、pH值等环境因素密切相关［27］，因此，在红绒盖牛肝菌商业化过程
中，要继续加大对其最适发酵工艺的研究，也要加大此菌剂发挥最佳作用条件的研究，另外 Xc 在杨树
根际土壤中定殖情况及其对杨树溃疡病的生防机制、Xc的代谢产物活性成分及 Xc相关剂型的开发都是
后续研究的重点方向。
杨树造林地溃疡病病害一般在 2月底 3月初的初春发生，4－5月发病达到高峰期，秋季较少有病斑
出现［28］。Xc能有效的防治杨树溃疡病的发生，减少造林损失。杨树溃疡病菌是弱寄生菌，在造林前
期，苗木长势较弱，根系在移苗时会有损伤还没有形成健全的吸收体系及移苗过程中造成的根部受损，
都会影响树势强弱。任嘉红［29］在江苏省黄码乡进行生防菌株吡咯伯克霍尔德氏菌 JK-SH007 对新造林杨
树溃疡病的田间防治试验，采取不同浓度菌剂灌根法，试验发现并不是菌剂施用量越高，防治效果就越
好，在适当施用量下，JK-SH007对杨树溃疡病的防治效果可达 40．54%。在以后的防治试验中，不仅要
着重研究本菌株与寄主共生关系建立的机制及其代谢产物的抑病机制，还要注意生防菌株施用量问题。
·204· 森 林 与 环 境 学 报 第 36卷
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(责任编辑:卢凤美)
·304·第 4期 张扬等:红绒盖牛肝菌发酵条件及对杨树溃疡病的防治效果