全 文 ：［收稿日期］ 20150407(008)
［基金项目］ 国家自然科学基金面上项目(81470181) ;湖北省自然科学基金群体项目(2013CFA013)
［第一作者］ 徐海燕，在读硕士，从事中药药剂学研究，Tel:13260526512，E-mail:feliciaxhy19900417@ 163. com
［通讯作者］ * 葛月宾，博士，副教授，从事药物制剂研究和中药、民族药开发，Tel:027-67841196，E-mail:duckygreen@ 163. com
大麻药总皂苷中大麻药苷 B的含量测定
及其在体肠吸收特性分析
徐海燕，覃勤，葛月宾* ，陈旅翼
(中南民族大学 药学院，武汉 430074)
［摘要］ 目的:建立大麻药苷 B的 HPLC分析方法，用于测定其在有效部位大麻药总皂苷中的含量，并考察大麻药苷 B
的大鼠在体肠吸收能力。方法:采用 Ultimate AQ-C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相 0. 1%乙酸乙腈溶液-0. 1%乙酸
水溶液梯度洗脱，流速 0. 5 mL·min －1，检测波长 215 nm，进样量 20 μL。结果:标准曲线线性范围 60 ～ 210 mg·L －1，相关系数
0. 999 9，加样回收率在 95% ～ 105%，4 批大麻药总皂苷提取物中大麻药苷 B 质量分数分别为 89. 99%，82. 08%，89. 96%，
84. 38%。大鼠小肠在体肠吸收大麻药苷 B的吸收速率常数(0. 018 3 ± 0. 001 1)h －1，5 h累积吸收率(9. 49 ± 0. 26)% ． 结论:
该 HPLC分析方法简便、准确，可用于大麻药苷 B的含量测定。大麻药苷 B在大鼠小肠内吸收情况较差。
［关键词］ 大麻药苷 B;总皂苷;大麻药;肠吸收;大麻药苷 A
［中图分类号］ Ｒ283. 6;Ｒ284. 1;Ｒ284. 2;Ｒ945 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)20-0021-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015200021
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20150826． 1526． 008． html
［网络出版时间］ 2015-08-26 15:26
Determination of Doliroside B in Total Saponins from Dolichos appendiculatus Ｒoots and Analysis of Its in
situ Intestinal Absorption Characteristics XU Hai-yan，QIN Qin，GE Yue-bin* ，CHEN Lyu-yi (School of
Pharmacy，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)
［Abstract］ Objective:To develop a HPLC method for analyzing the content of doliroside B in total
saponins from Dolichos appendiculatus roots，and to investigate intestinal absorption characteristics of doliroside B．
Method:Ultimate AQ-C18 column (4. 6 mm ×250 mm，5 μm)was used with a mobile phase consisted of water-
acteonitrile containing 0. 1% acetic acid for gradient elution at a flow rate of 0. 5 mL·min －1，detection wavelength
was 215 nm and an injection volume was 20 μL． Ｒesult:Good linearity was obtained over the concentration range
of 60-210 mg·L －1 with the correlation coefficient of 0. 999 9. The mean recoveries were between 95% and 105% ．
The content of doliroside B in four batches of total saponins extract from D． appendiculatus roots were all above
80% ． In addition，the absorption rate constant of doliroside B in small intestine was (0. 018 3 ± 0. 001 1)h －1
and cumulative absorption percentage in 5 h was (9. 49 ± 0. 26)% ． Conclusion:This HPLC method is simple and
accurate for quality control of doliroside B． Doliroside B is badly absorbed in small intestine．
［Key words］ doliroside B;total saponins;Dolichos appendiculatus;intestinal absorption;doliroside A
大麻药记载于《中国植物志》，原植物为豆科植
物丽江镰扁豆的根或叶［1］。《中华本草·傣药卷》中
记载其傣药名托也腾［2］，俗称麻里麻、麻三段、豆叶
百步还阳，味辛、麻，性温，有毒，入肺、心二经，功效
祛风活血、消炎镇痛、止血生肌，主治风湿疼痛、跌打
损伤、骨折、外伤出血、吐血、衄血、便血等［3-4］。研
究报道表明大麻药的主要化学成分为皂苷类，包括
大麻药皂苷 A［5-6］，该成分具有抗炎镇痛［7］、抗动脉
粥样硬化、调血脂及抗心肌缺血的药理作用。前期
已从大麻药中提取了大麻药总皂苷，开展了抗痛风
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性关节炎的活性及其毒性研究，结果表明大麻药总
皂苷对尿酸钠晶体处理的 ＲAW264. 7 细胞中促炎
性细胞因子(白细胞介素-1β，白细胞介素-6 和肿瘤
坏死因子-α)具有很强的抑制作用。从大麻药总皂
苷中分离出大麻药苷 A 和大麻药苷 B，由于大麻药
B的含量远远大于大麻药苷 A［8］，故本实验拟以大
麻药苷 B为指标成分，建立其 HPLC分析方法，采用
大鼠在体肠吸收模型，研究大麻药总皂苷中大麻药
苷 B的吸收情况。类似研究内容国内外文献尚无
报道，实验结果能为后续的药物质量控制提供可靠
适用的分析手段，并为大麻药总皂苷的制剂设计提
供实验依据。
1 材料
1200 系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司) ，
AB265-S型 1 /10 万电子分析天平(瑞士梅特勒-托
利多公司) ，PHSJ-3F 型实验室 pH 计(上海精科实
业有限公司) ，BT100-ZJ型蠕动泵(保定兰格恒流泵
有限公司) ，ZNCL-G 型磁力搅拌器(郑州长城科工
贸有限公司)。
大麻药(采摘于云南省大理市宾川县太和镇，
经中南民族大学药学院陈旅翼博士鉴定为豆科植物
镰叶山扁豆 Dolichos appendiculatus的根) ，大麻药苷
B 对照品(自制，经 HPLC 归一法测定，纯度 ＞
98%) ，HPD400 型大孔吸附树脂柱(河北沧州宝恩
吸附材料有限公司) ，Krebs-Ｒinger 试液(简称 K-Ｒ
液，每 1 L 含氯化钠 7. 8 g，氯化钾 0. 35 g，氯化钙
0. 37 g，碳酸氢钠 1. 37 g，磷酸二氢钠 0. 32 g，氯化镁
0. 02 g，葡萄糖 1. 4 g，用 1. 5 mol·L －1磷酸调 pH
7. 4) ，乙腈为色谱纯，水为自制超纯水，其他试剂均
为分析纯。
SPF级雄性 SD大鼠，体重(200 ± 20)g，购于湖
北省实验动物研究中心，合格证号 SCXK(鄂)
2008-0005。
2 方法与结果
2. 1 大麻药总皂苷的提取与分离［9］ 取大麻药粉
末适量，置于圆底烧瓶中，加 10 倍量 60%乙醇浸泡
2 h，水浴回流提取 3 次，提取时间分别为 2. 0，1. 5，
1. 0 h，合并滤液;滤液减压回收乙醇至无醇味，制成
生药质量浓度 0. 05 g·mL －1的药液;将配好的药液
通过 HPD400 型大孔吸附树脂柱，加 30%乙醇 8 BV
冲洗除杂，加 60%乙醇 7 BV 洗脱，收集洗脱液，浓
缩、干燥，得大麻药总皂苷。
2. 2 大麻药苷 B的含量测定
2. 2. 1 色 谱 条 件 Ultimate AQ-C18 色 谱 柱
(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，流动相 0. 1%乙酸乙腈
溶液(A)-0. 1% 乙酸水溶液(B)梯度洗脱(0 ～ 25
min，40% ～65% A;25 ～ 30 min，65% ～ 40% A;30 ～
45 min，40%A) ，检测波长 215 nm，流速 0. 5 mL·
min －1，柱温25 ℃，进样量 20 μL。在该色谱条件下，
供试品溶液中其他成分不会干扰指标成分的测定，
见图 1。
A．阴性样品;B．对照品;C．供试品;1. 大麻药苷 B
图 1 大麻药总皂苷 HPLC
Fig． 1 HPLC of total saponins from Dolichos appendiculatus roots
2. 2. 2 方法学考察 精密量取 300 mg·L －1大麻药
苷 B 对照品溶液适量，用甲醇稀释成 60 ～ 210
mg·L －1的系列溶液，按 2. 2. 1 项下色谱条件测定，
以峰面积对质量浓度进行线性回归，得回归方程
Y = 13. 317X － 66. 337(r = 0. 999 9) ，线性范围 60 ～
210 mg·L －1。取同一供试品溶液(大麻药苷 B 质量
浓度 104. 8 mg·L －1) ，分别于 0，1，2，4，6，8，10，12 h
按 2. 2. 1 项下色谱条件测定，结果显示大麻药苷 B
峰面积的 ＲSD 0. 1%，表明供试品溶液在 12 h 内稳
定。精密吸取同一对照品溶液，按 2. 2. 1 项下色谱
条件测定，结果日内、日间精密度 ＲSD 分别为
0. 6%，1. 0%，表明仪器精密度良好。6 份供试品溶
液的重复性 ＲSD 1. 0%，表明该方法重复性较好。
量取 300 mg·L －1大麻药总皂苷供试品溶液 0. 7，
1. 4，2. 9 mL，分别置于 5 mL 量瓶中，各加入 300
mg·L －1大麻药苷 B对照品储备液 1 mL，用甲醇稀释
至刻度，配制成 94. 252，128. 502，201. 898 mg·L －1的
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溶液(n =3) ，结果 3 种质量浓度样品溶液的平均加
样回收率分别为 98. 86%，98. 86%，98. 47%，ＲSD
分别为 0. 3%，0. 8%，1. 5%。测定结果符合方法学
要求，表明该分析方法准确有效，可用于大麻药苷 B
的含量测定。
2. 2. 3 样品测定 精密称取不同批次大麻药总皂
苷供试品适量，分别置于 25 mL量瓶中，用甲醇溶解
并稀释至刻线，按 2. 2. 1 项下色谱条件测定，计算不
同批次样品中大麻药苷 B 平均质量分数分别为
89. 99%，82. 08%，89. 96%，84. 38%，ＲSD 依次为
0. 6%，1. 0%，0. 6%，0. 8%。
2. 3 大麻药苷 B在体肠吸收试验
2. 3. 1 肠灌注液中酚红浓度的测定［10］ 精密称取
酚红适量，用 K-Ｒ 试液溶解并稀释定容，得质量浓
度分别为 10，15，20，25，30 mg·L －1的系列溶液，以
0. 2 mol·L －1氢氧化钠溶液显色 10 min，于 558 nm处
测定吸光度 A。以 A 对酚红质量浓度 C 进行线性回
归，得回归方程 A = 0. 019C － 0. 009(r = 0. 999 5) ，结
果表明酚红在 10 ～30 mg·L －1与 A呈良好线性关系。
2. 3. 2 色 谱 条 件 Ultimate AQ-C18 色 谱 柱
(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，流动相 0. 1%乙酸乙腈
溶液(A)-0. 1% 乙酸水溶液(B)梯度洗脱(0 ～ 25
min，50% ～65% A;25 ～ 30 min，65% ～ 50% A;30 ～
45 min，50%A) ，检测波长 215 nm，流速 0. 5 mL·
min －1，柱温 25 ℃，进样量 20 μL，见图 2。在该色谱
条件下，供试品溶液中其他成分不会干扰指标成分
的测定。
2. 3. 3 方法学考察 分别精密吸取大麻药苷 B 对
照品储备液(含酚红 20 mg·L －1)适量，用 20 mg·L －1
酚红液稀释成质量浓度为 67. 02 ～ 201. 06 mg·L －1
的系列溶液，按 2. 3. 2 项下色谱条件测定，以峰面积
为纵坐标，质量浓度为横坐标，得回归方程 Y =
13. 746X － 38. 033(r = 0. 999 5) ，线性范围 67. 02 ～
201. 06 mg·L －1。取同一样品溶液，分别于 0，1，2，
4，6，8，10，12 h按 2. 3. 2 项下色谱条件测定，结果大
麻药苷 B 峰面积的 ＲSD 0. 1%，表明样品溶液在
12 h内稳定。日内精密度 ＲSD 0. 3%，表明仪器精
密度良好。6 份样品测定重复性 ＲSD 0. 4%，表明该
方法重复性好。量取 300 mg·L －1大麻药总皂苷溶
液 0. 8，1. 0，1. 4 mL，分别置于 5 mL 量瓶中，各加入
100 mg·L －1大麻药苷 B 对照品储备液(含酚红 20
mg·L －1)2. 5 mL，用酚红液(20 mg·L －1)稀释并定容
至刻度，配制成 91. 02，101. 28，121. 79 mg·L －1的溶液
(n =3) ，结果 3种质量浓度样品溶液的平均加样回收
A．阴性样品(酚红空白肠液) ;B．对照品;C．供试品;1. 大麻药苷 B
图 2 大麻药总皂苷肠灌注液 HPLC
Fig． 2 HPLC of intestinal perfusate of total saponins from Dolichos
appendiculatus roots
率分别为 97. 67%，101. 33%，104%，ＲSD 分别为
0. 9%，1. 1%，0. 1%。测定结果符合方法学要求。
2. 3. 4 大鼠在体肠吸收试验［11］ 取 SD大鼠，禁食
不禁水 12 h，按 0. 004 mL·g －1腹腔注射 10%水合三
氯乙醛，麻醉，固定，沿腹中线打开腹腔，自十二指肠
上部及回肠下部插管，洗净肠管内容物后，灌注 200
mg·L －1大麻药总皂苷供试液，按流速 5. 0 mL·min －1
循环 10 min后，将流速调至 2. 5 mL·min －1，自灌注
液中取样 2. 0 mL作为测定零点，并补加同体积酚红
液，其后每隔固定时间同法取样。根据酚红质量浓
度计算供试液的体积，根据每一时间段药物质量浓
度和供试液体积的变化计算出肠灌注液中的剩余药
量(大麻药苷 B)。以肠循环液中剩余药量的对数
(lnX)对取样时间(t)作图，得 lnX = － 0. 017 6t +
9. 851 6(r = 0. 982) ，通过直线斜率求算吸收速率常
数(Ka) ，平均吸收情况见图 3。结果表明大鼠小肠在
体吸收大麻药苷 B的 Ka 为(0. 018 3 ±0. 001 1)h
－1，
5 h累积吸收率(9. 49 ± 0. 26)%。
3 讨论
采用 HPLC 测定大麻药苷 B 准确度较好，该成
分在 215 nm处有最大吸收，预试验考察了 HPLC 等
度和多种梯度条件下测定大麻药苷 B，最后确定为
梯度测定，色谱峰的对称因子均在 9. 55 ～ 1. 05，分
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图 3 大麻药苷 B大鼠小肠在体吸收曲线
Fig． 3 In situ absorption curve of doliroside B in small intestine
of rats
离度 ＞ 1. 5，理论塔板数 ＞ 10 000，符合 2010 年版
《中国药典》要求。通过精密度、重复性、加样回收
率等试验证明，建立的 HPLC 测定大麻药苷 B 的方
法简单可靠、准确度高。
了解药物在胃肠道的吸收转运情况，可减少剂
型设计的盲目性，为剂型开发提供依据，是制剂处方
前工作的必要环节。在大鼠小肠在体吸收试验中，
由于肠道对水分有吸收，故采用酚红进行体积标定，
测定不同时间点的酚红质量浓度，根据酚红质量浓
度的变化计算不同时间点供试液的体积，并结合药
物的质量浓度，准确求算出不同时间点小肠中剩余
的药量或被吸收的药量。但文献报道酚红也能少量
被小肠吸收，平均吸收速率 6%，Ca2 +能抑制酚红的
吸收。故本文采用含有一定浓度 Ca2 +的 K-Ｒ 液配
制循环液，以减小实验误差［12］。当前大多数皂苷类
化合物的主要给药方式为口服给药，而大量研究发
现皂苷类化合物经口服给药后，在肠道内较难吸收，
生物利用度低［13-17］。本文结果表明大麻药苷 B 在
大鼠小肠体内的吸收并不理想，这可能与其分子结
构有关，大麻药苷 B 的相对分子质量比较大，所以
透过小肠的上皮细胞有些困难，但有实验证明大鼠
灌胃大麻药总皂苷具有良好的药理作用，关于其药
物体内代谢情况尚不清楚，有待于进一步研究证实。
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［责任编辑 刘德文］
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