全 文 ：doi:10.3969 /j.issn.1005-0264.2010.05.013
九头狮子草水浸膏对 2.2.15细胞中对 HBsAg、 HBeAg的分泌
和 HBVDNA复制的抑制作用＊
杨成雄　潘朝旺　王洪林　罗　磊　李立威　杨希雄
荆楚理工学院 (湖北 荆门 , 448000)
　　摘　要　目的:通过观察九头狮子草水浸膏对 2.2.15细胞 HBsAg、 HBeAg的分泌及 HBVDNA复制的影响 , 探讨
其在体外的抗乙型肝炎病毒 (HBV)作用。方法:将 SD大鼠 (n=10)随机分为九头狮子草水浸膏组和正常血清组 ,
前者用九头狮子草水浸膏按 2.7g· kg-1· d-1剂量灌胃 , 后者给予生理盐水 10ml· kg-1· d-1灌胃 , 制备不同浓度含药
血清及正常血清。 2.2.15细胞培养上清液 HBsAg、 HBeAg测定采用免疫放射分析法 , HBVDNA检测采用 PCR杂交试
验法 , 测定不同浓度含药血清抗 HBV活性情况。结果:含药血清作用 4天 、 8天时 , 各含药血清组抑制 HBsAg、
HBeAg分泌的作用优于空白血清细胞对照 (指含正常血清)组 (P<0.01、 P<0.05)。作用 4天时 , 不同浓度含药血
清的抗 HBV作用差异无显著性意义 (P>0.05);作用 8天时 , 不同浓度含药血清抑制 HBeAg分泌的作用差异无显著
性意义 (P>0.05);10%、 15%含药血清抑制 HBsAg分泌的作用均优于 5%含药血清 (P<0.05), 10%、 15%含药
血清相比较差异无显著性意义 (P>0.05);作用 8天时 , 各含药血清组 HBVDNA低于细胞对照组和空白血清细胞对
照 (指含正常血清)组 (P<0.01、 P<0.05), 5%、 10%含药血清组与 15%含药血清组相比较差异有显著性意义
(P<0.05)。结论:九头狮子草水浸膏的含药血清在体外细胞培养中对 2.2.15细胞分泌 HBsAg、 HBeAg及 HBVDNA
复制均有较好的抑制作用 , 10%含药血清的抑制作用优于 5%、 15%浓度。
关键词　九头狮子草水浸膏 /药效学;2.2.15细胞;肝炎病毒 , 乙型;乙型肝炎表面抗原;乙型肝炎 e抗原;乙
肝病毒脱氧核糖核酸
InhibitoryefectofaqueousextractofPeristropeonsecretionofHBsAgand
HBeAgandreplicationofHBVDNAincultured2.2.15 celline
YANGCHENG-XIONG, PANCHAO-WANG, WANGHONG-LING, etal.JingchuColegeofTechnology(JingmenHubei,
448000)China
Abstract　Objective:ByobservingtheimpactofaqueousextractofPeristropeonthesecretionofHBsAgandHBeAgand
thereplicationofHBVDNAinthecultured2.2.15 celline, tostudytheanti-HBVefectofPeristropeinvitro.Methods:SD
rats(n=10)weredividedintoaqueousextractofPeristropegroupandnormalbloodserumgroup.Ratsoftheformergroupwere
intragastricadministerredwithaqueousextractofPeristropewithadoseof2.7 gramperkilogramperday, thelatergroupwere
intragastricadministerredwithnormalsalinewith10mililitreperkilogramperdaytodeterminedtheanti-HBVactivitiesofdiffer-
entconcentrationsofaqueousextractofPeristrope.ThelevelsofHBsAgandHBeAginsupernatantliquidofcultured2.2.15cels
weredetectedbyimmunoradiometricassay.ThelevelsofHBVDNAweredetectedbyPCRhybridizationexperiments.Results:
Fourdaysandeightdayslater, theeffectinhabitingthesecretionofHBsAgandHBeAginaqueousextractofPeristropegroup
wasbetterthantheeffectsinthecontrolgroupandnormalserumgroup(P<0.01, P<0.05).Fourdayslater, Anti-HBV
effectsofextractofPeristropegroupswithdiferentconcentraionshadnosignificantdifferences.Eightdayslater, theeffectsin-
habitingthesecretionofHBsAginextractofPeristropegroupswithdifferentconcentraionshadnosignificantdiferences(P>
0.05).TheeffectsinhabitingthesecretionofHBeAgin15 percentextractofPeristropegroupandin10 percentextractofPeris-
·294· 中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 5期
＊ 基金项目:湖北省重点科技计划项目 (No.2006AA301C01)
tropegroupwerebeterthantheefectin5percentextractofPeristropegroup(P<0.05)andtherewerenosignificantdiffer-
encebetween10percentgroupand15percentgroup(P>0.05).Fourdayslater, thelevelofHBVDNAinextractofPeris-
tropegroupswithdifferentconcentraionswerelowerthanthatofthecontrolgroupandnormalserumgroup(P<0.01, P<
0.05).ThelevelofHBVDNAin5percentextractofPeristropegroupandin10percentextractofPeristropegrouphadsignifi-
cantdiferenceswiththatof15percentextractofPeristropegroup(P<0.05).Conclusion:AqueousextractofPeristropehas
asignificantlyinhibitoryefecttothesecretionofHBsAgandHBeAgandreplicationofHBVDNAincultured2.2.15cellinein
vitro.Theinhibitoryeffectof10 percentextractofPeristropeisbeterthanthatof5percentand15 percent.
KeyWords　aqueousextractofPeristrope/pharmacodynamics;cultured2.2.15cellline;HBV;HBsAg;HBeAg;HBV
DNA
　　九头狮子草 [ Peristropejaponica(thunb.)Bemek] 是爵
床科九头狮子草属植物 , 药用全草 , 其性味辛凉 , 具有清热
解毒 、 行气止血之功效。我们通过 HBsAg破坏实验 , 已证实
九头狮子草水提取物对 HBsAg有明显抑制作用。为进一步验
证九头狮子草水浸膏抗乙型肝炎病毒 (HBV)作用 , 拟采用
中药血清药理学方法 [ 1 ～3] , 制备含药血清 , 加入 HBV基因转
染的人肝癌细胞系 2.2.15细胞培养 , 研究其对 2.2.15细胞分
泌 HBsAg、 HBeAg及复制 HBVDNA的抑制效果。报道如下。
1　材料和方法
1.1　实验动物及药物　实验动物:SPF级 SD雄性大鼠 , 体
重 300g左右 , 10只 , 购自华中科技大学同济医学院动物房。
药物:九头狮子草水浸膏由本学院中药学教研室用蒸馏水提
取后浓缩制得 , 浓度为 0.3637g/ml生药。
1.2　主要试剂　HBVDNA克隆转染人肝癌细胞 (HepG2)
2.2.15细胞株购自中国典型培养物保藏中心 (武汉大学保藏
中心)。 α-MEM培养基购自美国 GIBCO公司 , 胎牛血清购自
杭州四季青生物工程材料有限公司 , G418 (Geneticin, 是一
种氨基糖苷类抗生素)购自美国 Amresco公司 , HBsAg、
HBeAg放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所 , HBV
DNAPCR杂交试剂盒购自华美生物工程公司。
1.3　主要仪器与设备　CO
2
孵箱 (美国 ThermoForma公司);
自动酶标仪 (美国 Bio-Rad公司);培养瓶 (美国 Promega
公司产品);96孔板 (美国 Corning公司)。
1.4　含药血清的制备　SD大鼠 10只随机分为两组 , 含药血
清组根据成人用量 (30g/d)按体表面积换算法换算出大鼠九
头狮子草水浸膏用量 (2.7g· kg-1· d-1), 正常血清组大鼠
予生理盐水 10ml· kg-1· d-1 , 连续灌胃 10天 , 无菌条件下
行颈动脉插管采血 , 3000r/min离心 20分钟分离血清 , 56℃
灭活 30分钟后 4℃保存备用。
1.5　2.2.15细胞培养液及试剂配制　α-MEM培养基加入
10%胎牛血清 , 卡那霉素 50u/ml, G418终浓度 380μg/ml;试
验用培养液不加 G418。
1.6　体外培养实验分组方法　每 4孔为 1组 , 共分 6组 , 分
别为 5%含药血清组 (培养基中含 5%药物血清)、 10%含药
血清组 (培养基中含 10%药物血清)、 15%含药血清组 (培
养基中含 15%药物血清)、 空白血清细胞对照组 (培养基中
含 10%正常血清), 以及细胞对照组 (不分泌 HBsAg、 HBeAg
的正常人肝细胞 7702细胞株)和空白对照组 (无细胞 , 仅加
培养基的)。
1.7　细胞培养　在长满 2.2.15细胞的培养瓶内加适量
0.25%胰蛋白酶 , 37℃消化 3分钟 , 加入培养基中止消化 、
吹打 , 1∶3传代 , 长满后加入细胞计数板计数 , 配制成 108 /ml
浓度的细胞悬液接种 96孔板 、 每孔 0.2ml, 37℃、 5% CO2培
养 24小时 , 细胞长成单层后加入不同浓度含药血清 , 每 4天
更换同浓度含药血清培养液 , 第 4、 8天时收集培养上清液测
定 HBsAg、 HBeAg、 HBVDNA。
1.8　样品检测与结果计算方法
1.8.1　HBsAg、 HBeAg测定　固相放射免疫测定试剂盒测定 ,
方法见说明书 , 用 γ-计数器测定每孔 cpm(countsperminute,
每分钟闪烁次数)值。 计算细胞对照及每一种血清浓度下
cpm均值及标准差 , P/N(positive/negative, 阳性与阴性之比
值)值和抑制百分率 (%)。 P/N= (实验组 cpm-空白对照
组 cpm) / (阴性对照 cpm-空白对照组 cpm), 药物抑制抗
原百分率 (%) = (空白血清细胞对照组 cpm-血清组
cpm) / (空白血清细胞对照组 cpm-空白对照组 cpm) ×
100。
1.8.2　HBVDNA的测定　PCR杂交法测定 , 按试剂盒说明
书操作。
1.9　统计学方法　用 SPSS11.5统计软件进行 χ2及 t检验。
2　结果
含药血清对 2.2.15细胞 HBsAg、HBeAg、HBVDNA分泌的
抑制作用。含药血清作用 4天 、8天时 , 各含药血清组抑制 HB-
sAg、HBeAg分泌的作用优于空白血清细胞对照组(P<0.01、P
<0.05);作用 4天时 , 不同浓度含药血清的抗 HBV作用差异
无显著性意义(P>0.05);作用 8天时 , 不同浓度含药血清抑制
HBeAg分泌的作用差异无显著性意义(P>0.05);10%、15%含
药血清抑制 HBsAg分泌的作用均优于 5%含药血清(P<
0.05), 10%、 15%含药血清相比较差异无显著性意义(P>
0.05);作用 8天时 , 各含药血清组 HBVDNA低于细胞对照组
和空白血清细胞对照组(P<0.01、P<0.05), 5%、10%含药血
清组优于 15%含药血清组 , 相比较差异有显著性意义(P<
0.05)。见表 1 ～表 3和图 1 ～图 4(见插页)。
·295·中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 5期
表 1　含药血清对 2.2.15细胞 HBsAg分泌的抑制作用
分　　组 cpm( x±s)
4天 8天
抑制率 (%)
4天 8天
P/N值
4天 8天
5%含药血清组 1906.0±360.289a 1543.0±191.001a 41.09 52.58 8.90 7.17
10%含药血清组 1644.0±93.338a 1178.5±106.638ac 49.38 64.12 7.65 5.42
15%含药血清组 1380.0±22.627a 1259.0±87.704ac 57.74 61.57 6.39 5.81
空白血清细胞对照组 3204±363.982 - - 15.11
细胞对照组 254.0±11.5 - - - -
空白对照组 45.0 - - - -
与空白血清细胞对照组相比 , aP<0.01;与 5%含药血清组相比 , cP<0.05
表 2　含药血清对 2.2.15细胞 HBeAg分泌的抑制作用
分　　组 cpm( x±s)
4天 8天
抑制率 (%)
4天 8天
P/N值
4天 8天
5%含药血清组 584.0±2.828a 632.67±31.262a 37.29 31.63 6.29 6.86
10%含药血清组 607.33±46.014a 640.0±95.394a 34.57 30.77 6.56 6.94
15%含药血清组 606.67±19.732a 630.0±9.165a 34.65 31.94 6.55 6.83
空白血清细胞对照组 904.5±54.219 - - 10.03
细胞对照组 130.7±21.7 - - - -
空白对照组 45.0 - - - -
与空白血清细胞对照组相比 , aP<0.01
表 3　含药血清作用 8天时对 2.2.15细胞
HBVDNA合成的抑制作用
分　　组 IOD(积分光密度 , integratedopticaldensity)值
5%含药血清组 581.5±96.874abe
10%含药血清组 693.0±106.638abd
15%含药血清组 979.0±73.539ce
空白血清细胞对照组 2318.5±161.927e
细胞对照组 1356.5±64.347
与 15%含药血清组相比 , aP<0.05;与空白血清细胞对照组相比 , b
P<0.01, cP<0.05;与细胞对照组相比 , dP<0.01, eP<0.05
3　讨论
2.2.15细胞系是体外筛选抗 HBV药物的有效方法。中药
血清药理方法学是将中药成分或中药复方经口给动物灌服一
定时间后采集血液 , 分离血清 , 用此含有药物的血清进行体
外实验的方法 , 药物进入体内后经过生物转化过程 , 用此含
药血清进行实验即 “血清添加法” , 它体现了体外实验和体内
实验的完美结合 [ 4] 。
本实验采用 2.2.15细胞模型和中药血清药理方法 , 证实
九头狮子草水浸膏的含药血清在体外细胞培养中对 2.2.15细
胞分泌 HBsAg、 HBeAg及 HBVDNA复制均有较好的抑制作
用 , 10%含药血清的抑制作用优于 5%、 15%浓度。
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(收稿日期:2010-09-01　编辑:姚昌绶)
本刊 E-mail:zxygbzz@163.com
·296· 中西医结合肝病杂志 2010年第 20卷第 5期