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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
输卵管分泌的黏性糖蛋白对脊柱动物的生殖
功能有着不可替代的作用［1］。国内外关于哺乳动
物输卵管糖蛋白分离纯化及免疫组化的研究逐渐增
多［2-6］，而对林蛙输卵管糖蛋白的分离纯化及结构
鉴定的研究鲜有报道。
中国林蛙（Rana chensinensis），又称雪蛤，属
于两栖纲无尾目蛙科，主要生长在我国东三省的长
白山、松花江等森林地区［7］。 新鲜林蛙输卵管经加
工干制即为林蛙油，药理作用主要有抗疲劳、增强
机体免疫力、镇咳祛痰、抗衰老、滋阴养颜、调节
血脂、抗缺氧、调节机体免疫功能和应激性及抗焦
虑等［8-11］。多数研究证实，林蛙油中的水溶性糖蛋
白对林蛙油的功能性起到重要的作用［12-14］。但是，
关于林蛙油中单一蛋白的功能研究尚无报道，而获
收稿日期 ：2013-09-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30671536）
作者简介 ：李稼晖，男，硕士，研究方向 ：食品生物化学与功能性食品 ；E-mail ：lijiahuizml@gmail.com
通讯作者 ：刘景圣，男，博士，教授，研究方向 ：功能性食品 ；E-mail ：liujs1007@vip.sina.com
长白山林蛙输卵管糖蛋白 ROGP-III 的分离纯化及鉴定
李稼晖  刘回民  赵宏宇  刘景圣
（吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118）
摘 要 ： 通过正交试验确定最佳的粗提工艺，并将林蛙输卵管水提液先后通过盐析，透析，阴离子交换层析、阳离子交换
层析和葡聚糖凝胶过滤层析，获得了一种分子量大小约为 66 kD 的单一蛋白，高碘酸-Schiff 试剂法鉴定其为糖蛋白。经 HPLC 分析，
纯度为 97.2%，将其命名为 ROGP-III，经 PNGase F 糖苷肽酶处理后推测其糖含量约为 17%。
关键词 ： 林蛙油 糖蛋白 分离 纯化 鉴定
Separation and Identification of Oviduct Glycoprotein
ROGP-III from Rana chensinensis
Li Jiahui1 Liu Huimin Zhao Hongyu Liu Jingsheng
（College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University，Changchun 130118）
Abstract:  To study the function of the single glycoprotein in Rana chensinensis, this research determined the best coarse extraction
process by orthogonal test, then purified a 66 kD single protein by salting out, dialysis, ion-exchange column chromatography and gel filtration
chromatography. The purified protein identified as glycoprotein by PAS test. By HPLC identification, its purity is 97.2%, named as ROGP-III,
after enzymolysis by PNGase F, it speculated that the polysaccharide content is about 17%.
Key words:  Oviducts Rana Glycoprotein Separation Purification Identification
得单一的林蛙输卵管糖蛋白是该研究方向的基础。
蛋白质的分离纯化方法较多，但都以蛋白质的
溶解性，分子大小，带电荷数，疏水性大小，对配
体的亲和特异性等差异作为理论基础进行分离［15-20］。
由于林蛙输卵管蛋白种类繁多，分子量分布较密集，
且大多为黏稠的糖蛋白，许多性质都较接近，因此
在其分离纯化过程中难度较高，需要多种方法结合
使用。在纯化策略上，整个分离纯化过程应该按照
分离精确度从低到高，得率从高到低的顺序进行，
以保证获得率最高，纯度最好的单一蛋白。因此，
本试验按照粗提后先后使用硫酸铵分级盐析，透析
袋透析，离子交换层析和 Sephadex G-75 凝胶过滤层
析的结合，分离纯化得到一种林蛙输卵管糖蛋白并
检测了纯度，酶法鉴定其糖基含量。
2014年第2期 103李稼晖等 ：长白山林蛙输卵管糖蛋白 ROGP-III 的分离纯化及鉴定
1 材料与设备
1.1 材料
1.1.1 原料与耗材 原料，长白山地区冬眠期雌性
林蛙（3-5 年龄）输卵管 ；柱料，DEAE Sepharose
CL-6B Fast Flow 17-0709-01，CM Sepharose CL-6B
Fast Flow 17-0719-01，Sephadex G-75 Superfine 17-
0051-01 ；透析袋，截留范围 6-8 kD。
1.1.2 试剂与仪器 试剂 ：考马斯亮蓝 R250，考
马 斯 亮 蓝 G250，Schiff 试 剂， 标 准 蛋 白 Marker，
PNGase F 购于 Sigma 生物公司 ；三羟甲基氨基甲烷、
丙稀酰胺、N，N 亚甲基双丙稀酰胺、过硫酸铵、
十二烷基硫酸钠、L-甘氨酸、硫酸铵、磷酸氢二钾、
磷酸二氢钾均为国产分析纯。
仪 器 ：蛋 白 层 析 仪 AKTA prime plus， 电 泳 仪
EPS 301， 低 速 离 心 机 LD5-2B， 高 速 低 温 离 心 机
FRESCO 17，手掌离心机 LX-100，pH 计 雷磁 PHS-
3C 分析天平 AUY220，真空抽滤机 AP-01P，金属浴
K20，真空冷冻干燥机 LGJ-18S。
1.2 方法
1.2.1 水溶性蛋白的分离 采取反复冻融法提取林
蛙输卵管水溶性蛋白，使用 Bradford 法测定蛋白含
量。经单因素试验及正交试验，确定最佳的方法
为 ：取排卵前林蛙输卵管组织用 0.7% 的盐水洗去蛙
血，剪成 1 cm 左右的小段，于 0.05 mol/L PBS 中浸
泡 12 h，使组织充分吸水膨胀，反复冻融破碎细胞
3 次后常温静置提取 50 min，离心取上清液。
1.2.2 单一蛋白的纯化
1.2.2.1 硫酸铵分级沉淀 使用固体硫酸铵粉末
沉淀粗蛋白，至溶液达到 35% 饱和度，充分搅拌
30 min，4 000 r/min 离心 30 min，取出上清继续加入
硫酸铵，使其达到 40% 饱和度，再次离心，以此类推，
直至不再出现沉淀，将不同饱和度沉淀的蛋白分装
收集。
1.2.2.2 透析 将沉淀蛋白用低浓度 Tris-HCl 缓冲
液复溶，装入截留范围为 6-8 kD 的透析袋，于十
倍体积的缓冲液中（pH 9.0 的 0.05 mol/L Tris-HCl）
透析除盐。重复透析 3-4 次，每次 6 h。重复富集
此步样品，用抽真空冷冻干燥剂冻干后-80℃保存
备用。
1.2.2.3 离子交换层析 用 Tris-HCl 缓冲液（0.02
mol/L，pH9.0）平衡 DEAE-Sepharose 阴离子交换柱
至蛋白层析仪显示基线平稳，用含 NaCl 浓度梯度
升高的 Tris-HCl 缓冲液分步洗脱，收集流穿峰和各
洗脱峰，浓缩后用 Tris-HCl 缓冲液（0.02 mol/L，pH
5.5）透析。再用 Tris-HCl 缓冲液（0.02 mol/L，pH 6.0）
平衡 CM Sepharose 阳离子交换柱，加入上一步中含
有目的蛋白的浓缩液，用平衡液作为流动相，收集
流穿峰。上样过程控制流速为 2 mL/min，洗脱过程
为 1 mL/min，下同。
1.2.2.4 凝胶过滤层析 将上一步获得的样品浓缩
并 透 析 调 整 pH 至 8.0， 通 过 用 PBS 缓 冲 液（0.05
mol/L，pH8.0）平衡的 Sephadex G-75 Superfine 凝胶
过滤柱，用含 0.02 mol/L NaCl 的 PBS 缓冲液（0.05
mol/L，pH8.0）洗脱，用自动收集器收集，记录管
号，并对每管中的样品进行蛋白组分和多糖组分测
定，蛋白直接测定 A280，多糖用苯酚-硫酸法处理后，
检测 A490。
1.2.3 纯 度 测 定 将 纯 化 后 的 样 品 过 膜 后 使 用
Agilent 1200 高效液相色谱分析其纯度，条件如下 ：
柱型号 ：ZORBAX 300SB-C18 ；检测波长 ：280 nm ；
进样量 ：20 μL ；流动相 ：10%-50% 乙腈 +0.02 mol/L
Tris-HCl+0.01 mol/L NaCl，pH 7.4 ；流速 ：1 mL/min ；
柱温 ：25℃。
1.2.4 ROGP-III 的糖含量测定 将获得的单一糖蛋
白调整浓度至 1 mg/mL，取 4 μL 样品与 4 μL1% 的
SDS 溶液混合，90℃加热 3 min，再按顺序加入 8 μL
200 mmol/L Hepes（pH8.6），8 μL3.3% 的 nonidet P-40，
3 μL PNGase F，37℃过夜，SDS-PAGE 鉴定。
2 结果与分析
2.1 林蛙输卵管蛋白粗提
在单因素基础上，对林蛙输卵管蛋白粗提取的
正交试验结果如表 1 表 2 所示（均为 4 g 组织）。
由表可知，最优条件为 A1B2C3D3，即 ：固液
比为 1∶4，浸泡时间为 12 h，反复冻融次数为 3 次，
提取时间为 50 min。
对粗提液进行 SDS-PAGE 电泳，分别考马斯亮
蓝 R-250 蛋白染色和高碘酸-Schiff 试剂糖染色，结
果如图 1 所示，林蛙输卵管蛋白多为糖蛋白。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期104
形成起着至关重要的作用，因此林蛙输卵管中对应
分子量大小的糖蛋白是否有相似的作用是值得研究
的。此外，量最高的 ROGP-I 及 ROGP-II 本实验室
均已做过研究并命名。因此，本研究将分子量约为
66 kD 的蛋白作为纯化的目的蛋白。
表 1 粗提正交试验因素水平表
水平
因素
A 固液比 B 反复冻融次数 C 浸泡时间（h） D 提取时间（min）
1 1∶4 2 4 30
2 1∶5 3 8 40
3 1∶6 4 12 50
表 2 正交试验结果
编号
因素
　蛋白质含量（mg）
A 固液比 B 反复冻融次数 C 浸泡时间（h） D 提取时间（min）
1 1 1 1 1 17.38
2 1 2 2 2 26.84
3 1 3 3 3 28.02
4 2 1 2 3 26.14
5 2 2 3 1 20.56
6 2 3 1 2 17.52
7 3 1 3 2 19.9
8 3 2 1 3 29.18
9 3 3 2 1 14.82
K1 72.24 63.42 52.76 64.08
K2 64.22 76.58 64.26 67.82
K3 63.9 60.36 83.34 68.48
k1 24.08 21.14 17.58 21.36
k2 21.42 25.52 21.42 22.62
k3 21.3 20.12 27.78 22.82
Rj 0.042 0.081 0.153 0.019
200
116
97.2
66.4
44.3
kD
1 2 3
1 ：Marker ；2 ：考马斯亮蓝 R-250 染色 ；3 ：高碘酸-Schiff 染色
图 1 林蛙输卵管粗蛋白提取液 SDS-PAGE 双染色对比图
2.2 林蛙输卵管糖蛋白的分离纯化
2.2.1 硫酸铵分级沉淀 由图 2 可知，随着硫酸铵
饱和度的提高，各种蛋白被沉淀分离出来的程度不
同，其中分子量约为 66 kD 的蛋白在硫酸铵饱和度
达到 60% 时才有显著沉淀，说明此蛋白的亲水性较
强，极有可能与其糖基的存在有关。有文献［21，22］
证实非洲爪蟾及中华大蟾蜍输卵管中，分子量约为
66 kD 的糖蛋白对其卵黄膜发育过程中受精通道的
1 2 3 4 5 6 7 8
44.3
29.0
66.4
ROGP-I
ⴞḷ㳻ⲭ
ROGP-II
97.2
kD
20.1
1 ：Marker ；2 ：原样 ；3 ：35% ；4 ：40% ；5 ：45% ；
6 ：50% ；7 ：55% ；8 ：60%
图 2 不同饱和度硫酸铵沉淀的蛋白 SDS-PAGE 电泳
2.2.2 阴离子交换层析 将含有目的蛋白的硫酸铵
沉淀复溶，经透析除盐后，用含不同浓度 NaCl 的缓
冲液洗脱图谱如图 3 所示，其中 P1 峰为流穿峰，P2
2014年第2期 105李稼晖等 ：长白山林蛙输卵管糖蛋白 ROGP-III 的分离纯化及鉴定
为 0.5 mol/L NaCl 洗脱，P3 为 1 mol/L NaCl 洗脱，P4
为 1.5 mol/L NaCl 洗脱。由 SDS-PAGE 电泳鉴定（图
4），目标蛋白主要存在 P4 峰中，目标蛋白在经过
DEAE-Sepharose 离子交换层析后纯度大幅度提高。
电泳分析（图 7），可以看出目的蛋白存在 P1 峰中，
结合图 1 可以确定该蛋白为糖蛋白。经高效液相色
谱法检测，其纯度为 97.2%，由此可知，目的蛋白
已经得到了良好的分离纯化，将其命名为 ROGP-III。
P1
P2
P3
P4
0
20
40
60
80
100
0 50 100 150
A
28
0Au

图 3 DEAE-Sepharose 离子交换层析图谱
ⴞḷ㳻ⲭ
1 2 3 4
29.0
66.4
44.3
97.2
kD
1 ：Marker ；2 ：原样 ；3 ：经 60% 饱和硫酸铵沉淀 ；
4 ：经 DEAE-Sepharose 离子交换层析
图 4 DEAE-Sepharose 离子交换层析后的 SDS-PAGE 电泳
2.2.3 阳离子交换层析 将上述样品浓缩透析后经
CM Sepharose 阳离子交换层析柱，收集流穿峰，浓
缩透析后 SDS-PAGE 电泳结果（图 5）显示，分子
量约为 112 kD 的杂蛋白基本被完全除去，44 kD 到
66 kD 之间的杂蛋白含量也显著降低。约 42 kD 的
杂蛋白含量仍较高，将进一步使用 Sephadex G-75
Superfine 进行纯化。
44.3
29.0
66.4
1 2
ⴞḷ㳻ⲭ
97.2
kD
1 ：Marker ；2 ：经 CM Sepharose 离子交换层析
图 5 CM Sepharose 阳离子交换层析后的 SDS-PAGE 电泳
P1
P2
0
0.1
0.2
0.3
0 20 40 60
㇑ਧ
A280
A490
੨ݹ
ᓖA
u
图 6 Sephadex G-75 洗脱曲线
97.2
66.4
44.3
29.0
kD
1 2 3 4
1 ：P1 峰浓缩液 ；2，3 ：原样 ；4 ：Marker
图 7 ROGP-III 纯品 SDS-PAGE 电泳
2.3 ROGP-III 的含糖量测定 将经过 PNGase F 处
理的纯品 ROGP-III 进行 SDS-PAGE 电泳（图 8），其
分子量由约 66 kD 下降至约 55 kD，由此初步认为其
糖链的分子量约为总分子量的 17%。
1 2 3
44.3
29.0
66.4
䞦䀓ਾ
97.2
kD
1 ：酶解前 ；2 ：Marker ；3 ：酶解后
图 8 酶解前后 ROGP-III 的 SDS-PAGE 电泳
2.2.4 葡聚糖凝胶过滤层析及糖蛋白鉴定 图 6 可
以看出，P1 的糖峰与蛋白峰重叠。P1 经 SDS-PAGE
3 结论
林蛙输卵管组织经反复冻融法粗提的总蛋白，
先 后 使 用 硫 酸 铵 分 级 盐 析， 透 析 袋 透 析，DEAE
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期106
Sepharose 阴离子交换层析，CM Sepharose 阳离子交
换层析，Sephadex G-75 凝胶过滤层析，获得了分子
量约为 66 kD 的单一蛋白 ROGP-III，经高碘酸-Schiff
试剂糖染色及凝胶过滤层析过程中苯酚-硫酸法测得
的糖与蛋白吸光度重叠峰鉴定为糖蛋白，经 HPLC
分析其纯度为 97.2%，酶法测定了其糖链含量约为
17%。
将进一步对其进行动物食用功能性试验，对受
精作用影响研究，N 端氨基酸测序以及氨基酸组分
测定，调取其基因并克隆表达，开展对林蛙油的分
子生物学研究。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）