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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
近几年来，我国畜牧业发展迅速，动物养殖规
模日益扩大，但由于我国耕地面积减少，用于生产
饲料的原料严重不足，加之对秸秆类植物的利用率
相对较低，养殖业和饲料生产的矛盾日益突出，这
些问题严重制约着我国畜牧业的发展。因此，发展
饲料工业以及加大对秸秆类植物饲料化的转化是目
收稿日期 ：2012-10-29
基金项目 ： 甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2010-05），甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（GNSW-2012-25），兰
州市攻关及产业化项目（2012-2-159），甘肃省科技支撑计划（1204NKCA103）
作者简介 ：何轶群，男，硕士研究生，研究方向 ：兽医微生物与免疫学 ；E-mail ：heyiqunsky@126.com
通讯作者 ：吴润，男，教授，博士生导师，研究方向 ：兽医微生物与免疫学 ；E-mail ：wurun@gsau.edu.cn
青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其
生物学特性研究
何轶群1  雷赵民2  吴润1  万学瑞1  刁小龙1  艾文娜1
（1. 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 ；2. 甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070）
摘 要 : 为筛选优良的青贮饲料添加剂，采用平板分离法从青贮饲料中分离乳酸菌，通过细菌形态学、生理生化特征鉴定
和 16S rRNA 基因序列分析相结合的方法对分离出的细菌进行鉴定。通过产酸性试验和抑菌试验对分离出来的 12 株乳酸菌进行筛选，
并对筛选出的 6 株乳酸菌进行生物学特性比较。结果显示，5 株为戊糖片球菌，4 株为植物乳杆菌，1 株为发酵乳杆菌，1 株为肠
系膜明串珠菌肠膜亚种，1 株为屎肠球菌 ；菌株 B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1、B5-2 的产酸能力和抑菌效果较好 ；菌株 B1-7 和
B5-2 生长最快，8 h 后进入稳定期，其余菌株 14 h 后进入稳定期 ；菌株 B1-7 在培养温度高于 45℃，培养基 pH>10 和含盐量 >0.08
g/mL 时不再生长，其余菌株均具有良好的抗逆性具备青贮潜力，可作为秸秆青贮的生物添加剂做进一步研究。
关键词 : 乳酸菌 16S rRNA 筛选 生物学特性
Isolation and Identification of Excellent Lactic Acid Bacteria from
Silage and Its Biological Characteristics Research
He Yiqun1 Lei Zhaomin2 Wu Run1 Wan Xuerui1 Diao Xiaolong1 Ai Wenna1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ；2. College of Animal Science and Technology，Gansu
Agricultural University，Lanzhou 730070）
Abstract:  To screen excellent microbials for silage additive usage, 12 bacteria strains were isolated from the silage. According to the
results of morphological observation, physiological and biochemical tests, and sequence analysis of the 16S rRNA gene of the strains isolated, 6
strains were screened and compared through acid yield tests and bacteriostatic tests. The results showed 5 strains were Pediococcus pentosaceus, 4
strains were Lactobacillus plantarum, 1 strain was Lactobacillus fermentum, 1 strain was Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, 1 strain
was Enterococcus faecium ；Strain B1-7 and B5-2 which reached a stable period after 8 h were fastest-growing, others were 14 h ；The B1-7 stain
no longer grow at temperature higher than 45℃ , medium pH>10, salinity>0.08 g/mL. Other stains could be used as bio-straw silage additives to
do further research which showed strong resistance and silage potential.
Key words:  Lactic acid bacteria 16S rRNA Screen Biological characteristics
前我国畜牧业迫切需要解决的问题。目前对秸秆类
粗饲料的加工处理主要有物理加工法、化学加工法
和微生物发酵法，其中以微生物发酵法中的青贮法
应用最为广泛。这是因为秸秆类植物经微生物青贮
发酵后具有柔软多汁、气味芳香、适口性好、原料
营养保留较多、胡萝卜素和蛋白质损失少、水分多
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期178
以及可长期保存等特点［1-3］。研究发现，青贮饲料
质量的好坏又同它所含有的乳酸菌有很大的关系，
但秸秆类植物表面附生的乳酸菌数往往较少，为改
善青贮饲料的营养品质，最行之有效的方法是添加
优质乳酸菌生物添加剂，使乳酸菌迅速成为青贮环
境的优势菌群，迅速降低青贮饲料的 pH 值，抑制
有害菌的生长，改善青贮饲料发酵品质、抑制二次
发酵，从而达到长期保存饲料营养物质的目的。并
且乳酸菌是动物胃肠道的益生菌群，代谢产生的有
机酸、细菌素、过氧化氢、双乙酰等多种天然抑菌
物质，具有维持肠道内菌群平衡，提高机体免疫力，
促进营养物质吸收等多种功能［4］。
青贮饲料中含有丰富的乳酸菌，包括肠球菌、
乳酸乳球菌、明串珠菌、链球菌和乳杆菌等，它们
在青贮饲料发酵中起重要作用。本试验旨在从青贮
饲料中分离生物学特性优良的乳酸菌，从而为青贮
饲料添加剂的研究和应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 青贮样品 玉米秸秆青贮饲料样品采自甘肃
省平凉、临洮、康乐等地青贮窑。样品采集后迅速
置于无菌自封袋中，4℃保存。
1.1.2 菌株及主要试剂 参考菌株 ：干酪乳杆菌
（Lactobaillus casei）、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactocaccus
lactis subsp. lactis）均由甘肃农业大学食品科学与
工程学院甘伯中教授惠赠 ；大肠杆菌（Escherichia
coli）、沙门菌（Salmonella）、蜡状芽胞杆菌（Bacillus
cereus）、金黄色葡萄球菌（Streptococcus aureus）、酵
母菌（Saccharomycetes）、青霉菌（Penicillium）、曲
霉菌（Aspergillus）、根霉菌（Rhizopus）、E. coli DH5α
均由本实验室保存 ；细菌基因组提取试剂盒购自北
京百泰克生物技术有限公司 ；糖微量发酵管购自青
岛海博生物科技有限公司 ；其它所需试剂均为进口
或国产分析纯产品。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离
1.2.1.1 样品采集处理 样品经四分法处理后，无
菌称取 25 g 加入 225 mL 灭菌生理盐水中，于 37℃
恒温摇床摇动 2 h 备用。
1.2.1.2 乳酸菌的分离 用无菌生理盐水稀释样品
溶液，取 10-3-10-5 三个稀释度，各稀释度取液体
0.1 mL 分别均匀涂布于含有 CaCO3 的 MRS 和 M17
培养基平板上，将平板置于厌氧培养盒后 37℃培养
72 h。
1.2.2 乳酸菌分离株的鉴定
1.2.2.1 乳酸菌分离株的初步鉴定 挑取溶钙圈较
明显的典型菌落，在 MRS 平板上反复划线得到单个
菌落，观察记录菌落形态，进行革兰氏染色镜检，
并做触酶试验。
1.2.2.2 乳酸菌生理生化鉴定 根据文献［5］中的
方法，对疑似乳酸杆菌做运动性、明胶液化、吲哚、
H2S 产生、硝酸盐还原和 pH4.5 生长试验。对于疑
似乳酸球菌还需要做精氨酸分解、葡萄糖产酸产气、
10℃和 45℃生长、pH9.6 生长和 6.5% NaCl 生长试验。
对所有菌株采用糖微量发酵管法进行糖发酵试验。
1.2.2.3 乳酸菌 16S rRNA 基因序列分析 参考已发
表的乳酸菌通用引物进行细菌 16S rRNA 基因扩增，
正 向 引 物 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3［6］；反
向 引 物 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3［7］。 以 上
引物由上海 Invitrogen 公司合成。细菌基因组 DNA
的提取严格按照试剂盒说明进行。PCR 扩增体系为
25 μL，上下游引物各 1 μL、模板 DNA 2 μL、预混
酶 12.5 μL、 水 8.5 μL。 反 应 条 件 ：95 ℃ 预 变 性 5
min；95℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃ 1.5 min，35 个循环；
72℃延伸 10 min，4℃保存。预计扩增片段长度约为
1 500 bp。将 PCR 产物回收后，连接 pMD18-T 载体
并转化 E. coli DH5α，经蓝白斑筛选为阳性克隆后送
上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序
结果在 GenBank 中进行 BLAST 分析。
1.2.3 优良乳酸菌的筛选
1.2.3.1 产酸性试验 将活化的乳酸菌分离株按 5%
量接入 MRS 液体培养基，每组设 3 个重复，置于
37℃恒温培养箱培养 30 h，每隔 2 h 无菌取样测 pH
值，记录结果。
1.2.3.2 抑菌试验 乳酸菌分离株发酵上清液抑菌
试验参照文献［8］进行。
1.2.4 乳酸菌生物学特性测定
1.2.4.1 乳酸菌生长曲线的测定 将活化的乳酸菌
按 5% 量接入 MRS 液体培养基，37℃恒温培养 30 h。
2013年第5期 179何轶群等 ：青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究
每隔 2 h 取样测各组菌液的 OD600nm 值，绘制生长曲
线图。
1.2.4.2 温度敏感试验 将活化的乳酸菌按 5% 量接
入 MRS 液体培养基后分别置于 37℃、40℃、45℃、
50℃、55℃、60℃温箱，每组设 3 个重复，恒温培
养 15 h，取样测各组菌液的 OD600nm 值，以培养温度
为横坐标，菌液 OD600nm 值为纵坐标制图。
1.2.4.3 耐盐性试验 将活化的乳酸菌按 5% 量分别
接入 NaCl 浓度为（0、0.02、0.04、0.06、0.08 和 1.0
g/mL）的 MRS 液体培养基中，每组设 3 个重复，37℃
恒温培养 15 h，取样测各组菌液的 OD600nm 值，以 Na-
Cl 浓度值为横坐标，菌液 OD600nm 值为纵坐标制图。
1.2.4.4 不同 pH 值生长试验 将活化的乳酸菌按
5% 量 分 别 接 入 pH 为 2、4、6、8 和 10 的 MRS 液
体培养基中，每组设 3 个重复，37℃恒温培养 15 h，
取样测各组菌液的 OD600nm 值，以 pH 值为横坐标，
菌液的 OD600nm 值为纵坐标制图。
2 结果
2.1 乳酸菌分离
从含有 CaCO3 的 MRS 和 M17 平板上挑取溶钙
圈直径 >4 mm 的菌落，在 MRS 平板上纯化后保存。
2.2 乳酸菌分离株鉴定
2.2.1 形态、染色及培养特性 在 MRS 培养基上出
现乳白色或灰白色、表面光滑、边缘整齐、大小不一
的圆形菌落，经革兰氏染色为阳性、无芽孢、触酶
试验阴性的初步鉴定为乳酸菌，共分离出 12 株细菌。
2.2.2 乳酸菌生理生化特性 参考菌株的各生理生
化试验均与标准相符，依据分离株的生理生化特性
（表 1- 表 3），结合形态和染色特征，12 株乳酸菌
分离株的运动性、明胶液化、吲哚形成、H2S 试验、
硝酸盐还原试验均为阴性，其中 B1-4、B2-7、B2-8、
B2-9、B3-1 的 pH4.5 生长试验为阳性，被鉴定为乳
杆菌属细菌，除 B1-4 外上述各菌株在糖发酵类型
上与植物乳杆菌非常相似可能为相同的种。B1-7 不
分解精氨酸，45℃、6.5% NaCl、pH9.6 生长试验均
为阴性，被鉴定为明串珠菌属，B1-3、B1-6、B2-3、
B4-5、B5-1、B5-2 的各生理生化试验结果非常相似，
但 B1-3、B1-6、B2-3、B4-5、B5-1 在 糖 发 酵 类 型
上更为相似，通过生理生化试验暂不能将以上菌株
鉴 定 到 属。B2-7、B2-8、B2-9、B3-1、B1-3、B2-3、
B4-5、B5-1、B5-2 利用葡萄糖只产酸不产气，为同
质型发酵乳酸菌，B1-4、B1-6、B1-7 利用葡萄糖产
酸产气，为异质型发酵乳酸菌。
表 1 乳酸杆菌生理生化特性
项目 干酪乳杆菌 B1-4 B2-7 B2-8 B2-9 B3-1
运动性 - - - - - -
明胶液化 - - - - - -
吲哚形成 - - - - - -
H2S 试验 - - - - - -
硝酸盐还原 - - - - - -
葡萄糖产酸 + + + + + +
葡萄糖产气 + + - - - -
pH4.5 生长试验 + + + + + +
＋ ：阳性 ；－ ：阴性
表 2 乳酸球菌生理生化特性
项目 乳酸乳球菌乳酸亚种 B1-3 B1-6 B1-7 B2-3 B4-5 B5-1 B5-2
运动性试验 - - - - - - - -
明胶液化 - - - - - - - -
吲哚形成 - - - - - - - -
H2S 试验 - - - - - - - -
硝酸盐还原 - - - - - - - -
精氨酸水解 + + + - + + + +
葡萄糖产酸 + + + + + + + +
葡萄糖产气 - - + + - - - -
10℃生长试验 + + + + + + + +
45℃生长试验 - + + - + + + +
pH9.6 生长试验 - + + - + + + +
6.5% NaCl 生长试验 - + + - + + + +
＋ ：阳性 ；－ ：阴性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期180
2.2.3 16S rRNA 基因序列特征 PCR 扩增产物经
12 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测，12 株分离乳酸菌在
1 500 bp 处出现特异性条带，与预期扩增大小一致说
明扩增成功。将各菌株的 16S rRNA 基因测序结果在
GenBank 中进行 BLAST 分析，各菌株与参考菌株的
同源性均达到 99%（表 4）。菌株 B1-3、B1-6、B2-3、
B4-5、B5-1 被鉴定为戊糖片球菌（Pediococcus pento-
saceus）、B2-7、B2-8、B2-9、B3-1 被鉴定为植物乳杆
菌（Lactobacillus plantarum）、B1-4 被鉴定为发酵乳
杆菌（Lactobacillus fermentum）、B1-7 被鉴定为肠系
膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides su-
bsp. mesenteroides）、B5-2 被鉴定为屎肠球菌（Enter-
ococcus faecium）。
2.3 优良乳酸菌的筛选
2.3.1 产酸性试验 由表 5 可见，菌株 B2-8 产酸最
表 3 乳酸菌糖发酵结果
项目 干酪乳杆菌 乳酸乳菌乳酸亚种 B1-3 B1-4 B1-6 B1-7 B2-3 B2-7 B2-8 B2-9 B3-1 B5-1 B4-5 B5-2
苦杏仁苷 + + + - + + + + + + + + + +
阿拉伯糖 - + + + + + + + + + + + + +
纤维二糖 + + + + + + + + + + + + + +
七叶苷 + + + - + + + + + + + + + +
果糖 + - - - - - - + + + + + - -
半乳糖 + + + + + + + + + + + + + +
葡萄糖 + + + + + + + + + + + + + +
乳糖 + + + - + + + + + + + + + +
麦芽糖 + + + + + + + + + + + + + +
甘露糖 + + + - + + + + + + + + + +
甘露醇 + + - - - + - + + + + - - +
松三糖 + - - - - - - + + + + - - -
蜜二糖 - - - - - + - + + + + - - +
棉籽糖 - - - - - + - + + + + - - +
水杨苷 + + - - + + + + + + + + + +
山梨醇 + - - - - - - + + + + - - -
蔗糖 + + - - - + - + - + + - - +
海藻糖 + + + + + - + + + - - + + +
木糖 - + - + + + - + + + + - + -
＋ ：阳性 ；－ ：阴性
表 4 分离菌株 16S rRNA 序列的 BLAST 分析结果
菌株 参照序列 同源性（%） BLAST 结果
B1-3 AB362605.1 99 Pediococcus pentosaceus
B1-4 AP008937.1 99 Lactobacillus fermentum
B1-6 AB362605.1 99 Pediococcus pentosaceus
B1-7 CP003101.1 100
Leuconostoc mesenteroides subsp.
mesenteroides
B2-3 AB362605.1 99 Pediococcus pentosaceus
B2-7 DQ141558.2 99 Lactobacillus plantarum
B2-8 FJ386491.1 99 Lactobacillus plantarum
B2-9 JX025073.1 99 Lactobacillus plantarum
B3-1 JX025073.1 99 Lactobacillus plantarum
B4-5 AB362605.1 99 Pediococcus pentosaceus
B5-1 AB362605.1 99 Pediococcus pentosaceus
B5-2 AY675247.1 100 Enterococcus faecium
表 5 乳酸菌分离株的产酸性（pH 值）
菌株
时间（h）
0 2 4 6 8 10 12 14 20 30
B1-3 6 4.7 4.5 3.9 3.5 3.5 3.5 3.5 3.0 3.0
B1-4 6 5.4 5.4 5.1 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8
B1-6 6 4.8 4.5 3.9 3.5 3.5 3.5 3.5 3.0 3.0
B1-7 6 5.2 5.1 5.1 4.8 4.4 4.1 3.8 3.8 3.5
B2-3 6 5.1 4.8 4.6 4.6 4.6 4.6 4.1 3.0 2.5
B2-7 6 4.8 4.8 4.6 4.6 4.6 4.6 4.1 3.0 2.5
B2-8 6 4.5 3.9 3.2 3.0 3.0 3.0 3.0 2.5 2.5
B2-9 6 4.9 4.8 4.1 3.8 3.5 3.0 3.0 3.0 2.5
B3-1 6 4.8 4.1 3.3 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
B4-5 6 5.0 4.6 4.1 3.8 3.8 3.5 3.5 3.0 3.0
B5-1 6 4.8 4.4 4.1 4.4 4.1 3.8 3.5 3.5 3.5
B5-2 6 5.2 4.7 4.5 3.8 3.8 3.8 3.5 3.5 3.5
2013年第5期 181何轶群等 ：青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究
快，接种 4 h 后 pH 降 4 以下，20 h 后降到 2.5 ；菌
株 B3-1、B1-6、B1-3 次之，分别于 6 h 后降到 4 以下，
20 h 后降到 3.0 ；菌株 B2-9、B4-5 接种 8 h 后 pH 下
降到 4 以下，20 h 后下降到 3.0。以上菌株显示了较
好的产酸能力，具有良好的青贮潜力。菌株 B1-7、
B2-3、B2-7、B4-5、B5-1、B5-2 产酸相对较慢，但
20 h 后降到 4 以下，也具有青贮潜能。
2.3.2 抑菌试验 抑菌试验结果由表 6 可以看出，
所有测试乳酸菌分离株上清液对霉菌均无抑制作用，
其中菌株 B3-1 抑菌谱宽，抑菌活性最佳，菌株 B2-3
和 B2-8 次之。B1-4、B2-9、B4-5、B5-2 对病原细菌、
霉菌、酵母菌均无抑制作用。
表 6 乳酸菌分离株上清液的抑菌效果（mm）
指示菌 B1-6 B1-7 B2-3 B2-7 B2-8 B3-1 B5-1 B5-2
金黄色葡萄球菌 11.38 11.63 13.03 11.18 13.06 12.47 10.72 11.59
蜡状芽胞杆菌 - - 10.63 - 9.98 10.89 - -
沙门菌 - - - - - 8.67 - -
大肠杆菌 - - 12.45 - 12.13 11.09 - -
酵母菌 18.03 - 18.04 18.04 19.42 19.87 18.48 15.14
青霉菌 - - - - - - - -
曲霉菌 - - - - - - - -
根霉菌 - - - - - - - -
- ：无抑菌作用
通过产酸性试验和抑菌试验结果，再结合考虑
青贮体系生物多样性和菌种自身特性，初步筛选出
B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1 和 B5-2 共 6 株优良
的乳酸菌，并进一步对其生物学特性进行比较。
2.4 优良乳酸菌生物学特性比较
2.4.1 生长曲线测定 由图 1 可知，菌株 B1-7 和
B5-2 适应期较短，在 2 h 后就进入对数期，生长速
度较快，8 h 后达到稳定期。其余各菌株的适应期较
长，4 h 后进入对数期，14 h 后进入稳定期。
1086420
0
0.2
0.4
0.6
O
D
60
0
0.8
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
1.0
12 14ᰦ䰤h16 18 20 22 24 26 28 30
B3-1
B2-8
B1-6
B2-3
B1-7
B5-2
图 1 乳酸菌分离株的生长曲线
2.4.2 温度敏感试验 由图 2 可知各菌株在培养温
度高于 55℃时基本不再生长。B3-1、B2-8、B1-6 和
B2-3 在培养温度为 50℃时 OD 值均较初始值高，说
明上述菌株具有较强的耐高温能力，B5-2 次之。菌
株 B1-7 对温度较为敏感在培养温度为 45℃时基本
不再生长。
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
O
D
60
0
0.6
0.4
0.2
B3-1 B2-8 B1-6 B2-4 B1-7 B5-2
0
ࡍ࿻٬
37ć
45ć
55ć50ć
60ć
图 2 乳酸菌分离株经不同温度培养 15 h 后的 OD600nm 值
2.4.3 耐盐性试验 由图 3 可知，随着 NaCl 浓度的
增高各菌株的生长也相应的减弱。B1-7 和 B5-2 在
NaCl 浓度为 0.08 g/mL 时基本不再生长，其余菌株
在 NaCl 浓度为 0.1 g/mL 时基本不再生长。B2-3 在
NaCl 浓度为 0.08 g/mL 时较初始值显著增高，说明
其具有较强的耐盐能力。
2.4.4 不同 pH 值生长试验 由图 4 可知培养基 pH
过高或过低均不利于菌株的生长。各菌株在培养基
pH 为 6 时 OD 值最大，说明 pH6 为各菌株的最佳培
养条件。B3-1、B2-8、B1-6、B2-3 和 B5-2 在 pH 为 4、
8、10 时 OD 值均较初始值高说明有较强的耐酸碱能
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期182
力，但 B1-7 在 pH 为 10 时基本不再生长。
3 讨论
秸秆类植物青贮过程中，其表面带有的乳酸菌
起到不可替代的作用，在青贮饲料中可能存在优良
的青贮用乳酸菌，且由于其附生于植物表面，更能
适应青贮环境。因此，从青贮饲料中分离筛选青贮
用优良乳酸菌是一条高效、快速的方法。对分离的
细菌在形态特征、培养特征和生理生化特征的基础
上，结合 16S rRNA 基因核苷酸序列分析方法，从基
因水平对其鉴定是目前较常用的一种方法［9，10］。本
研究首先通过传统鉴定方法将细菌鉴定到属，部分
细菌还可鉴定到种，最后通过 16S rRNA 基因序列分
析法对上述鉴定结果进行验证进一步说明了生化鉴
定的准确性，提高了细菌鉴定的准确率。
青贮时乳酸菌通过厌氧呼吸将青贮饲料中的碳
水化合物转化为有机酸，使青贮环境的 pH 值下降
到 3.8-4.2，抑制有害菌的生长，从而实现长期保存
饲料及其营养物质的目的［11］。因此作为饲料添加剂
的乳酸菌的产酸能力和产酸速度直接影响青贮品质。
通过产酸性试验对分离出的 12 株乳酸菌进行初步筛
选，菌株 B2-8 产酸能力最强，接种 4 h 后 pH 已降
到 4 以下，20 h 后降到 2.5，说明其能快速繁殖，创
造酸性环境，在青贮初期具有优势 ；除 B1-4 外其余
菌株接种 20 h 后 pH 值均能下降到 3.5 以下，也具
有良好的青贮潜能。
青贮时一些病原细菌、霉菌、酵母均可引起青
贮饲料的腐败变质，并且金黄色葡萄球菌引起的奶
牛乳房炎，大肠杆菌和沙门菌引起的畜禽肠道腹泻
等问题至今仍未很好解决。通过抑菌试验发现，所
分离的乳酸菌上清液对霉菌均无抑制作用，对金黄
色葡萄球菌的抑菌效果较为显著，其中菌株 B3-1 抑
菌谱宽，抑菌活性最佳，对供试病原细菌和酵母菌
均有较好的抑菌作用，菌株 B2-3 和 B2-8 次之。本
试验所分离的乳酸菌对于改变上述问题提供了新的
途径。目前关于乳酸菌的抑菌机制主要认为是以下
两方面 ：一是认为乳酸菌的代谢产物具有抑菌作
用［4］；二是乳酸菌通过伸出伪足状丝状物与小肠
上皮细胞结合，起占位作用，从而阻挡有害菌的侵
袭［12， 13］。关于乳酸菌的抗真菌机制 Anders 等认为
植物乳杆菌的代谢产物 3-羟基脂肪酸具有优良的抗
真菌能力。本试验中所分离出的植物乳杆菌发酵上
清液均无抑制真菌能力其原因还有待进一步的研究。
目前青贮饲料添加剂主要是同质型和异质型乳酸球
菌和杆菌的多菌混合应用，这是因为乳酸球菌和明
串珠菌在青贮前期迅速发酵，从而为乳酸杆菌的生
长提供有利条件。本研究所筛选出的 B1-7 和 B5-2
生长速度较快，2 h 后就进入对数期，8 h 后达到稳
定期，符合上述要求。在此之后，片球菌和乳酸杆
菌占主导地位，pH 值下降到 4.2 以下只有乳酸杆菌
大量繁殖，因此，筛选了 B2-3 和 B1-6 两株戊糖片
球菌以及 B2-8 和 B3-1 两株植物乳杆菌。同质型乳
酸菌和异质型乳酸菌混合应用主要是由于同质型发
酵乳酸菌主要生成乳酸，营养成分损失少，产酸多
且快，异质型乳酸菌除生成乳酸外还生成乙酸等有
机酸和气体，并产生热量，造成营养物质的损失，
但其产生的乙酸是一种比乳酸更有效的抗真菌及霉
菌的酸类物质［14-16］，更能有效防止青贮饲料二次发
酵和提高其有氧稳定性［17］。本试验所筛选出的 B1-6
和 B1-7 为异型发酵乳酸菌，其余为同型发酵乳酸菌。
青贮时适量的酵母可以使青贮饲料产生酒香味提高
ࡍ࿻٬
0 g/mL
0.02 g/mL
0.04 g/mL
0.06 g/mL
0.08 g/mL
0.1 g/mL
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
O
D
60
0
B3-1 B2-8 B1-6 B2-3 B1-7 B5-2
0
图 3 乳酸菌分离株在不同 NaCl 含量培养基中培养 15 h
后的 OD600nm 值
ࡍ࿻٬
pH2
pH4
pH6
pH8
pH10
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
O
D
60
0
B3-1 B2-8 B1-6 B2-3 B1-7 B5-2
0
图 4 乳酸菌分离株在不同 pH 培养基中培养 15 h
后的 OD600nm 值
2013年第5期 183何轶群等 ：青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究
了青贮饲料的适口性，但是当青贮饲料开窖后酵母
和氧气接触，大量繁殖并和乳酸菌竞争营养物质引
起二次发酵破坏青贮饲料的有氧稳定性［18］。筛选
的菌株除 B1-7 外其余菌株均对酵母有一定的抑制作
用，这对改变二次发酵问题提供了可能。
本试验筛出的 B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1
和 B5-2 共 6 株乳酸菌有乳酸球菌和乳酸杆菌，有同
质型乳酸菌和异质型乳酸菌，并且筛选出的 6 株乳
酸菌具有较好的产酸能力和抑菌能力，以及具有优
良的生物学特性和抗逆性，均为青贮用常见菌种，
这对制备优良的青贮饲料添加剂提供了可能，对于
各菌株之间如何搭配以及其添加剂量的确定还需要
在后续试验中做进一步的研究。
4 结论
本研究成功分离出 12 株乳酸菌，其中杆菌 5 株，
球菌 7 株。经鉴定植物乳杆菌 4 株、发酵乳杆菌 1
株、屎肠球菌 1 株、肠系膜明串珠菌肠膜亚种 1 株、
戊糖片球菌 5 株，其中菌株 B1-4、B1-6、B1-7 为异
型发酵乳酸菌，其余菌株为同型发酵乳酸菌。菌株
B1-6、B1-7、B2-3、B2-8、B3-1 和 B5-2 显示了较好
的产酸能力和抑菌能力，具有良好的青贮潜力。
参 考 文 献
［1］ Yang XX, Chen HZ, Gao HL, et al. Bioconversion of cornstraw
by coupling ensiling and solid state fermentation ［J］. Bioresour
Technology, 2001, 78（3）：277-280.
［2］ Weinberg ZG, Ashbell G, Chen Y. Stabilization of returned dairy
products by ensiling with straw and molasses for animal feeding ［J］.
Journal of Dairy Science, 2003, 86（4）：1325-1329.
［3］ Filya I. The effect of Lactobacillus buchneri and Lactobacillus
plantarum on the fermentation, aerobic stability, and ruminal
degradability of low dry matter corn and sorghum silages ［J］.
Journal of Dairy Science, 2003, 86（11）：3575-3581.
［4］ Schillinger U, Holzapfel WH. Guidelines for manuscripts on
bacteriocins of lactic acid bacteria ［J］. Journal Food Microbiology,
1996, 33（2-3）：3-5.
［5］ 凌代文 . 乳酸细菌分类鉴定及实验方法［M］. 北京 ：中国轻
工业出版社 , 1999 ：117-127.
［6］ Mora B, Fortina MG, Nicastro G, et al. Genotypic characterisation
of thermophilic bacilli ：a study on new soil isolates and several
reference strains ［J］. Reserch Microbiology, 1998, 149（10）：
711-722.
［7］ Jensen MA, Webster JA, Strauss N. Rapid identification of bacteria
on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA
spacer polymorphisms ［J］. Applied Polymerase Environmental
Microbiology, 1993, 59（4）：945-952.
［8］ Werner B, Schumann UB, Krebs A, et al. Rapid method for detection
of minimal bactericidal concentration of antibiotics ［J］. Journal of
Microbiological Methods, 2009, 77（1）：85-89.
［9］ Woo PC, Ng KH, Lau SK, et al. Usefulness of the Microseq
500 16S ribosomal DNA-based bacterial identification system
for identification of clinically significant bacterial isolates with
ambiguous biochemical profiles ［J］. Journal Clinical Microbiology,
2003, 41（5）：1996-2001.
［10］ Lau SK, Woo PC, Woo GK, et al. Catheter-related Microbacterium
bacteremia identified by 16S rRNA gene sequencing ［J］. Journal
Clinical Microbiology, 2002, 40（7）：2681-2685.
［11］ 温雅俐 , 高民 . 青贮饲料中乳酸菌代谢及其青贮品质影响研究
进展［J］. 畜牧与饲料科学 , 2010, 31（9）：15-17.
［12］ 林雪彦 , 牛钟相 . 动物消化道乳酸菌粘附机制及影响因素研究
进展［J］. 家畜生态学报 , 2003, 27（3）：109-111.
［13］ 程波财 , 魏华 . 乳酸菌与肠粘膜免疫［J］. 中国微生态学杂志 ,
2001, 13（5）：302-304.
［14］ Nishino N, Yoshida MH, Shiota E, et al. Accumulation of 1,
2-propanediol and enhancement of aerobic stability in whole crop
maize silage inoculated with Lactobacillus buchneri ［J］. Journal of
Applied Microbiology, 2003, 94（5）：800-807.
［15］ 张以芳 , 罗福成 , 刘旭川 . 微贮饲料添加剂及微贮饲料技术［J］.
草业科学 , 2006, 6 ：67-70.
［16］ Danner H, Holzer M, Mayrhuber E, et al. Acetic acid increases
stability of silage under aerobic conditions ［J］. Applied and
Environmental Microbiology, 2003, 69（1）：562-567.
［17］ 张晓庆 , 樊丽娟 . 不同发酵型乳酸菌在饲料青贮中应用的研究
进展［J］. 当代畜牧 , 2008, 5 ：24-25.
［18］ Driehuis F, Oude Elferink SJWH, Spoelstra SF. Anaerobic lactic
acid degradation during ensilage of whole crop maize inoculated
with Lactobacillus buchneri inhibits yeast growth and improves
aerobic stability ［J］. Journal of Applied Microbiology, 1999, 87
（4）：583-594.
（责任编辑 马鑫）