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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):207-213
壳寡糖溶解度大，易于被人体吸收利用，且具
有抗肿瘤、抗菌免疫激活及保湿吸湿等许多生理活
性，在医药、保健品方面的应用令人瞩目［1-3］。目
前，壳寡糖的制备来自于壳聚糖的降解，主要有化
学降解法、物理降解法和酶降解法［4，5］。其中酶降
解法由于反应条件温和易控，寡糖得率高、功能性
更强及不易造成环境污染等优点，是壳寡糖制备的
主要方法［6，7］。壳聚糖酶（Chitosanase，EC 3.2.1.99）
对壳聚糖具有专一性，获得的寡糖分子量范围较
窄，功能性更强，是最理想的壳寡糖制备酶［7］。但
目前由于壳聚糖酶产量低，商品价格昂贵，无法用
于大规模生产。研究发现许多水解酶如蛋白酶、果
胶酶、溶菌酶及脂肪酶等多种常见工业酶制剂对壳
聚糖有降解作用［8-11］。国内外的学者对于不同来源
收稿日期 ：2015-03-02
作者简介 ：阎贺静，女，博士，研究方向 ：工业酶制剂的生产及应用 ；E-mail ：yhj2203yhj@163.com
曲霉固液态发酵产壳聚糖降解酶组分及酶学特性分析
阎贺静  时月  刘畅 
（河北科技师范学院 食品科技学院，昌黎 066600）
摘 要 ： 以壳聚糖酶产生菌——曲霉为出发菌株进行固液态发酵，旨在比较其产物酶组分和酶学性质。结果表明固态发酵
产酶组分复杂，除具有壳聚糖降解活性外，还具有多种常见水解酶酶活如蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等 ；液态发酵所得酶组分较
简单，不仅具有较大壳聚糖降解活性，还表现出少量蛋白酶和纤维素酶活性。固液态发酵产物酶学性质不同，最适反应温度分别
为 45℃和 40℃，适宜温度分别为 40-55℃和 35-40℃，分别在 40-50℃和 30℃稳定性较高 ；最适反应 pH 分别为 5.8 和 5.2，分别
在 pH4.6-6.4 和 pH4.6-5.8 范围内具有较高活性，在 pH4.6 和 pH5.2 时稳定性最高。由此说明，固液态发酵产酶组分和相关酶学性
质不同，在工业应用中有不同的作用表现。
关键词 ： 曲霉 ；固态发酵 ；液态发酵 ；壳聚糖降解酶
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.027
Comparative Study of Chitosan Degradation Enzymes from
Aspergillus sp. in Solid-State and Liquid-State Fermentation
Yan Hejing Shi Yue Liu Chang
（College of Food Science and Technology of Hebei Normal University of Science and Technology，Changli 066600）
Abstract: Aspergillus sp. was cultured in solid and liquid fermentation condition respectively, enzyme production from which was studied.
The results showed that solid-state fermentation produced more enzyme components than liquid state fermentation did. Enzyme preparation
from solid state fermentation showed many kinds of hydrolytic enzyme activity like that of protease, cellulase, pectinase, amylase, lipase and
hemcellulase beside to chitosan degradation activity, and enzyme preparation from liquid fermentation showed weak protease and cellulase
activity beside to chitosan degradation activity. The optimal temperature for chitosan degradation of these two enzyme preparation was 45℃
and 40℃, and they showed high chitosan degradation activity at 40-55℃ and 35-40℃, respectively. Furthermore, the optimal pH of them was
pH5.8 and pH5.2, and they showed high chitosan degradation activity at pH4.6-6.4 and pH4.6-5.8, respectively. These results indicated that
Aspergillus sp. could produce different enzymes with different characteristics in solid and liquid state fermentation conditions. Thus solid state
fermentation can be used to produce enzymes with chitosan degradation activities.
Key words: Aspergillus sp. ；solid-state fermentation ；liquid-state fermentation ；chitosan degradation enzymes
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11208
的多种非专一性酶对壳聚糖的降解特性及产物特征
等进行了研究发现，效果较为显著的酶主要有来自
Trichoderma viride 及 Aspergillus niger 的纤维素酶、来
自 Aspergillus oryzae 的半纤维素酶、来自 Aspergillus
niger 的果胶酶，以及来自 Aspergillus niger 的真菌蛋
白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、
胃蛋白酶和溶菌酶等［12，13］。还有学者将几种非专一
性降解酶如纤维素酶、蛋白酶和 α-淀粉酶共同作用
于壳聚糖发现，这些酶水解壳聚糖具有协同作用［14］。
多项研究表明，将这些酶复配后用于壳聚糖的降解，
其水解作用比单一酶强，用于壳寡糖的制备效果更
佳，可以得到相对分子质量低于 3 000 的低聚糖［9-11］。
因此，开发和制备壳聚糖降解复合酶制剂对于壳寡
糖的制备很有必要。
目前，关于复合酶对壳聚糖的酶解的研究多
集中于酶的种类、复配和降解效果及相关工艺等方
面［9，14-16］，而关于壳聚糖降解用复合酶制剂生产方
面的报道较少。固态发酵具有酶系全、活性高及生
产成本低等优势，随着固态发酵技术的发展，固态
发酵已广泛应用于食品、饲料及洗涤剂等工业用酶
的生产［17-20］。因此，在确保菌种优良和合适的培养
条件下，应用固态发酵技术生产含有多种酶（如纤
维素酶、果胶酶、半纤维素酶及淀粉酶）活性的壳
聚糖非专一性降解酶制剂复合物是可行的，这很有
可能为壳聚糖降解复合酶的开发提供一种新途径。
本研究以一株产壳聚糖降解酶的生产菌——曲
霉为出发菌株，对其进行固和液态发酵，对两种发
酵粗酶产物的组分及酶学特性进行对比和分析，并
对其相关因素进行进一步分析，确定固态发酵在生
产壳聚糖降解酶复合酶制剂方面的优势，旨为高效
壳聚糖降解复合酶制剂的开发提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株 ：曲霉（壳聚糖酶生产菌）由武汉生物工
程学院酶工程实验室提供（此菌为实验室新筛选保
藏菌种，尚未取得菌种保藏编号）。
斜 面 种 子 培 养 基（g/L）：胶 体 壳 聚 糖 1.0，
（NH4）2SO4 0.5，酵母膏 0.5，K2HPO4 0.07，KH2PO4
0.03，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，葡萄糖 0.1，自
然 pH。液体发酵培养基（g/L）：胶体壳聚糖 1.0，
（NH4）2SO4 0.5，酵母膏 0.5，K2HPO4 0.07，KH2PO4
0.03，NaCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.05，葡萄糖 0.1，自
然 pH。固态发酵培养基（g/L）：营养液 ：MgSO4 0.5、
K2HPO4 0.5、KCl 0.5、FeSO4·7H2O 0.01、ZnSO4 0.1，
壳聚糖 4.0，自然 pH。麸皮 ：豆饼粉 =35，料水
比 89。
1.2 方法
1.2.1 曲霉液态发酵及粗酶液的制备 取培养成
熟（培养 2 d）的斜面孢子制备菌悬液，接种量（体
积分数）为 0.2，装液量 75 mL/250 mL，180 r/min，
32℃恒温培养 9 d，每天取样，将发酵液用布氏漏斗
（6-7 层滤纸）进行抽滤和微滤得粗酶液，以壳聚糖
为底物测壳聚糖降解酶酶活。
1.2.2 曲霉固态发酵粗酶液的制备 取培养成熟
（培养 2 d）的斜面孢子制备菌悬液，接种量 1 mL，
30℃恒温培养 15 d，每天取样，及时将固体曲研碎，
按固体曲重量的 10 倍加入浸提液（pH5.0 的醋酸 -
醋酸钠缓冲液），浸提 1 h，离心得粗酶液，以壳聚
糖为底物测壳聚糖降解酶酶活。固态发酵产酶量以
1 g 固体曲重所含酶活计算。
1.2.3 酶活测定 壳聚糖降解酶酶活的测定 ：以 1%
胶体壳聚糖为底物，采用 DNS 法［14］测定。酶活单
位定义为 ：在测定条件下（pH5.6，50℃准确反应
15 min），每分钟水解底物生成 1 μmol 还原糖所需的
酶量定义为一个酶活力单位，单位为 U/mL。果胶酶
酶活测定，以多聚半乳糖醛酸为底物，采用 DNS 试
剂测定［21］。酶活力单位定义：在测定条件下（pH5.6，
50℃准确反应 30 min），每分钟水解底物生成 1 μmol
半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活力单位，单
位为 U/mL。纤维素酶酶活测定，以羧甲基纤维素钠
为底物，按 Bailey 和 Nevalainen［22］的方法测定。酶
活力单位定义 ：在测定条件下（pH5.6，50℃准确反
应 30 min），每分钟催化底物生成 1 μmol 葡萄糖所
需的酶量定义为一个酶活力单位，单位为 U/mL。蛋
白酶酶活测定，以酪蛋白为底物，采用福林 - 酚法。
酶活力单位定义 ：测定条件下（pH5.6，50℃准确反
应 10 min），每分钟催化底物生成 1 μmol 酪氨酸所
需的酶量定义为一个单位，单位为 U/mL。淀粉酶酶
2015,31(11) 209阎贺静等 ：曲霉固液态发酵产壳聚糖降解酶组分及酶学特性分析
活测定，以可溶性淀粉为底物，采用 DNS 法测定。
酶活力单位定义 ：在测定条件下（pH5.6，50℃准确
反应 15 min），每分钟催化底物生成 1 μmol 葡萄糖
所需的酶量定义为一个单位，单位为 U/mL。脂肪酶
酶活测定，以甘油三酯为底物，参照国家标准进行
滴定。酶活力单位定义 ：在测定条件下，每分钟催
化底物生成 1 μmol 的可滴定的脂肪酸即为一个酶活
力单位，单位为 U/mL。
1.2.4 固液态发酵产壳聚糖降解酶的最适反应温度
及温度稳定性 以 1% 胶体壳聚糖为底物，在不同
温度（30、35、40、45、50、55 和 60℃）条件下测
两种粗酶液的壳聚糖降解酶酶活，以活力最高者为
100%，确定两种酶制剂的最适反应温度 ；将酶液在
不同温度（30、35、40、45、50、55℃和 60℃）条
件下分别保温一定时间（30、60、90、120 和 150
min）后，在最适条件下测定两种酶制剂的壳聚糖降
解酶酶活，以未进行保温的酶液的酶活为 100% 计
算相对酶活力，确定测试酶的温度稳定性。
1.2.5 固液态发酵产壳聚糖降解酶的最适反应 pH
及酸碱稳定性 以 1% 胶体壳聚糖为底物，在不同
pH（4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0 和 7.6）条件下测
两种酶制剂的壳聚糖降解酶酶活，以活力最高者为
100%，确定两种酶制剂的最适反应 pH ；将酶液在
不同 pH（4.0、4.6、5.2、5.8、6.4、7.0 和 7.6）件下
分别保存一定时间（30、60、90、120 和 150 min）后，
在最适条件下测定两种酶制剂的壳聚糖降解酶酶活，
以在不同 pH 条件下保存前的酶活为 100%，确定两
种酶制剂的酸碱稳定性。
2 结果
2.1 曲霉固液态发酵产酶过程分析
本实验对曲霉进行固液态发酵，结果（图 1）
表明，两种发酵过程的发酵趋势基本一致，随发酵
的进行，酶液的壳聚糖降解活力先增加后减少。但
同时发现两者的发酵速度有很大不同，其中液态发
酵较固态发酵提前 4 d 到达产酶高峰期。发酵结束后，
测定固液态发酵粗酶酶活，分别为 10.33 U/g（固体曲）
和 4.85 U/mL（发酵液）。
对图 1 进行综合分析认为，固态发酵的营养物
质结构致密，成分复杂不易吸收，微生物生长周期
长，利于酶的积累，由此体现出固态发酵的优势。
液态发酵后期酶活会迅速降低，说明该壳聚糖降解
酶在此状态下稳定性较差。因此，应正确把握液态
发酵结束时间，否则酶活损失较大。
2.2 曲霉固液态发酵产酶组分比较
对获得的粗酶液进行稀释或浓缩，使两种粗酶
液以壳聚糖为底物的酶活相等，测定固液态发酵酶
产物的各种酶酶活，结果见表 1。
表 1 曲霉固液态发酵产酶组分
酶 固态发酵 /（U·g-1） 液态发酵 /（U·mL-1）
壳聚糖降解酶 2.37 2.41
蛋白酶 0.27 0.08
纤维素酶 0.39 0.20
果胶酶 0.63 0.00
淀粉酶 0.47 0.00
脂肪酶 0.32 0.00
半纤维素酶 0.55 0.00
由表 1 可见，该曲霉固液态发酵产酶酶活均以
壳聚糖降解活性为主。但固态发酵粗酶同时具有多
种常见糖苷酶，如纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、脂
肪酶和半纤维素酶酶活。对曲霉液态发酵产酶进行
分析发现，该酶具有较高壳聚糖降解活性，同时具
有相对较高的纤维素酶酶活和较低的蛋白酶酶活，
不含有脂肪酶和淀粉酶酶活。因此推测有两种可能：
（1）该曲霉在液态发酵中所产酶可能为具有纤维素
酶活的专一性壳聚糖酶（EC 3.2.199）；（2）也可能
该曲霉同时分泌了专一性壳聚糖酶（EC 3.2.199）和
10
8
6䞦⍫U·mLˈU·g-1  4
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9ᰦ䰤/d10 11 12 13 14 15 16 17പᘱਁ䞥⏢ᘱਁ䞥
图 1 曲霉固液态发酵产壳聚糖降解酶过程曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11210
纤维素酶。
以上分析表明，本研究所用曲霉在液态发酵条
件下分泌酶组分较单一，在固态发酵时可以分泌多
种具有壳聚糖降解活性的酶。
2.3 烟曲霉固液态发酵产壳聚糖降解酶酶学性质
2.3.1 固液态发酵产壳聚糖降解酶的最适反应温
度 分别在不同温度下测定不同来源的壳聚糖降解
酶的活力，以活力最高者为 100% 对照，确定酶的
最适反应温度，结果如图 2 所示。固液态发酵产壳
聚糖降解酶最适反应温度分别为 45℃和 40℃。并且，
固态发酵壳聚糖降解酶具有较宽泛的温度适宜范围，
在 40-55℃之间均具有较高的酶活，液态发酵壳聚
糖降解酶在 35-40℃之间的活性较高。这可能跟固
态发酵酶组分比较复杂有关，不同的酶在自身适宜
的温度条件下分别表现出较高酶活。
应 pH 进行考察，结果如图 4 和图 5 所示。
由图 4 所示，固液态发酵壳聚糖降解酶最适反
应 pH 分别为 5.8 和 5.2，由此可见两者的最适反应
pH 差异不大。但固态发酵产酶在 pH4.6-6.4 范围内
100
液态发酵
固态发酵
110
80
70
90
60⴨ሩ⍫࣋%
50
40
30
25 30 35 40 45⑙ᓖć 50 55 60 65
图 2 温度对固液态发酵壳聚糖降解酶酶活性的影响
100
110 30ć
35ć
40ć
50ć
60ć45ć55ć80709060⴨ሩ⍫࣋% 5040
30
20
10
0
0 30 60 90
固态发酵时间min 120 150 180
100
110
30ć
35ć
40ć
50ć
60ć45ć55ć80709060⴨ሩ⍫࣋% 5040
30
20
10
0
0 30 60 90
液态发酵时间min120 150 180
图 3 固液态发酵产壳聚糖降解酶温度稳定性
固态发酵
100
110
80
70
90
60⴨ሩ⍫࣋% 5040
30
20
10
0
3.5 4.54.0 5.0 6.56.05.5
液态发酵
pH
7.0 7.5 8.0
图 4 pH 对固液态发酵产壳聚糖降解酶酶活性的影响
2.3.2 固 液 态 发 酵 产 壳 聚 糖 降 解 酶 的 温 度 稳 定
性 考察测试样品的温度稳性，结果如图 3 所示。
固态发酵壳聚糖降解酶热稳定性高于液体发酵壳聚
糖降解酶。液体发酵壳聚糖酶在 30℃时稳定性最高，
保温 150 min 后仍维持原酶活的 64.5%。随着温度的
增加，酶的稳定性迅速下降，50℃时保温 150 min，
残余酶活仅为 13.4%。固态发酵壳聚糖降解酶在 40-
50℃范围之内均具有较高的稳定性，50℃保温 150
min 后维持原酶活的 58.3% 左右，这可能和其复杂
的酶组分有关。
2.3.3 固液态发酵产壳聚糖降解酶的最适反应 pH
和酸碱稳定性 对固液态发酵壳聚糖降解酶最适反
2015,31(11) 211阎贺静等 ：曲霉固液态发酵产壳聚糖降解酶组分及酶学特性分析
3 讨论
目前，深层液体发酵已成为主要的工业酶制剂
生产方法。但随着对固态发酵研究的深入，人们发
现固态发酵具有液体发酵无法比拟的优势。例如，
原材料廉价、目的产物浓度高、废水废渣少等。固
态发酵培养基成分复杂，微生物需要代谢各种酶类
来为细胞的生长和代谢提供能源［17，18］，这为复合酶
制剂的开发提供了便捷而廉价的方法。
本研究以壳聚糖酶生产菌——曲霉为出发菌
进行研究，期望通过比较固液态发酵产物的组分及
酶学特性发现对壳聚糖降解复合酶生产有价值的信
息。结果表明，在固态发酵情况下，该曲霉产酶组
分更加复杂，壳聚糖降解酶稳定性更强，温度和
pH 适用范围更广，这一点符合固态发酵产物的特
性，固态发酵酶的酶学特性更加符合工业应用的要
求。因此，专一性壳聚糖酶（EC 3.2.199）生产菌的
筛选需要更加科学的方法，传统的以壳聚糖为唯一
碳源的普通平板筛选法可能仅适合于壳聚糖降解酶
生产菌的筛选。固态发酵壳聚糖降解酶热稳定性高
于液态的，这一特点在壳寡糖工业制备中的应用较
液态的发酵壳聚糖降解酶更具优势和潜力。更加值
得注意的是，固态发酵产物中含有纤维素酶、蛋白
酶、淀粉酶及果胶酶等是壳聚糖降解的主要的非专
一性酶［8-11］，这为壳聚糖降解酶的生产开发提供了
新的思路。目前有关壳聚糖酶的生产研究大多都集
中在菌种基因工程菌的构建、发酵条件的优化和控
制方面［23-25］；对壳聚糖降解的应用研究主要集中在
将各种单一酶进行复配，考察其降解效果和条件方
面［8-11］，而忽略了固态发酵本身可以提供廉价复合
酶这一特点。当然，若要利用固态发酵制备有效的
壳聚糖降解酶，需要做的工作还很多。例如，首先
需要有高效的生产菌种 ；其次还需要对其培养条件、
底物种类及产物特性进行广泛的研究等，还需要更
深入的研究揭示微生物固态发酵产酶种类及其含量
的影响因素及相关的机理等。因此，还需要进行大
量的研究探索。
利用固态发酵可获得多组分壳聚糖降解酶，是
获得复合酶组分的有效方法。培养基组分对微生物
产酶包括酶组分、含量和特性等具有很大影响，若
系统考察固态发酵培养基对烟曲霉产酶的影响，或
活性较高，而液态发酵产酶在 pH4.6-5.8 范围内活
性较高，其 pH 适宜范围略窄于固态发酵来源的壳
聚糖降解酶。壳聚糖溶于弱酸，碱性不溶，由此可
见两种来源的壳聚糖降解酶最适反应 pH 与壳聚糖
的降解环境 pH 较为一致。
考察酶的酸碱稳定性，可以为酶催化反应体系
与反应时间的设定提供依据，提高降解效果。由图
5 可知，固液态发酵产壳聚糖降解酶在相同的酸碱
度范围内具有相似的稳定性，在 pH4.6-6.4 范围内
均较稳定，分别在 pH4.6 和 pH5.2 时稳定性最高，
环境 pH>6.4 或 pH≤4.0 时酶活迅速降低。固态发酵
壳聚糖降解酶的酸碱稳定性略高于液态发酵壳聚糖
降解酶。例如，在 pH4.6 环境中保存 60、90、120
和 150 min 后，固液态壳聚糖降解酶分别保留原酶
活的 91.11% 和 80.1%、85.5% 和 60.24%、73.1% 和
42.9%、60.1% 和 29.3%。
100
110
80
70
90
60⴨ሩ⍫࣋% 5040
30
20
10
0
0 30 60 12090
pH7.6
pH7.0
pH4.0
pH6.4
pH5.8
pH5.2
pH4.6
固态发酵ᰦ䰤min 150 180
100
110
80
70
90
60⴨ሩ⍫࣋% 5040
30
20
10
0
0 30 60 12090
pH7.6
pH7.0
pH4.0
pH6.4
pH5.8
pH5.2
pH4.6
液态发酵ᰦ䰤min 150 180
图 5 固液态发酵产壳聚糖降解酶的酸碱稳定性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11212
许能获得具有特定配比及适合应用要求的复合酶制
剂。但若通过此法开发满足壳寡糖工业生产所需的
复合酶制剂还需要进行系统和深入的研究。由于研
究手段的限制，本研究未能进一步确认各酶酶活所
对应的具体酶的种类、蛋白结构等信息 ；同时也未
能探讨不同的固态发酵培养基底物对所得复合酶组
分和酶学性质的影响。只是对固液态发酵酶组分及
其基本酶学性质进行了简单的研究，得出了固态发
酵产壳聚糖降解酶可应用于壳聚糖降解的有利信息，
但还未考察固态发酵产壳聚糖降解酶在壳聚糖降解
方面的应用情况，此方面的研究有待进一步进行，
以确认固态发酵产复合酶对壳聚糖降解的具体作用。
4 结论
固液态发酵具有相同的发酵趋势，但发酵周期
不同。固态发酵产壳聚糖降解酶产酶高峰期出现在
发酵第 9 天，比液态发酵产酶高峰期延迟 4 d。
固态发酵所得酶组分复杂，除具有壳聚糖降解
活性外，还具有蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、
脂肪酶和半纤维素酶活 ；液态发酵所得酶组分较单
一，除壳聚糖降解活性外，还表现出较小的蛋白酶
酶活和纤维素酶酶活。
固液态发酵所产酶最适反应温度分别为 45℃和
35℃，适宜温度分别 40-55℃和 35-40℃。固态发
酵产酶较液态产酶具有更加宽泛的适宜范围，两者
分别在 40-50℃和 30℃时稳定性最高，50℃时保温
150 min，残余酶活分别为 62.5% 和 13.4%。
固液态发酵产酶的最适反应 pH 分别为 5.8 和
5.2，分别在 pH4.6-6.4 和 pH4.6-5.8 具有较高活性 ；
两者在 pH4.6-6.4 范围内均较稳定，分别在 pH4.6
和 pH5.2 时稳定性最高。在 pH4.6 和 pH5.2 环境中
保存 150 min，固液态壳聚糖降解酶分别保留原酶活
的 60.1% 和 29.37% 以及 45.1% 和 39.1%。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）